Imobilização de enzimas

Prévia do material em texto

BIOPROCESSOS I
CURSO: BIOTECNOLOGIA
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Catálise Enzimática
Vantagens
Aumentam em 106 a 1020 vezes a velocidade da reação;
Operam em condições suaves:
pressão atmosférica,
temperaturas próximas à ambiente,
pH próximo à neutralidade;
Alta especificidade pelo substrato;
Alto rendimento - ausência de produtos colaterais.
Desvantagens
Alto custo;
Processo de obtenção demorado;
Recuperação após uso economicamente inviável;
Contaminante do produto;
Baixa estabilidade
a alterações térmicas,
a variações de pH,
durante o manuseio. 
SUPORTE IDEAL
Alta capacidade de retenção e difusividade;
Longo período de vida útil;
Resistência ao ataque de solventes orgânicos, variações de pH e temperatura;
Não causar interferência na atividade catalítica;
Ser estável nas condições de reação.
Resistência mecânica
Resistente à enzima
SUCESSO DA IMOBILIZAÇÃO
  As reações devem envolver grupos funcionais da enzima que não sejam essenciais para a catálise ou para as propriedades químicas ou físicas da enzima
IMPORTÂNCIA DA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
a) Possibilidade de repetidos usos de uma única batelada de enzima ocasionado redução nos custos operacionais
b)  Possibilidade de parar a reação por remoção da enzima do meio reacional
c) Estabilização da estrutura terciária da enzima resultante da ligação ao suporte (efeito anti-turbulência)
d) O produto não é contaminado com a enzima. Este fato é particularmente importante em aplicações relativas a alimentos e preparações farmacêuticas
e) A extensão do curso da reação pode ser controlada pela velocidade de fluxo do substrato através da solução ou pela simples remoção da enzima.
Suportes para imobilização de enzimas
INORGÂNICOS
NATURAIS
Argilas
Bentonite
Terras Diatomáceas
Pedra Pomes
Areia
Vermiculita
SINTÉTICOS
Alumina e aluminosilicatos
Sílica e Vidro poroso
Óxidos metálicos 
Níquel
Magnetita
Zircônia
Suportes para imobilização de enzimas
ORGÂNICOS
NATURAIS
Agarose e Alginatos
Celulose, Amido
Colágeno, Seda
Carbono ativado
Pasta de carbono
K – Carragena
Pectina
SINTÉTICOS
Poliestireno
Poliacrilamida
Polimetacrilato
PVA, PVC, Nylon
Polianilina
Polietilenglicol (PEG)
Poliuretano
A morfologia do suporte (ou do poro) permite a entrada da enzima?
A enzima pode ser imobilizada no suporte, isto é, existem grupos reativos disponíveis?
A enzima a ser imobilizada tem estabilidade em (1) ácido, (2) base, (3) altas concentrações de sal? E o suporte?
O material pode ser convenientemente manuseado?
O suporte resiste à compressão? A pressão tolerável afeta o tamanho e a forma da partícula? 
A carga máxima de enzima é adequada ao sistema?
Qual a vida média operacional do sistema? Ela é afetada pela temperatura, pH e outras condições?
Sob que condições e por quanto tempo o material pode ser armazenado?
Antes de Imobilizar, VERIFIQUE:
MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO:
1- ADSORÇÃO: FORÇAS DE INTERAÇÃO COMPLEXAS QUE ENVOLVEM MÚLTIPLOS TIPOS DE 	FORMAÇÃO DE LIGAÇÕES
	- INTERAÇÕES ELETROSTÁTICAS ENTRE CARGAS OPOSTAS
	- FORMAÇÃO DE LIGAÇÕES IÔNICAS
	- MATERIAIS: INORGÂNICOS E POLÍMEROS SINTÉTICOS
	PROBLEMA: INFLUÊNCIA DO MEIO (FORÇA IÔNICA, pH, etc.)
