Apostila de aulas práticas

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Unidade 02 – AULAS PRÁTICAS 
BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO CIENTÍFICO 
 
Objetivos: 
 
 Compreensão de que um Laboratório de Pesquisa / Aula Prática é um local que 
necessariamente não é perigoso desde que precauções sejam tomadas. 
 Fazer o estudante entender que qualquer usuário de um Laboratório Científico deve ter 
responsabilidade no seu trabalho e evitar atitudes que possam acarretar em acidentes e 
possíveis danos para si e os demais. 
 
Introdução: 
 
 Os Laboratórios de Pesquisa são idealizados no imaginário popular como um lugar habitado 
por pessoas excêntricas vestindo seus jalecos brancos em um ambiente rodeado de maquinário 
tecnológico de ponta e vidros recheados de líquidos coloridos e esfumaçantes. Mesmo os acidentes 
são romantizados em quadrinhos, livros ou filmes. Casos famosos como o cientista Banner, que ao 
ser bombardeado por radiação gama se torna o Hulk, ou o perito forense Barry Allen, que ao sofrer 
um banho químico e ser atingido por um raio adquire super-velocidade. 
Na vida real, a cientista Marie Curie faleceu devida à leucemia adquirida pela exposição 
prolongada à radiação de tubos contendo o elemento “rádio”, que ela costumava carregar nos bolsos 
durante a pesquisa, e pela montagem de aparelhos de raios-x nas unidades médicas móveis durante 
a Primeira Guerra Mundial. No mundo da química, existem mais de 21 milhões de substâncias 
conhecidas (naturais ou criadas pelo homem), das quais 100.000 são comercializadas. Destas, 
70.000 são utilizadas no nosso cotidiano e a cada ano 2.000 novas substâncias são introduzidas no 
mercado. O dado alarmante é que em apenas 6.000 substâncias foram realizados algum teste de 
toxicidade. No campo da biologia, inúmeros patógenos com potencial risco para a saúde humana 
ainda são desconhecidos. O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), responsável pela morte de 
mais de 36 milhões de pessoas, foi “descoberto” apenas na década de 80. Estudos apontam que esse 
vírus circula na população humana há mais de cem anos. Já o Vírus da Hepatite C (HCV), 
responsável por 700 mil mortes anuais, também descoberto na década de 80, parece estar circulando 
na população humana há séculos. 
Desta maneira, o laboratório pode ser considerado um ambiente complexo (composto por 
pessoas, produtos químicos e/ou biológicos, equipamentos, vidraria, papéis, etc.), com potencial de 
ocorrência de acidentes. Um profissional ao abrir um frasco de reagente químico ou ao analisar 
amostras biológicas poderá se contaminar através do contato com pele, pela respiração ou via oral. 
Dependendo da exposição, os efeitos na saúde do profissional serão sentidos apenas ao longo do 
tempo. Equipamentos, procedimentos e normas específicas para esse tipo de ambiente de trabalho 
vêm sendo aprimorados ao longo das décadas. Nesta segunda unidade abordaremos as regras 
universais de Boas Práticas em Laboratório Científico. 
 
Conceitos: 
 
 LABORATÓRIO: Um Laboratório de Pesquisa Científica é a sala ou o espaço físico 
equipado com instrumentos para a realização de análises, simulações, predições e/ou experimentos 
em acordo com o Método Científico (Unidade 2). Os equipamentos, produtos químicos e 
biológicos, assim como os riscos variam de acordo com o tipo de Laboratório. 
 ACIDENTES: é um evento inesperado que causa danos pessoais, materiais (danos ao 
patrimônio), danos financeiros e que ocorre de modo não intencional. Entretanto os acidentes, em 
geral, não acontecem, eles são causados. 
 
 O SEU ACIDENTE PODE SER O ÚLTIMO! 
Os acidentes em Laboratório têm como causas principais quatro fatores: 
 Atitude indiferente ou desatenta; 
 Ausência de senso comum; 
 Falha no cumprimento das instruções; 
 Pressa excessiva e/ou estresse. 
 
 BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO: conjunto de normas e procedimentos de 
segurança que visam minimizar ou evitar os acidentes de Laboratório. 
 SEGURANÇA: O termo “segurança” abrange variados significados. Em linhas gerais, pode-
se afirmar que este conceito refere-se à qualidade daquilo que é seguro, ou seja, aquilo que está ao 
abrigo de quaisquer perigos, danos ou riscos. Quando se diz que algo é seguro, significa que é algo 
certo, firme, estável e indubitável. A Segurança no Laboratório é uma responsabilidade coletiva que 
requer a cooperação de todos os indivíduos do laboratório. Não basta apenas que uma pessoa ou 
algumas pessoas sigam as Boas Práticas de Laboratório. Para tornar o ambiente verdadeiramente 
seguro, todos (professores, técnicos e estudantes) devem seguir as Boas Práticas! 
 
