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Bacteriologia Clínica Identificação de Cocos Gram Positivos – Staphylococcus spp e Streptococcus spp Profa Eloisa Staphylococcus spp e Streptococcus spp Compõem um grupo de grande importância clínica. São cocos gram positivos, anaeróbios facultativos de importância clínica pertencem a uma de duas famílias: Micrococcaceae e Streptococcaceae. Principais Cocos Gram Positivos de Interesse Clínico Staphylococcus Espécies: S. aureus; S. epidermidis; S. saprophyticus Streptococcus Espécies: S. pyogenes; S. agalactiae; S. pneumoniae; Grupo Viridans; Grupo D Enterococcus Espécies: faecalis; faecium; bovis Bacteriologia Clínica Identificação de Cocos Gram Positivos –Staphylococcus spp Gênero Staphylococcus Cocos Gram positivos; Organizados em Aglomerados Irregulares “Cachos”; Imóveis; Produzem pigmentos: branco à amarelo-dourado; Anaeróbios facultativos; Catalase positiva - (ou seja, produzem a enzima catalase que degrada o peróxido de hidrogênio: 2 H2O2→ 2 H2O + O2); Família - Micrococcaceae Gênero Staphylococcus Esta estrutura característica lembra cachos de uva. Gênero Staphylococcus A identificação presuntiva começa com a inoculação primária na placa de ágar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tensão de CO² (método da vela ou estufa de CO2 ). As colônias de estafilococos são geralmente maiores, convexas, de coloração variando do branco-porcelana a amarelo podendo apresentar hemólise ou não. Staphylococcus spp Indivíduos sadios são colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentação, e podem albergar o microrganismo na nasofaringe (60% da população), ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir destes sítios, o S. aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infecções letais por conta dos fatores de virulência ou através de resistência aos antimicrobianos atualmente utilizados Staphylococcus aureus (Características das Principais Espécies) Coloração amarelo-dourado (tipicamente); Prova da Coagulase Positiva; Importante agente de Infecções Hospitalares; Geralmente são beta hemolíticos em ágar sangue; Capaz de despolimerizar DNA (Meio DNAse); Cresce em meio salgado (12% NaCl); Fermentação do manitol positiva; Possui várias Hemolisinas e Toxinas (Virulência e Patogenicidade). Staphylococcus aureus (Características Macroscópicas em Culturas) Staphylococcus aureus mannitol salt agar (MSA) S. aureus O nome “aureus” significa “dourado” em latim, qualidade atribuída ao pigmento amarelado característico produzido pela bactéria. Principais doenças S. aureus Podem estar divididos em três tipos: infecções superficiais (abscessos cutâneos, infecções de ferida) infecções sistêmicas (bacteremia, endocardite, osteomielite, artrite, miosite, pneumonia) quadros tóxicos (síndrome do choque tóxico, síndrome da pele escaldada e intoxicação alimentar) Infecções cutâneas O impetigo é uma infecção da epiderme que se localiza principalmente na face e nos membros, mais comum em crianças e jovens. A foliculite é uma infecção do folículo piloso, com a formação de uma pequena coleção de pus abaixo da epiderme. Quando ocorre nos pêlos das pálpebras a infecção se chama ordelo ou terçol. O furúnculo é uma extensão da foliculite que se apresenta com nódulos dolorosos. Bacteremias Processo mais comum em pacientes internados. A infecção geralmente é adquirida quando do emprego de cateteres intravenosos. A bacteremia pode dar origem a diversas outras infecções e pode evoluir pra sepse com mortalidade elevada. Endocardites A infecção é adquirida pelo uso de injeção intravenosa e a válvula mais comprometida é a tricúspide. Alta taxa de mortalidade. Pneumonia e Empiema A pneumonia pode ser devido a aspiração da secreção oral ou disseminação hematogênica a partir de um foco infeccioso. A pneumonia estafilocócica pode ser caracterizada de empiema (coleção de material purulento na pleura). Osteomielite A bactéria pode alcançar os ossos por via hematogênica ou por extensão de infecções em tecidos contíguos. Intoxicação alimentar É decorrente da ingestão de enterotoxinas pré-formadas no alimento contaminado pela bactéria. Os sintomas da intoxicação alimentar consistem em náuseas, vômitos, diarréia e dores abdominais. As enterotoxinas são termoestáveis, dessa forma a cocção dos alimentos não as destroem. Síndrome da pele escaldada Caracteriza-se pelo