2- LIGAÇÃO COVALENTE: GRUPOS QUÍMICOS ESPECÍFICOS
	- ESFERAS DE VIDRO (100 – 500 mm) + g-AMINOPROPIL-TRIETOXISILANO (APTS) + 		GLUTARALDEÍDO
	- GRUPO CARBONILA (GLURATARLDEÍDO) + GRUPOS AMINA (CADEIAS LATERAIS)
	
3- ENVOLVIMENTO OU APRISIONAMENTO: CONFINAMENTO FÍSICO DA MOLÉCULA 			EM UMA MATRIZ POLIMÉRICA FORMADORA DE UM GEL HIDROFÍLICO
	- É O MAIS USADO DOS MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS VIVAS
	- BAIXA TOXICIDADE, ALTA CAPACIDADE DE RETENÇÃO CELULAR
	- ESTABELECE-SE UM FLUXO DE SUBSTRATO DESDE O MEIO PARA O INTERIOR DO 		GEL E OS PRODUTOS FORMADOS DIFUNDEM ATRAVÉS DO GEL PARA O 		MEIO.
2. Fixação das enzimas sobre suporte sólido:
 A enzima deve ser fixar tão solidamente quanto possível;
 Bentonita: Insolúvel em água, mas uma vez hidratada intumesce e abre-se como uma espoja altamente porosa e carregada magnéticamente.
 2.1 Fixação por adsorção
 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes
Métodos de Imobilização
12
Imobilização de Enzimas
 2.1. Adsorção
 Consiste da união entre a enz. e um suporte inerte através de interações iônicas, adsorção física, interações hidrofóbicas e forças de Van der Waals. 
Suportes:
Orgânicos
Inorgânicos
Derivados da DEAE-celulose, Dowex
Celite, bentonita e alumina
13
 2.1 Fixação por adsorção
 Trata-se de um método simples, de aplicabilidade generalizada. 
Efetua-se por simples mistura da enz. com o suporte, nas condições de pH e força iônica adequados, em seguida lava-se a enz. que não ficou ligada.
Suportes: Carvão ativado, óxidos metálicos, vidros, resinas poliméricas.
Métodos de Imobilização
14
 2.1 Fixação por adsorção
 Diferentes parâmetros vão influenciar na quantidade de enz. fixada e estabilidade das ligações:
 Do pH do meio dependem o número e a natureza das cargas sustentadas pelo suporte. 
 Sais em [ ] aumentam a solubilidade das enz.
 Com da T existe a probabilidade de se aumentar a criação de ligações 
Métodos de Imobilização
15
2.1 Fixação por adsorção
 Vantagens:
 Procedimento extremamente simples custos
 Ligação ocorre por simples exposição e as condições são brandas
 Os efeitos difusionais são desprezíveis
 Desvantagens:
 Enz. são altamente dependentes de pH, solventes, substrato e Temp.
 Podem ser facilmente dessorvidas com a alteração destes parâmetros 
* É uma das técnicas mais usadas.
Métodos de Imobilização
16
 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes
 Vantagens:
 Maior eficiência e estabilidade.
 Não são tão suscetíveis a pH, força iônica, solventes e Temp.
 Os suportes são escolhidos por suas propriedades de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade mecânica, área superficial, intumescimento e natureza hidrofílica ou hidrofóbica.
 Suportes: inorgânicos, polímeros naturais e sintéticos.
Métodos de Imobilização
17
2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes
 Suportes:
 Vidro;
 Sílica;
 Sephadex;
 Celulose;
 Nylon;
 Poliestireno.
Métodos de Imobilização
18
Tipos de 
Ligação
REAGENTES BIFUNCIONAIS
1. 1. Em Fibra
1. APRISIONAMENTO
MÉTODOS PARA ENZIMAS INSOLÚVEIS
MÉTODOS PARA ENZIMAS INSOLÚVEIS
1. APRISIONAMENTO
1.2. Em Gel
MÉTODOS PARA ENZIMAS INSOLÚVEIS
1. APRISIONAMENTO
1. 3. Em Microcápsula
MATERIAIS MAIS USADOS PARA A FORMAÇÃO DAS PARTÍCULAS DE GEL:
 - AGAR					- POLIACRILAMIDA
 - K-CARRAGENANA	POLISSACARÍDEOS		 (SINTÉTICO)
 - ALGINATO		NATURAIS
 - PECTINA
POLISSACARÍDEO (1 – 4 %) + ENZIMA
AGITADOR MAGNÉTICO
SOLUÇÃO DE CaCl2
PARTÍCULAS CONTENDO A ENZIMA IMOBILIZADA: 0,5 – 5 mm
	 250 mg/g
PRINCIPAL DESVANTAGEM DA TÉCNICA DE IMOBILIZAÇÃO POR ENVOLVIMENTO:
LIMITAÇÃO IMPOSTA PELA DIFUSÃO INTRAPARTICULAR DE SUBSTRATOS E PRODUTOS
SOLUÇÃO:
- OTIMIZAR O TAMANHO DA PARTÍCULA, A DIFUSIVIDADE DAS ESPÉCIES ATRAVÉS DA 	MATRIZ E A CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA NA PARTÍCULA
TIPOS DE BIORREATORES EMPREGADOS
LEITO FIXO			LEITO FLUIDIZADO
3. A Molécula da Enzima
3.1 – Mudanças na Conformação
Para ser ativa a Enzima precisa resguardar:
 A conformação nativa;
 Capacidade de alterar a conformação durante a catálise.