 NENHUM TRABALHO É TÃO IMPORTANTE E TÃO URGENTE, QUE NÃO 
POSSA SER PLANEJADO E EXECUTADO COM SEGURANÇA! 
 
 
Regras Universais de Boas Práticas em Laboratórios de Pesquisas: 
Aulas Práticas 
 
 O uso de jaleco é sempre OBRIGATÓRIO no ambiente de trabalho. 
 
 Dica: Para lavar o jaleco, utilize hipoclorito de sódio / água sanitária a 1% e lave-o 
separadamente. Não use jaleco fora da área do laboratório. 
 
 Cabelos compridos devem estar sempre presos no ambiente de trabalho. 
 Evite usar sapatos abertos. 
 Não se deve provar qualquer produto químico. 
 Nunca cheirar frascos. 
 Não comer, não beber e não fumar no Laboratório. 
 Não pipetar nada com a boca (nem mesmo água destilada!!!). Peça sempre uma pera ou um 
pipetador mecânico. 
 Não se distraía, não fale, não cutuque qualquer pessoa enquanto a mesma estiver realizando 
algum experimento. 
 Nunca atender telefone ou abrir a porta enquanto estiver usando luvas. 
 Não usar fones de ouvido enquanto estiver na bancada. 
 Sempre lave as mãos antes de sair do Laboratório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UM BOM JALECO: 
 
 
 
Pergunta: 
 
 
 Com base na figura acima, aponte os erros de Boas Práticas no Laboratório acima e 
justifique sua resposta. 
 
 
Prática 1 
PRÁTICA DE EXTRAÇÃO DE DNA DO MORANGO 
 
Objetivo Geral 
 
 Extrair o DNA do morango com material facilmente encontrado em casa para visualização 
direta do material genético. 
 
Objetivos Específicos 
 
 Ajudar na interpretação dos métodos rotineiros de um laboratório trazendo para uma 
linguagem comum, mais próxima da realidade do dia-a-dia; 
 Aprender os princípios básicos das etapas de extração caseira; 
 Entender a função de cada material e reagentes utilizados; 
 Visualizar a olho nu o material genético do morango. 
 
Conceitos 
 
 A extração de DNA é uma técnica que se baseia na lise celular e na recuperação do ácido 
nucleico após degradação proteica. É um dos procedimentos mais rotineiros nos laboratórios de 
biologia molecular e tem ampla utilização na medicina, melhoramento genético de plantas e 
animais, genética forense, entre outros. Os espécimes utilizados em um laboratório são os mais 
variados como, por exemplo: sangue periférico, tecido tumoral fresco ou incluído em parafina, 
mucosa oral, bulbo capilar, etc. Para cada tipo de material biológico, utiliza-se uma técnica mais 
adequada, sendo que todas as variações obedecem ao mesmo fundamento: 
 
 1. Ruptura (física e química) das membranas celulares para liberação do material genético; 
 2. Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas; 
 3. Separação do DNA dos demais componentes celulares. 
 
 A ruptura das membranas celulares pode ser feita através de lise osmótica, utilização de 
detergentes e de proteinases para clivagem de proteínas de membrana. O desmembramento dos 
cromossomos com proteinases libera o DNA para extração, que ocorrerá por meio da utilização de 
etanol absoluto. Em ambiente livre de moléculas de água, o DNA (que é uma molécula polar e,consequentemente, hidrofílica) se torna insolúvel, sendo visualizado como uma “nuvem” que se 
separa do restante da solução. No laboratório, ao final da extração, faz-se a diluição do DNA 
extraído em água ou Tris-EDTA (TE), estocando-se esta solução em freezer (-20ºC) por tempo 
indeterminado, ou em geladeira (4ºC) durante o período em que estiver sendo manipulado. Uma 
observação importante é que alíquotas de DNA pouco concentradas podem sofrer hidrólise ácida se 
forem guardadas por muito tempo em temperaturas elevadas, sendo degradadas. Logo, para garantir 
a integridade desta molécula, o melhor é armazenar um estoque concentrado no freezer e utilizar 
pequenas alíquotas na diluição adequada de acordo com o próximo experimento que será feito. 
 
