RELATÓRIO TESTE DO BIURETO

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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
LAURA GUALDA
 MARINA KUMADA
NICOLE MOURA
RELATÓRIO LABORATORIAL DE BIOQUÍMICA:
AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS: TESTE DO BIURETO
SÃO PAULO
2019
LAURA GUALDA 
MARINA KUMADA
NICOLE MOURA
RELATÓRIO LABORATORIAL DE BIOQUÍMICA:
AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
Relatório laboratorial entregue ao curso de Farmácia da Universidade Presbiteriana Mackenzie a ser utilizado como requisito de obtenção de nota avaliativa. 
ORIENTADOR: Prof. Dr. José Alves Rocha Filho 
SÃO PAULO
2019
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ......................................................................... 04
OBJETIVOS ............................................................................. 06
MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................... 07
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................... 08
CONCLUSÃO .......................................................................... 09
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 10
INTRODUÇÃO
O conhecimento sobre a absorção de luz pela matéria é a forma mais comum de se determinar a concentração de substâncias presentes em uma solução. A maioria dos métodos utilizados em bioquímica se dá pela determinação espectrofotométrica de compostos corado, obtidos por reações entre o composto a ser analisado e o reagente cromogênico, resultando em um produto colorido. Os métodos que se baseiam nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais geralmente são bastante específicos extremamente sensíveis. (ROCHA FILHO, 2019).
Diversos são os métodos espectrofotométricos existentes para a determinação quantitativa de proteínas totais. Contudo, métodos rápidos e sensíveis de quantificação são os mais requisitados, tais como o teste do Biureto, método de Bradford, método de Lowry, entre outros. (TREICHEL et al., 2016)
O teste do Biureto se baseia na reação do reativo do biureto, constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio (NaOH) com o tartarato de sódio, que estabiliza o cobre em solução; este em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo com a ligação peptídica. Sendo assim, soluções alcalinas que contenham biureto desenvolvem uma coloração violeta, apresentando duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. (BARRINHA; ROCHA FILHO, 2019).
Outro método estudado é o de Lowry, a metodologia mais utilizada para a determinação de proteínas. O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima em 750 nm, com a coloração avermelhada. (LOWRY, O.H, 1951)
O método de Bradford também é extremamente utilizado, ele é baseado na interação entre o corante BG-250 (Coomassie brilliant blue) e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm76 (verde azulado). (Bradford, M.M., 1976)
A existência de diversos métodos espectrofotométricos para a análise de quantificação de proteínas é de extrema importância. Entretanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultra-violeta e no visível (UV-Vis). 
OBJETIVOS
O experimento efetuado em aula prática teve como objetivo a determinação e caracterização de aminoácidos de determinada solução de proteína. A reação de Biureto foi realizada com intuito tanto qualitativo quanto quantitativo, incluindo, portanto, o preparo de soluções com diferentes quantidades de água destilada, solução padrão de proteína e solução desconhecida, além de medição de valores de Absorbância e construção de gráfico de curva de absorbância versus concentração.
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MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais:
Solução padrão de Albumina 5mg/ml;
Solução de proteína desconhecida;
Água destilada;
Reativo de Biureto;
Tubos de ensaio;
Banho Maria Digital;
Espectrofotômetro.
Métodos:
1º: Numerar os tubos de ensaio;
2º: Distribuir diferentes quantidades de solução de proteína (Albumina), solução desconhecida e água destilada nos tubos; 
3º: Adicionar 5ml de Reativo de Biureto em cada tubo de ensaio;
4º: Incubar os tubos em banho-maria a temperatura entre 20-32ºC, por 10 minutos;
5º: Medir os valores de absorbância de cada solução no espectrofotômetro em 545 nm contra o tubo branco e anotar os valores obtidos;
6º: Construir gráfico da curva de absorbância versus concentração, obtendo a equação da reta;
7º: Calcular a concentração da amostra desconhecida através da equação da reta obtida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao obter-se os resultados através da análise das quantidades e através do estudo do gráfico, é possível concluir que, no geral, quanto maior a concentração existente de proteína na solução, maior a será a absorbância desta. Tal ocorrência deve ao fato de que quando adicionamos o Biureto, ele reage com a proteína gerando a cor violeta. Desta forma, quanto mais proteína, mais forte a cor, aumentando assim o resultado da espectrofotometria. 
Após a montagem do gráfico pudemos, a partir da fórmula y = 2,38x + 0,39, determinar a concentração da solução proteica desconhecida como x = 0,436 mg/mL.
A partir dos cálculos foram obtidas as concentrações de absorbância: M1.V1 = M2.V2
5.0,5 = M2.0,7
M2 = 0,357
M1.V1 = M2.V2
5.2 = M2.7
M2 = 1,428
M1.V1 = M2.V2
5.1,5 = M2.7
M2 = 1,071
M1.V1 = M2.V2
5.1 = M2.7
M2 = 0,714
Gráfico I – Curva de calibração para dosagem de proteínas totais empregando método do Biureto
Fonte: Autor, 2019
nte: Autor
CONCLUSÃO
Ao se realizar testes espectrofotométricos temos uma diversa gama de variedades, contudo, é necessário escolher o mais adequado e o que proporciona menores riscos de erro e menos interferentes. Desta forma, diversas medidas devem ser analisadas antes da escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais, entretanto, conhecer a natureza dos participantes da amostra e de suas concentrações é a essencial. 
Ainda assim, outros fatores importantes, são a sensibilidade necessária, que depende da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra disponível; a rapidez e o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método a ser utilizado.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254.
Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J.; J. Biol. Chem. 1951, 193, 265.
FERNANDES, Fernanda B., Bioquímica I - Roteiro de aula prática. São Paulo.