Imobilização pode resultar:
 Em alterações na conformação que impliquem em redução ou perda da atividade;
 Em múltiplos pontos de ligação que causem restrição às alterações conformacionais durante a catálise.
Imobilização de Enzimas
 Efeitos causados pela imobilização 
	
27
3.2 – Inativação
 Resultado da ação dos reagentes utilizados durante o processo de imobilização – radicais livres, agentes oxidantes, extremos de pH no microambiente.
Enzimas Livres x Imobilizadas
Livres
 Instabilidade
 Rápida perda da atividade catalítica
 Não regeneração
 Imobilizadas
 Reutilização
 Maior estabilidade (Faixas mais amplas depH e Temp.)
 Menor interferência de inibidores e/ou ativadores
29
Imobilização de Enzimas
Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da Enzima Invertase.
Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel
30
Propriedades de Enzimas Imobilizadas
Medida da atividade:
 Atividade residual de E imobilizada é mais fraca que a da E nativa, mas a estabilidade é maior
Influencia das condições operacionais:
 pH e T  desnaturação parcial ou total da proteína;
 Imobilizada  resistem melhor a variações de pH e tratamentos térmicos;
31
Imobilização de Enzimas
Vantagens
 As enzimas podem ser reutilizadas
 Os processos químicos podem ser continuamente operados e prontamente controlados
 Os produtos podem ser facilmente separados
 Os problemas de efluentes são minimizados
 A repetibilidade do processo pode ser aumentada
 estabilidade
 custos
32
Imobilização de Enzimas
Desvantagens
 Aleatoridade da interação enzima-substrato;
 Inexistência de um método geral de imobilização;
 Atividade catalítica devido a efeitos: 
Difusionais
Microambiente
Estéricos / Conformacionais
33
SISTEMAS COM ENZIMAS IMOBILIZADAS: 
- MUITAS ENZIMAS (EXTRACELULARES E INTRACELULARES) AMPLAMENTE 	DISPONÍVEIS
SOMENTE PARA PROCESSOS MONO-ENZIMÁTICOS
 MAIOR RENDIMENTO DO PRODUTO: NÃO SÃO FORMADAS SUBSTÂNCIAS 	COLATERAIS CONTAMINANTES, RESULTANTES DO METABOLISMO OU 	LISE CELULAR
AUMENTA A ESTABILIDADE DA ENZIMA NO REATOR E AS POSSIBILIDADES DE 	RECUPERAÇÃO E REUTILIZAÇÃO
TIPOS DE REATORES/PROCESSOS:
BATELADA
CONTÍNUO AGITADO
LEITO FIXO
LEITO FLUIDIZADO
ENZIMA
INDÚSTRIA
USO
a- AMILASE
PANIFICAÇÃO
Redução da viscosidade e acelerar o crescimento da massa
CERVEJARIA
Liquefaçãodo amido
PAPEL
Remoção de gomas
TÊXTIL
Remoção de gomasde amido
GLICOAMILASE
AÇUCAREIRA
Produção de xaropes de glicose
PROTEASES
LAVANDERIA
Incorporação emdetergentes
CURTUME
Curtir e depilar o couro
ALIMENTÍCIA
Queijos, amaciamento de carnes
PECTINASES
ALIMENTÍCIA
Clarificação de sucos
GLICOSE-ISOMERASE
ALIMENTÍCIA
Produção de xaropes de frutose
GLICOSE-OXIDASE
ALIMENTÍCIA
Desglicosaçãode ovos
PAPAÍNA
ALIMENTÍCIA
Evitarturbidezda cerveja
PENICILINA-AMIDASE
FARMACÊUTICA
Produção de antibióticos
AMINO-ACIDASE
FARMACÉUTICA E ALIMENTÍCIA
Purificação de misturasracémicasde aminoácidos
EXEMPLOS DE ENZIMAS INDUSTRIAIS
1- ISOMERIZAÇÃO DA GLICOSE: TRANSFORMAÇÃO DA GLICOSE EM FRUTOSE
	* EXECUTADA NO MUNDO INTEIRO, PRINCIPALMENTE EM U.S.A.