descolamento de extensas áreas da epiderme. O descolamento é conseqüência da destruição da desmogleína pela esfoliatina, produzida pela S.aureus. Staphylococcus epidermidis (Características Principais) Segunda espécie mais importante do gênero Staphylococcus Faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores. É uma espécie bem menos virulenta do que S. aureus. Não apresentam a produção de coagulase e algumas cepas apresentam a produção muito tímida de certas enzimas proteolíticas. Tem muitos fatores de adesão e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses, stents, etc.). Staphylococcus epidermidis (Características Principais) Staphylococcus epidermidis é um risco para pacientes imunocomprometidos e para usuários de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infecções generalizadas não-piogênicas. Pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infecções em locais com prótese. Staphylococcus epidermidis (Características Principais) Coloração branca; Coagulase Negativa; DNAse Negativa; Fermentação do manitol negativa; Novobiocina Sensível; Habitante Normal da pele e mucosas; Causa ocasionalmente sepses. Staphylococcus saprophyticus (Características Principais) O Staphylococcus saprophyticus é de interesse clínico pois frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia. Staphylococcus saprophyticus (Características Principais) Coloração branca; Coagulase negativa; DNAse negativa; Fermentação do Manitol negativa; Novobiocina resistente; Causa Infecções genito-urinárias. Provas Bioquímicas Identificação dos Staphylococcus Identificação de cocos gram-positivos Slide profa Juliana Lins Identificação de cocos gram-positivos Coagulase negativa novobiocina S. epidermidis S. saprophyticus sensível resistente Resumo de Identificação Staphylococcus Prova da Catalase A partir da caracterização da amostra como CG+ através da coloração de Gram, a determinação da família é feita pela prova da catalase. A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio. 2H2O2 2H2O + O2 catalase Prova da Catalase Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Para a família Microccocacea (estafilococos) a prova é geralmente positiva, enquanto que para a família Streptococcacea (estreptococos) é negativa. Prova da Catalase Prova da Catalase - Enzima Constitutiva Ao coletar a colônia, não carregar meio de cultura (ágar sangue), que pode acarretar resultados falso-positivos porque o sangue do meio contém catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reação positiva (fazer Gram e ver disposição em cadeias curtas ou aos pares). Prova da coagulase A produção de coagulase (enzima extracelular) é exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critério para a identificação de uma amostra como pertencente à espécie. coagulase protrombina FibrinogênioFibrina estafilotrombina 34 Teste da coagulase em lâmina A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) “clumping factor” na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando a coagulação do mesmo. Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina; Emulsionar uma colônia isolada a ser testada; Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plástico ou madeira; Observar se há aglutinação em 10 segundos; Não se pode executar este teste a partir de um ágar com grande concentração de sal como ágar manitol. Teste da coagulase em tubo Este teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a fibrina. O teste é melhor efetuado se: Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma; Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria; A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. O melhor plasma a ser usado é o de coelho com EDTA, não devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue Prova da Coagulase em tubo Coagulase Livre Negativa Coagulase Livre Positiva Provas Bioquímicas Identificação dos Staphylococcus Hemólise α- parcial β – total (S.aureus) γ – sem hemólise (S. epidermidis) TESTE DO CRESCIMENTO EM ÁGAR MANITOL O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de cloreto de sódio, denominado ágar manitol salgado ou Meio de Chapman. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que indica uma reação positiva quando o meio ao redor das colônias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado. Provas Bioquímicas Identificação dos Staphylococcus Manitol salgado Teste de DNAse Este teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de orto-toluidina na concentração de 0,1%; o meio adquire uma coloração azul intensa; Incubar a 35°C por 24 horas; O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne à placa original onde nem sempre as colônias estão bem isoladas Provas Bioquímicas Identificação dos Staphylococcus DNAse Positiva - Meio adicionado de Indicador - DNAse Positiva - Revelador Solução de HCl 2% - Formação de um halo transparente em torno do crescimento bacteriano, o que caracteriza o resultado positivo para a prova de DNAse. Provas Bioquímicas Identificação dos Staphylococcus Prova da DNAse Negativa Resistência à Novobiocina A cepa é semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 µg. As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12 mm, enquanto as susceptíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus aureus são sensíveis. Provas Bioquímicas Identificação dos Staphylococcus Novobiocina M -1 M-2 M-1: Staphylococcus epidermidis Sensível M-2: Staphylococcus saprophyticus Resistente Bacteriologia Clínica Identificação de Cocos Gram Positivos –Streptococcus spp Streptococcus spp Família - Streptococcaceae Streptococcus sp - mais de 20 espécies Principais agentes de causadores de infecção: S. pneumoniae (ou pneumococo - principal agente de infecções trato respiratório - pneumonias bacterianas) S. pyogenes – (coloniza garganta - faringites e amigdalites) S. agalactiae – sepse neonatal, meningite Streptococcus spp Os estreptococos de importância médica são divididos em : estreptococos beta-hemolíticos (ou estreptococos piogênicos), pneumococos, estreptococos do grupo D e streptococcus viridans Streptococcus sp (Características Gerais ) Cocos Gram Positivos; Colônias Pequenas e Translúcidas; Disposição aos pares ou em cadeias “Colar de contas”; A maioria são imóveis; Aeróbios ou Anaeróbios facultativos; Catalase negativa; São fastidiosos; Constituinte da Microbiota Normal (a maioria); A maioria possui importância clínica. Streptococcus Classificação/Identificação Morfologia das colônias e reações hemolíticas em ágar-sangue São beta-hemolíticos se provocam uma hemólise total, α-hemolíticos, se provocam uma hidrólise parcial, ou não hemolíticos Reações bioquímicas e resistência a fatores físicos e químicos Especificidade sorológica da substância da parede celular do grupo (Classificação de Lancefield) 20 grupos A-V de Lancefield Classificação Rebeca Lancefield (1933) Antígeno da parede celular específico do grupo Carboidrato encontrado na parede celular de muitos estreptococos e que forma a base do grupamento sorológico Grupo A – ramnose-N-acetilglicosamina Grupo B – ramnose-glicosamina Grupo C – ramnose-N-acetilgalactosamina Grupo D – glicerol ácido teicóico contendo D-alanina e glicose Grupo F – glicopiranosil-N-acetilgalactosamina Nome Subs. grupoespecifica Hemólise Habitat Critérioslaboratoriais Doenças comuns Spyogenes A Beta Garganta, pele Teste PYR+, inibido pela bacitracina Faringite, impetigo, febre reumática S agalactiae B Beta Trato genital feminino Hidrólise com hipurato, CAMP+ Sepse neonatal e meningite E fecalis D Nenhuma, alfa Cólon Crescena presença bile, hidrolisa esculina, não cresce a 6.5%NaCl, PYR+ Abscessos abdomiais, infeção trato urinário, endocardites S bovis D Nenhuma Cólon Crescena presença bile, hidrolisa esculina, não cresce a 6.5%NaCl, degradação amido Endocardite, isolado sanguineo comum no cancer de cólon S anginosus F (A,C,G) Beta Garganta, cólon, tratogenital feminino GrupoA resistentes a bacitracina, PYR- Padrões de fermentaçãode carboidratos Infecções piogênicas Estreptococosviridans S mutans, mitis, saguis Nãotipável Alfa, nenhuma Boca,garganta, cólon, trato genital feminino Resistentes a optoquina, colonias insolúveis em bile. Fermentação carboidratos Cáriesdentárias S pneumoniae Nenhuma Alfa Garganta Susceptíveis a optoquina, colonias solúveis em bile. Reação de quellung + Pneumonia, meningite,endocardite Peptostreptococcus nenhuma Nenhuma,alfa Boca, cólon, trato genital feminino Anaeróbiosobrigatórios abscessos Streptococcus pyogenes (Características das Principais Espécies ) Grupo A de Lancefield; São -Hemolíticos (Hemólise Total em ágar Sangue); Sensível à Bacitracina Provocam Infecções nas Vias aéreas superiores e pele; Febre reumática, glomerulonefrite (natureza imunológica); Possui várias toxinas