Notas Introdutórias 
 
 O protocolo a seguir tem a função de familiarizar os alunos para a prática de extração do 
DNA utilizando material facilmente encontrado por todos em casa. O morango é um pseudofruto da 
espécie Fragaria ananassa (família Rosaceae), que pode ser facilmente encontrado no período que 
vai de maio a agosto. São usados para esse tipo de prática devido a facilidade de obtenção de grande 
quantidade de DNA (cada célula possui 8x o conjunto de cromossomos, são octaplóides!), têm 
consistência macia e são de fácil homogeneização. Outras frutas também podem ser usadas 
aplicando-se o mesmo protocolo como, por exemplo: tomate maduro ou banana. 
Neste protocolo a maceração proporcionará uma primeira quebra das células e aumento da 
superfície de contato com a solução de “lise”, cuja função é romper as membranas celulares e as 
membranas nucleares ainda intactas, o que liberará as moléculas de DNA que estavam localizadas 
no interior do núcleo. As moléculas de detergente desestruturam os lipídeos, principais 
componentes das membranas, provocando sua ruptura, e o sal favorece a aglomeração das 
moléculas de DNA. O DNA possui baixa solubilidade em álcool etílico e também sofre um 
processo de desidratação, fazendo com que as moléculas fiquem mais compactadas. Além disso, o 
DNA também apresenta baixa densidade em relação a outros componentes celulares. Esses fatores 
fazem com que ele seja visualizado como um sobrenadante na solução de álcool etílico, que tem o 
aspecto de uma “nuvem”. 
 
Procedimentos 
 
 Materiais: 
 - Saco plástico 
 - 1 copo ou béquer 
 - 1 colher de sopa e uma de chá 
 - Bastão de vidro 
 - Peneira ou gaze 
 - Tubo de ensaio 
 - Palito 
 - 3 morangos maduros sem os cabinhos 
 - 150 mL de água 
 - Detergente de cozinha 
 - Sal de cozinha 
 - Álcool comum 
 
 Protocolo: 
 Colocar os morangos dentro do saco plástico (Prática 1 – Figura 1; P1F1); 
 Esmagá-los pressionando os morangos com os dedos até obter uma pasta quase 
homogênea; 
 Em um copo limpo fazer a solução de «lise»: 
a. 150 mL de água; 
b. 1 colher de sopa de detergente de cozinha; 
c. 1 colher de chá de sal de cozinha; 
d. Mexer bem com a ajuda do bastão de vidro (cuidado para não fazer espuma). 
 Colocar cerca de 1/3 da solução de lise no saco com a pasta de morango; 
 Misturar levemente; 
 
 
Prática 1 - Figura 1 (P1F1): Etapas iniciais da extração do DNA do morango. (A) pedaços da fruta no saco plástico e (B) 
pasta homogênea obtida após esmagar os pedaços. 
 
 Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos (mexendo de vez em quando); 
 Colocar uma peneira/gaze sobre um copo limpo e peneirar a mistura para retirar os 
pedaços de morango que restaram; 
 Colocar metade do líquido peneirado (~ 3 dedos) no tubo de ensaio; 
 Despejar delicadamente no tubo (pela parede do tubo), dois volumes de álcool 
comum (~ 6 dedos) (P1F2); 
 
 NÃO misturar o álcool com a solução! 
 
 Incubar por cerca de 3 minutos; 
 Usar um palito para enrolar as moléculas de DNA! 
 
 
 P1F2: Adição de álcool (A) e visualização do material genético (B). 
 
 
Perguntas 
 
 1) Por que é preciso esmagar o morango? 
 2) Qual a função do detergente nas primeiras etapas da extração? 
 3) E o sal, qual sua função neste protocolo? 
 3) Qual a função do álcool e por que não misturá-lo à solução? 
 4) Por que vemos uma «gosma branca» e não a dupla hélice do DNA? 
 
Prática 2 
PRÁTICA DE EXTRAÇÃO DE DNA DO HAMBÚRGUER 
 
Objetivo Geral 
 
 Extrair o DNA de carne processada (hambúrguer) com material laboratorial para análise de 
identificação do material genético contido na mesma. 
 
Objetivos Específicos 
 
 Aprender os princípios básicos das etapas de extração do DNA; 
 Entender a função de cada material e reagentes utilizados; 
 Obter material de qualidade para procedimentos posteriores. 
 
Conceitos 
 
 Vide: Extração de DNA do Morango. 
 
Notas Introdutórias 
 
 O protocolo a seguir tem a função de familiarizar os alunos para a prática de extração do 
DNA utilizando material laboratorial. A falsificação de alimentos representa um risco considerável 
para a saúde pública, rituais religiosos, orçamento pessoal e vida selvagem. Carnes bovinas e 
aviárias são amplamente consumidas pela população brasileira, sendo estes animais, em sua grande 
maioria, criados especificamente para fins de consumo. Por outro lado, alguns animais são criados 
como animais de companhia/estimação (como cachorros e gatos) ou habitam livremente nas cidades 
(ex. pombos). Estes últimos não são normalmente consumidos pela população ocidental, porém a 
adulteração de alguns produtos leva a mistura (de forma parcial ou completa) de animais 
normalmente não consumidos pela população em materiais de consumo frequente. Com o advento 
da genética molecular é possível identificar a proveniência do produto processado por meio dos 
procedimentos de extração do DNA e amplificação de sequências específicas. 
 