	* PRODUTO COMERCIAL: HFCS – “HIGH FRUCTOSE CORN SYRUP” (42 – 55 %)
	* USO COMO ADOÇANTE EM BEBIDAS NÃO-ALCOÓLICAS, PANIFICAÇÃO, 			LATICÍNIOS E ENLATADOS
AMIDO DE MILHO
GLICOSE
Hidrólise
FRUTOSE 55%
Isomerização
FRUTOSE PURA
Cromatografia
PROCESSOS DE IMOBILIZAÇÃO:
USANDO A CÉLULA TOTAL
LIGANDO A ENZIMA SOLÚVEL A UM SUPORTE ADEQUADO (GLUTARALDEÍDO/ALUMINA)
BIORREATOR: LEITO FIXO
PERSPECTIVAS:
ENZIMA MAIS BARATA
AUMENTAR O RENDIMENTO EM FRUTOSE
COMBINAR OS PROCESSOS ENZIMÁTICOS NUMA ÚNICA ETAPA
USAR O HFCS COMO SUBSTRATO PARA A SÍNTESE DE MANITOL
APERFEIÇOAR O PROCESSO DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
2- HIDRÓLISE DA LACTOSE: PRODUÇÃO DE LEITE E DERIVADOS PARA CONSUMIDORES 				INTOLERANTES
VIA ÁCIDA (ALTA TEMPERATURA, PRODUTOS COLATERAIS)
VIA ENZIMÁTICA (40 °C, SEM PRODUTOS COLATERAIS)
LACTOSE
GLICOSE + GALACTOSE
Lactase
b-Galactosidase
(Kluyveromyces sp., Aspergillus sp.)
a) DESLACTOSAÇÃO DO SORO 		b) DESLACTOSAÇÃO DO LEITE INTEGRAL
HIDRÓLISE (80 – 90 %)
PASTEURIZAÇÃO
SORO PASTEURIZADO
AJUSTE DO pH
DESMINERALIZAÇÃO
EVAPORAÇÃO / XAROPE
LEITE (UHT ou PASTEURIZADO
ADIÇÃO DE LACTASE ESTÉRIL
EMBALAGEM ASSÉPTICA
HIDRÓLISE NA EMBALAGEM
LEITE DESLACTOSADO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIPASES IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA	(Santos et al.,1997).
 Foi realizado um estudo sobre a atividade de diferentes lipases (lipases de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e Lipolase) imobilizadas em gel de pectina, avaliando sua atividade catalítica em meio orgânico.
Determinação das propriedades catalíticas em meio aquoso e orgânico da lipase de Candida rugosa imobilizada em celulignina quimicamente modificada por carbonildiimidazol 
(Fabrício M. Gomes; Ariela V. de Paula; Grazielle dos S. Silva; Heizir F. de Castro; 2006)
39
Imobilização de Lipase de Candida antarctica B em Esferas de Quitosana para Obtenção de BiodieseI por Transesterificação de Óleo de Mamona 
(Cruz Jr., Américo; Pacheco, Sabrina Moro Villela; Furigo Jr, Agenor; 2008)
(- Amino de Lisina e N-terminal
Tiol de Cisteína
Carboxila de Ác. Aspártico, Glutâmico e C-Terminal
Fenol de Tirosina
Guanidino de Arginina
Imidazol de Histidina
Dissulfeto de Cisteína
Indol de Triptofano
Tioéter de Metionina
Hidroxila de Serina e Treonina
Resíduo Aminoácido de origem