e enzimas (hemolisinas): Virulência e patogenicidade Patogênese A maioria das infecções causadas por S.pyogenes tem início nas vias aéreas superiores (faringe) ou na pele. As infecções podem ser superficiais ou profundas. As infecções profundas podem ser letais e podem ser acompanhadas de bacteremia e choque. Faringites As faringites são causadas por vírus e bactérias, sendo entre as bacterianas em torno de 90% são causadas pelo S.pyogenes. A infecção é transmitida por gotículas infectadas provenientes de pacientes com o mesmo tipo de processo. Piodermites É uma infecção purulenta da derme que acomete principalmente crianças com hábitos higiênicos precários. A bactéria penetra na derme através de lesões da epiderme. Em 50% dos casos a infecção é mista com a participação de Staphylococcus aureus. Erisipela Trata-se de uma infecção aguda da pele que se caracteriza por vermelhidão da área afetada, dor local, febre, calafrios. Fascite necrosante Infecção profunda do tecido conjuntivo subcutâneo, se caracteriza por destruição do tecido muscular e gorduroso e se dissemina ao longo do plano facial. Síndromestóxicas As mais comuns são a escarlatina e o choque tóxico. A escarlatina é uma complicação das faringites causadas por amostras de S.pyogenes lisogenizadas por fagos. A escarlatina é uma doença contagiosa que se manifesta através de dor de garganta semelhante a uma amidalite/amigdalites, de uma erupção cutânea (manchas vermelhas), vômitos, língua cor de framboesa O choque tóxico caracteriza-se por febre, calafrios, mal-estar geral, náuseas, hipotensão, e choque, promovendo a falência múltipla de órgãos. Sequelas pós-estreptocócicas Febre Reumática Caracteriza-se por lesões inflamatórias não supurativas (acompanhadas por pus), envolvendo o coração, as articulações,os tecidos celular subcutâneo e sistema nervoso central. Streptococcus agalactiae (Características das Principais Espécies ) Grupo B de Lancefield; São -Hemolíticos (Hemólise Total em ágar Sangue); Provocam Infecções na Via Genito-Urinária; Resistente à Bacitracina; Prova de CAMP positiva; Hidrolisa o Hipurato de Sódio. Patogênese O S.agalactiae pode colonizar assintomaticamente a vagina de mulheres e causar infecções graves em recém-nascidos. Uma etapa crítica na doença invasiva do recém-nascido é a colonização do reto-vaginal da mulher grávida. A ruptura das membranas placentárias favorece a colonização fetal. Há evidencias que o S.agalactiae pode penetrar no líquido amniótico através da placenta e causar infecções fulminantes no feto. A aspiração do liquido amniótico contaminado pelo feto, pode levar a bactéria para os alvéolos pulmonares, onde proliferará abundantemente. Streptococcus pneumoniae (Características das Principais Espécies ) Pneumococos; Apresenta-se aos pares (em forma de “Chama de Vela”; Pneumonia bacteriana (90% dos casos); -Hemolíticos (Hemólise Parcial); Sensível à Optoquina (5µg/mL). Patogênese A infecção pneumocócica tem início com a colonização da nasofaringe pelo microorganismo. A partir da região inicialmente colonizada, os pneumococos podem alcançar o ouvido médio, e os pulmões através dos brônquios. Podem também entrar na corrente circulatória. Doenças -Pneumonia É uma infecção aguda, normalmente precedida de um estado gripal. A pneumonia ocorre quando os microorganismos sobrevivem a fagocitose pelos macrófagos pulmonares e proliferam-se nos alvéolos, onde sofrem autólise promovendo a liberação de substâncias que provocam inflamação. - Meningite O S.pneumoniae é um dos agentes mais comuns da meningite purulenta. Pode resultar de bacteremias primárias mais muitas vezes se instala em associação a otites, sinusites e pneumonias. Streptococcus Grupo Viridans (Características das Principais Espécies ) Microbiota normal da boca, mucosas, pele e Intestino; Principais espécies: Streptococcus sanguis, salivarius, mitis, mutans Ocasionalmente causam processos endocárdicos -Hemolíticos (Hemólise Parcial); Resistentes à Optoquina (5µg/mL). Streptococcus Grupo D Características das Principais Espécies Classificação segundo Lancefield; , ou (-Hemolíticos – a maioria) ; Microbiota Intestinal; Hidrolisam a Bile; Não crescem em meio hipertônico (6,5% NaCl); Infecções Genito-Urinárias. Streptococcus (Principais Provas de Identificação Laboratorial ) Catalase; Hidrólise do Hipurato; Prova de CAMP; Hidrólise da Esculina; Tolerância a Caldo