 
Procedimentos 
 
 Materiais: 
 - Placa de Petri 
 - Estilete ou bisturi 
 - Pistão 
 - Centrífuga 
 - 1 tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por amostra 
 - KIT DE EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDO: 
 - 1 coluna com membrana de purificação por amostra 
 - 1 tubo de microcentrífuga de 1,7 mL por amostra 
 - Etanol absoluto [ETOH] (96-100%) 
 - Tampão de Lise de Tecido [TLT] 
 - Proteinase K [PTK] 
 - Tampão de Clareamento [TC] 
 - Tampão de Lavagem [TL] 
 - Tampão de Eluição [TE] 
 
 Protocolo: 
1. Na placa de Petri macerar ao máximo um pequeno pedaço do tecido (~1 mm3); 
2. Colocar a amostra no tubo de 1,5 e com a ajuda do pistão finalizar a maceração; 
3. Adicionar no tubo 300 uL de TLT; 
4. Misturar bem com a ajuda do pistão; 
5. Adicionar no tubo 12 uL de PTK; 
6. Homogeneizar invertendo o tubo (LEMBRAR-SE DE FECHAR A TAMPA ANTES!); 
7. Incubar por 30 minutos (min) a 55˚C; 
8. Adicionar 300 uL de TC; 
9. Homogeneizar invertendo o tubo (LEMBRAR-SE DE FECHAR A TAMPA ANTES!); 
10. Adicionar 300 uL de ETOH; 
11. Homogeneizar invertendo o tubo (LEMBRAR-SE DE FECHAR A TAMPA ANTES!); 
12. Em uma coluna com membrana de purificação, aplicar 600 uL da mistura anterior; 
 CUIDADO! NÃO TOQUE A MEMBRANA COM A PONTEIRA, VOCÊ PODE 
DANIFICÁ-LA! 
13. Com a tampa fechada, centrifugar a coluna a 8.000 rotações por minuto (rpm) por 3 min; 
14. Descartar o líquido que passou pela membrana e voltar com a mesma para a coluna; 
 Repetir estas etapas enquanto tiver mistura para ser passada pela membrana! 
15. Adicionar 500 uL de TL; 
 Centrifugar a 14.000 rpm por 1 min; 
 Descartar o líquido que passou pela membrana e voltar com a mesma para a coluna; 
 Adicionar 500 uL de TL; 
 Centrifugar a 14.000 rpm por 2 min; 
 Com muito cuidado, retirar a membrana da coluna e colocar no tubo de 1,7 mLlimpo e 
devidamente identificado; 
 Adicionar 50 uL de TE ao centro da membrana; 
 Permitir que aconteça a completa umidificação da membrana esperando por 3 min em 
repouso; 
 Centrifugar a 14.000 rpm por 3 min; 
 Estocar o DNA à -20˚C. 
 
Perguntas 
 
 1) Onde está localizado o material genético na célula dos mamíferos? 
 2) Por que macerar o tecido e incubar por 30 minutos? 
 3) Explique a função do tampão de lise, clareamento e lavagem. 
 4) Por que após a centrifugação da etapa 15 devemos descartar o líquido e manter a 
membrana? 
 5) Explique a função da Proteinase K. 
 6) Quais os tipos de análises que poderão ser feitas com o produto da extração?
Prática 3 
PRÁTICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
 
Objetivo Geral 
 
 Demonstrar a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para identificação do 
material genético contido em carne processada (hambúrguer). 
 
Objetivos Específicos 
 
 Aprender os princípios básicos das etapas da PCR; 
 Entender a função de cada material e reagentes utilizados; 
 Diferenciar o conteúdo genético de cada amostra por meio de amplificação específica. 
 
Conceitos 
 
 A técnica de PCR baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo. Durante a 
PCR são utilizadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias 
simples, permitindo então a ligação de oligonucleotídeos iniciadores (primers), também em cadeia 
simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleotídeos, obtidos por síntese química. Para 
amplificar uma determinada região são necessários dois iniciadores complementares das sequências 
que flanqueiam o fragmento de DNA a ser amplificado, nos seus terminais 3' ( a polimerização 
ocorre no sentido 5’→3’), de modo a permitir a atuação da DNA polimerase durante a síntese da 
cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do 
DNA a ser amplificado. 
 Para realizar a PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo (no máximo 1µg), 
um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleotídeos iniciadores, os quatro 
desoxinucleotídeos constituintes do DNA e o cofator Mg2+. Esta mistura é submetida a vários 
ciclos de amplificação que consistem em: 
 
 Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar 
as duas cadeias; 
 Hibridação dos iniciadores por ligações de hidrogênio ao DNA alvo em cadeia simples 
(etapa chamada de “anelamento”). Para permitir essa associação, a mistura de reação é 
arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto). A temperatura 
neste passo depende da porcentagem de GC da sequência a ser amplificado; 
 Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, 
catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC). 
 
 O processo envolvendo estes três passos pode ser repetido várias vezes (25 a 40 ciclos) 
sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente. Em 
teoria, se tivermos 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 225 
vezes, embora na prática, devido a alguma ineficiência do processo de amplificação, esse aumento 
não seja tão grande (a concentração aumenta aproximadamente um milhão de vezes). 
 Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi 
desenvolvido o equipamento chamado termociclador, que permite programar de forma contínua e 
automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal, as DNAs polimerases 
utilizadas são termoestáveis. O produto de PCR, chamado de amplicon, pode ser visualizado após 
eletroforese em gel de agarose e o seu tamanho pode ser estimado por comparação com padrões 
lineares de DNA. 
 
 Cinética da PCR: 
 
Fase de “screening” - ciclos iniciais 
 Os iniciadores procuram o molde de DNA com as sequências que lhes são complementares 
(agem como as sondas em experimentos de hibridização). Encontrar a sequência 
complementar não é tão difícil, pois os iniciadores estão em considerável excesso em 
relação ao molde. 
Fase intermediária 
 O processo de amplificação está ocorrendo, levando ao acúmulo exponencial do fragmento 
de DNA. O pareamento do iniciador com a sequência que lhe é complementar já está bem 
facilitado, pois já existem várias cópias das sequências alvo. 
Fase tardia ou fase de platô 
 A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos 
gerados com os iniciadores disponíveis. 
 
As causas do platô são várias: 
 Perda da atividade da enzima; 
 Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA; 
 Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do 
pareamento com os iniciadores; aumenta a possibilidade de amplificação de produtos 
inespecíficos; 
 Gasto dos reagentes, especialmente de iniciadores, mas também de desoxinucleotídeos; 
 Acúmulo de pirofosfato, resultante das ligações fosfodiéster; 
 Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor, 
mas também foram se acumulando. 
 
 DNA polimerase: 
 
A) DNAs polimerases utilizadas em PCR: 
 
 Todas sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um iniciador, através da incorporação 
de nucleotídeos do meio, na direção 5’→3’, tendo como orientação, para a incorporação dos 
nucleotídeos, a informação contida na fita molde. 
 Algumas DNA polimerases têm também atividade de exonuclease: 
◦ na direção 3’→5’: uma atividade proof reading (revisora) 
◦ na direção 5’→3’: atividade corretiva em que há necessidade de remoção de um 
segmento de DNA que está na “ frente” da enzima. 
 
B) DNAs polimerases termoestáveis: 
 
 DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase): 
◦ A primeira a ser descoberta (1969, no parque nacional de Yellowstone) e a mais 
utilizada. Não tem atividade de exonuclease 3’→5’, ou seja, não tem atividade 
reparadora. 
◦ A taxa de incorporação de bases erradas durante a PCR pode variar entre 10-6 a 10-3, 
dependendo especialmente das concentrações de Mg2+ e dNTPs. 
◦ A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da enzima 
com o DNA que está sendo copiado, favorecendo a interrupção da polimerização. 
◦ Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a extensão 
de primers com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch. 
 
C) DNAs polimerases termorresistentes com atividade corretiva: 
 
 Pfu DNA polimerase: derivada de Pyrococcus furiosus (Pfu) - Tem forte atividade 
exonucleásica 3’→5’ (revisora). 
 Tli DNA polimerase: derivada do Thermoccocus litoralis (Promega). 
 Vent DNA polimerase: é a forma recombinante da Tli (New England Biolabs). Ambas têm 
atividade exonucleásica 3’→5’ e são mais termoestáveis que a Taq (meia vida de 6,7h a 
95ºC). Sintetizam fragmentos de até 13 kb. 
 DeepVent DNA polimerase: extraída do Pyroccocus GB-D (New England). 
 Pwo polimerase (Boehringer Mannheim): derivada de Pyrococcus woesei. 
 