Salgado (NaCl 6,5%); Sensibilidade à Optoquina; Sensibilidade à Bacitracina. Resumo de Identificação Streptococcus Provas Bioquímicas ( Identificação dos Streptococcus ) Prova da Catalase Streptococcus é catalase negativo Hidrólise do Hipurato Capacidade de hidrolisar o hipurato em seus componentes glicina e ácido benzóico Estreptococo semeado em caldo com hipurato de sódio e incubado 18-24h a 35-37°C Revelação de glicina livre: acrescentar ao meio de cultura o reativo da ninhidrina reação positiva = aparecimento de coloração azul-escura (roxo) Revelação do ácido benzóico: adicionar cloreto férrico ao meio de cultura prova positiva = formação de um precipitado abundante (que perdura por mais de 10 minutos) reação positiva reação negativa O CAMP test é usado na identificação dos Streptococcus do grupo B. O teste de CAMP depende da interação entre o fator CAMP (um produto dos Streptococcus do grupo B), com a beta-hemolisina do S. aureus. Teste da CAMP Inocular estria única de amostra de S. aureus produtor de beta lisina. Inocular amostra a serem testadas em estrias formando um angulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococos. Resultado positivo (S. agalactiae – grupo B) = alargamento da zona de lise, forma de ponta de flecha Prova de CAMP Teste da Hidrólise da Esculina e do NaCl 6,5% Hidrólise da bile esculina e tolerância ao cloreto de sódio (6.5%). Estes testes são usados para identificação presuntiva das espécies de Enterococcus e Streptococcus do grupo D (Streptococcus bovis). Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D não enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerância ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos são positivos. Sensibilidade à Optoquina Usada para diferenciar o Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans. A presença de uma zona de inibição de crescimento de 14 mm em volta de um disco de optoquina de 6 mm identifica o Streptococcus pneumoniae. Provas Bioquímicas ( Identificação dos Streptococcus ) Sensibilidade à Optoquina M-1 M-2 M-1: Streptococcus viridans M-2: Streptococcus pneumoniae Teste da bacitracina– semear placa de agar sangue com estreptococo a ser identificado e colocar disco de bacitracina (0.004U). Incubar e observar zona de inibição Teste do sulfametoxazol Trimetoprim (SXT)– semear placa de agar sangue com estreptococo a ser identificado e colocar disco de SXT. Incubar e observar zona de inibição O teste de susceptibilidade a bacitracina é usado para identificação presuntiva do Streptococcus grupo A (sensíveis). Alguns Streptococcus não pertencentes ao grupo A também podem ser inibidos pela bacitracina. Nesta situação, o teste da bacitracina deve ser realizado juntamente com o disco de sulfametoxazol-trimetropim. Os Streptococcus do grupo A são sensíveis a bacitracina, mas resistentes ao sulfametoxazol-trimetroprim. Os grupos C,F,G, são sensíveis a bacitracina e a sulfametoxazol-trimetropim. Sensibilidade à bacitracina Provas Bioquímicas Identificação dos Streptococcus Sensibilidade à Bacitracina Streptococcus pyogenes PYR Teste do Pyr (Hidrólise do L-pyrrolidonyl-N-naftilamida). Este teste serve para identificação dos Streptococcus pyogenens do grupo A e espécies de Enterococos. Pode substituir a bacitracina / sulfametoxazol – trimetropim e NaCl 6.5%. Teste do PYR– determinar atividade da enzima PYR(pyrrolidonyl-aminopepetidase) produzida pelo S. pyogenes e Enterococcus sp. Inocular colônia isolada no disco contendo substrato da enzima e revelar com reagente cromogênico para PYP. Resultado positivo = coloração rosa ou avermelhada O aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo S. pyogenes e Enterococcus sp são PYR positivos Enterococcus (Características das Principais Espécies ) Antigo Representante dos Streptococcus Grupo D; Principais espécies faecalis, faecium, bovis -Hemolíticos (Sem Hemólise), mas também pode apresentar padrões , ou -Hemolíticos ; Microbiota Intestinal; Hidrolisam a Bile; Crescem em meio hipertônico (6,5% NaCl); Infecções Genito-Urinárias. Identificação Enterococcus sp Enterococcus Catalase (-) NaCl 6,5% (+) Bile esculina (+) ou hemólise Sorbitol (+) Manitol(+) Rafinose (-) ou hemólise Sorbitol (-) Manitol(+) Rafinose (+) ou hemólise Sorbitol (-) Manitol(+) Rafinose (-) faecalis faecium gallinarum Slide profa Juliana Lins
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