 Desenho dos iniciadores: 
 
 É desejável que tenha de 15-30 nucleotídeos em extensão; 
 Distribuição randômica de bases, evitando regiões ricas em A+T ou C+G; 
 Deve-se verificar a formação de estruturas secundárias internas; 
 Evitar a complementaridade dos iniciadores (principalmente na porção 3’), diminuindo a 
formação de dímeros de iniciadores; 
 Desenhar os iniciadores, preferencialmente através de programas apropriados; 
 O cálculo aproximado da temperatura de hibridação dos iniciadores é: 
 
Tm = 4ºC * (G’s + C’s) + 2ºC * (A’s + T’s) 
Tanneal= Tm - 4° CMedidas que antecedem a PCR: 
 
 A) Água: Alta qualidade (destilada / deionizada, filtrada em membrana com poros de 
0,22mm e autoclavada). Usar uma alíquota nova em cada experimento! Sempre usar água coletada e 
processada recentemente. 
 B) Descontaminação de superfícies (luz ultravioleta - UV): Todas as superfícies devem ser 
descontaminadas com uso de UV (A UV tem ação reduzida apenas quando o DNA for menor que 
300 pb). 
 b1) Limitações: 
 •A superfície a ser irradiada deve ser perpendicular à fonte de irradiação. 
 •Superfícies que não sejam planas e objetos tridimensionais, como por exemplo, 
pipetadores, diluem a intensidade da luz e não são descontaminados eficazmente pela UV, porque 
somente uma parte do objeto é atingida. 
 b2) Instalação e uso da UV: 
 •Distância da fonte de luz da superfície de trabalho: 1m. Quanto maior a distância, maior 
deverá ser a intensidade da fonte de luz ultravioleta. 
 •Intensidade recomendada: 400 mW/cm2 (sobre a superfície a ser descontaminada). 
 
 Medidas de cuidado durante a PCR: 
 
 A) Sempre usar luvas, trocando-as frequentemente. 
 B) Material livre de DNases e RNases (microtubos, ponteiras). 
 C) DNA: Usar ponteiras com barreiras. 
 D) Volumes maiores, usar pipetas descartáveis embaladas individualmente. 
 E) Minimizar a geração de aerossóis ou respingos pela rápida centrifugação dos microtubos 
antes de abri-los. Trocar de luva em caso de contato com o material. 
 F) Reagente e tampão - usar sempre uma alíquota nova (fracionar os reagentes em pequenas 
alíquotas). 
 G) Adicionar o DNA por último (fechar o microtubo antes da adição da próxima amostra). 
 H) Escolha do controle positivo: não usar um controle positivo altamente concentrado (por 
exemplo, DNA plasmidial contendo a sequência-alvo). Neste caso, diluir o controle positivo. 
 I) Sempre utilizar um controle negativo (ele deve ser feito juntamente com as outras 
amostras e com os mesmos reagentes, colocando-se água destilada no lugar do DNA). 
 
 Principais fontes de contaminação na PCR : 
 
 A) DNA de outras amostras da mesma reação. 
 B) DNA de outros clones recombinantes (outro experimento). 
 C) DNA gerado por uma amplificação prévia da mesma sequência-alvo (contaminação 
“carryover”). 
 
 Otimização da reação da PCR: 
 
 A concentração de íons magnésio deve ser otimizada sempre que uma nova combinação de 
iniciadores e DNA-alvo for utilizada pela primeira vez ou quando a concentração de dNTPs ou 
iniciadores for alterada. dNTPs são a maior fonte de grupos fosfato na reação, qualquer mudança na 
sua concentração afeta a concentração de magnésio disponível. 
 As concentrações dos reagentes em uma reação padrão de PCR, utilizando Ampli Taq DNA 
Polimerase são: 
Reagentes Concentração 
Volume da reação 50µL 
Unidades de enzima 1,25 unidades 
MgCl2 1,4 – 4,0 mM 
dNTP 150 – 200µM 
Iniciadores 0,2 – 1,0 µM 
Tampão 1X 10mM tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl 
DNA 1-500ng (300 a 15.000 cópias do genoma) 
 
 Estabilizantes de enzimas: Gelatina, Triton X-100, albumina sérica bovina (BSA) 
 Para aumentar a especificidade da reação: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), formamida 
(facilitam a desnaturação da fita dupla de DNA e aumentam a especificidade da hibridação 
dos iniciadores). 
 Concentração de magnésio: a concentração de Mg+2 afeta a hibridação dos iniciadores, a 
temperatura de desnaturação do DNA molde e dos produtos amplificados. Além disso, está 
relacionado com a especificidade da reação, à formação de dímeros de primer e à atividade e 
fidelidade da enzima. Um aumento na [Mg+2], leva a um aumento na quantidade de 
amplicons, mas com menor fidelidade, ou seja, aparecem produtos inespecíficos. Deve-se 
iniciar a otimização da reação com uma concentração de 1,5 mM de magnésio. Caso não 
ocorra a amplificação, ajustar a concentração de magnésio (0,5 - 5 mM; com incrementos de 
0,5 mM). 
 Inibidores da reação: 
 A) Detergentes iônicos (fenol, heparina, xilenocianol e azul de bromofenol). 
 B) Agentes quelantes em excesso: EDTA 
 C) Elevadas concentrações de sais. 
 D) Contaminação com proteinase K: digestão da Taq DNA. 
 
 Diferentes aplicações da técnica da PCR: 
 
 A) Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros); 
 B) Seleção de clones recombinantes, com iniciadores complementares a sequências do vetor, 
em ambos os lados do sítio de clonagem; 
 C) Sequenciamento direto de produtos amplificados; 
 D) Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e 
doenças genéticas, estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias 
mutagênicas); 
 E) Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários 
parasitas; 
 F) Diagnóstico pré-natal em caso de risco; 
 G) Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico; 
 H) Identificação humana (Medicina Forense) e testes de paternidade. 
 
Notas Introdutórias 
 
 O protocolo a seguir tem a função de familiarizar os alunos para a prática de PCR utilizando 
material laboratorial. Com o advento da genética molecular é possível identificar a proveniência do 
produto processado por meio dos procedimentos de extração do DNA e amplificação de sequências 
específicas. Aqui, amplificaremos fragmentos do DNA mitocondrial de diferentes espécies, os quais 
poderão ser utilizados como fragmentos diagnósticos da presença de determinadas espécies nas 
amostras estudadas, devido ao padrão diferenciado de tamanhos. 
 
Procedimentos 
 
 Materiais: 
 - Termociclador 
 - Tubos 0,2 mL 
 - Pipetas 
 - Tubo de Mix 0,6 mL contendo: 
 Tampão 10X -------- 10 uL 
 MgCl2 (50 mM) -------- 4 uL 
 dNTP (25 uM) -------- 0,8 uL 
 Primer F (10 pmol/uL) -------- 2 uL 
 Primer R (10 pmol/uL) -------- 2 uL 
 Taq Polimerase (5 U/uL) -------- 0,8 uL 
 H2O ultra pura -------- 72,4 uL 
 TOTAL -------- 92 uL 
 - DNA extraído 
 
 Primers: 
 
 
 Protocolo: 
1. Homogeneizar bem cada «MIX» com a pipeta; 
2. Distribuir 23 uL do «MIX» correspondente nos tubos de 0,2 uL identificados para cada mix; 
3. Acrescentar 2 uL de DNA ao tubo específico (H ou CP) ou água (CN); 
4. Colocar no termociclador e verificar tampas (evitar evaporação); 
5. Ciclagem: 
 94˚C ----------- 3 min 
 35x 
1. 94˚C ----------- 30 seg 
2. 58 ˚C ----------- 30 seg 
3. 72˚C ----------- 30 seg 
 72˚C ----------- 5 min 
 4˚C ----------- ∞ 
6. Verificar PCR em gel de agarose (PRÓXIMA AULA)! 
 
Perguntas 
 
 1) Explique o significa da sigla PCR e sua utilidade? 
 2) Qual a função do MgCl2 na reação? 
 3) Qual a função dos primers? 
 4) O que substitui o uso da proteína Helicase (enzima que quebra as pontes de hidrogênio da 
dupla fita durante a replicação do DNA celular) e por que? 
 5) O que esperamos encontrar dentro do tubo no final da reação e como poderemos usufruir 
deste produto? 
Prática 4 
GEL DE AGAROSE 
 
Objetivo Geral 
 
 Visualizar, por meio de eletroforese em gel de agarose, fragmentos de DNA amplificados 
com tamanhos específicos para identificação do material genético contido em carne processada 
(hambúrguer). 
 
Objetivos Específicos 
 
 Aprender os princípios básicos das etapas da eletroforese em gel de agarose; 
 Entender a função de cada material e reagentes utilizados; 
 Avaliar os resultados obtidos na amplificação do material desejado com iniciadores 
específicos. 
 
Conceitos 
 
 A agarose é um polímero extraído de algas marinhas. O gel é feito por aquecimento deste 
polímero em solução tampão adequado, formando uma solução transparente e homogênea. Após apolimerização, o diâmetro dos poros da matriz do gel é proporcional à concentração da agarose 
utilizada. Devido à presença dos grupamentos fosfato no DNA que lhe conferem carga negativa em 
pH neutro ou alcalino, esta molécula tende a migrar para o anodo (pólo positivo), quando submetida 
a um campo elétrico (P4F1). 
 Para a visualização do DNA no gel e para a interpretação correta, são utilizados um agente 
intercalante de DNA e um marcador de massa apropriado. O principal agente intercalante utilizado 
é o brometo de etídeo, que é um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite 
fluorescência violeta quando excitado com luz ultravioleta (UV). Para géis rotineiros, a 
concentração adequada de brometo de etídeo é de 0,1 – 0,5 μg/mL. O limite de detecção é de 10 ng 
de DNA/banda visualizada com brometo de etídeo. Além disto, a intensidade de fluorescência é 
diretamente proporcional à massa molecular do fragmento de ácido nucleico. É fundamental o 
cuidado com este reagente, pois é carcinogênico. 
 
P4F1: Esquema do material utilizado na eletroforese. A) vista lateral da cuba de corrida contendo em seu interior o gel 
de agarose. B) vista frontal da cuba de corrida conectada à fonte elétrica, a direção da corrida eletroforética e a frente de 
corrida, representada pelos corantes azul de bromofenol (AB) e xilenocianol (X). 
 
 Os marcadores de massa são utilizados para se determinar o tamanho de uma molécula de 
DNA. Existem diferentes tipos de marcadores com massa molecular variando desde poucos pares 
de bases até dezenas de Kb. A faixa de tamanhos de fragmentos de DNA contida no marcador 
deverá ser compatível com o material analisado. Outra observação importante é que, em uma 
amostra, os fragmentos de DNA de maior tamanho ficam mais tempo retidos na matriz do gel, 
migrando mais lentamente do que os fragmentos de menor tamanho (P4F2). 
 
 
P4F2: Eletroforese em gel de agarose evidenciando o marcador de tamanho de fragmento de 100 pares de bases (1) e 
fragmentos de DNA de diversos tamanhos e intensidades (2 a 10). 
 
Notas Introdutórias 
 
 O protocolo a seguir tem a função de familiarizar os alunos para a prática de eletroforese em 
gel de agarose utilizando material laboratorial. Aqui, visualizaremos o resultado da amplificação 
dos fragmentos de DNA mitocondrial de diferentes espécies. Estes serão utilizados como 
fragmentos diagnósticos da presença de determinadas espécies nas amostras estudadas, devido ao 
padrão diferenciado de tamanhos. 
 
Procedimentos 
 
 Materiais: 
 - Cuba de eletroforese 
 - TBE 0,5% 
 - Gel de agarose 2% (2 g de agarose solubilizada e homogeneizada em TBE 1%) 
 - Pipetas 
 - Tampão de Corrida 
 - Marcador de Peso Molecular (50 pb) 
 - Produto da PCR 
 
 Protocolo: 
1. Primeiro, deve-se pesar a agarose. Utiliza-se 2% para géis de verificação de produtos de 
PCR com fragmentos pequenos (~100 pb). 
2. Para géis a 2%, utiliza-se 2 g de agarose para um volume final de 100mL de gel. 
3. Coloca-se a agarose em um erlenmeyer e, depois, 100mL de tampão TBE 1X. 
4. Aquecer esta solução no forno micro-ondas, aos poucos, tirando o erlenmeyer de vez em 
quando do forno e homogeneizar com cuidado, até que a solução fique completamente 
homogênea. Este processo dura aproximadamente 1 minuto. 
5. Montar a forma para o gel, com o molde e o pente que formará os poços para a aplicação 
das amostras. Esperar pela polimerização (aproximadamente 15 minutos). 
6. Retirar o pente do gel e transferir para a cuba de corrida. Adicionar tampão TBE 0,5 % 
(sempre adicione o mesmo tampão que foi utilizado no preparo do gel). 
7. Aplicar 5μL do produto da PCR com 2μL de tampão de corrida (azul de bromofenol, 
xilenocianol e glicerol a 20%, para o gel feito sem adição de brometo de etídeo). 
8. Os corantes azul de bromofenol e xilenocianol ajudam a acompanhar a frente de corrida, 
enquanto o glicerol é um agente espessante de alta densidade que evita o refluxo da 
amostra após ser aplicada no poço do gel. 
9. Cobrir a cuba e conectar os cabos à fonte de tensão de forma que a migração ocorra do 
pólo negativo para o pólo positivo. 
10. Aplicar voltagem de aproximadamente 80V e 110A. Monitorar a passagem de corrente 
através da formação de bolhas que ocorre nos pólos devido à eletrólise do tampão. 
11. Após a corrida (aproximadamente 90 minutos), desligar a fonte de tensão e remover o 
gel da cuba. 
12. Colocar o gel em solução de brometo de etídeo por 10 minutos. 
13. Analisar o padrão de migração expondo o gel à luz UV e fotografá-lo para 
documentação. 
 
 
Perguntas 
 
 1) Qual a utilidade e aplicações do uso do procedimento de eletroforese em gel? 
 2) Qual a função da corrente elétrica? E dos poros da agarose? E a forma e os pentes? 
 3) O que influencia a marcação dos Volts e Ampères? 
 4) Como o brometo de etídeo permite a visualização do DNA? 
 5) Qual a função da luz UV?