Marcadores moleculares Técnica de Biologia Molecular
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Marcadores moleculares Técnica de Biologia Molecular


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Marcadores Moleculares
Nathalia A. Noda
Orientadora: Ana Lúcia Kern
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO GRANDE DO SUL
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA 
Porto Alegre, 2019
Roteiro
Introdução
Marcadores bioquímicos 
Isoenzimas 
Marcadores de DNA 
Hibridização
RFL
PCR
RAPD
AFLP
SCAR
Porto Alegre, 2019
SNP e InDel
Microssatélites 
STS
Aplicações dos marcadores moleculares
Introdução
	Marcadores moleculares são descritos como toda características fenotípica ou qualquer segmento de DNA que sejam transmitidos dos pais para as progênies e que permitam a análise de similaridade e diversidade genética entre indivíduos.
Podem detectar polimorfismo.
Porto Alegre, 2019
Introdução
	Uma longa molécula de DNA constitui um cromossomo, juntamente com tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA torna-se possível determinar pontos de referência nos cromossomos, esses pontos são denominados \u201cmarcadores moleculares\u201d
Porto Alegre, 2019
Marcadores bioquímicos
Isoenzimas
São formas moleculares múltiplas de enzimas que estão presentes em um mesmo organismo ou espécie.
O controle de seus genes é feito por um ou vários genes situados em um mesmo locus ou em loci diferentes. 
Alto grau de diferenciação entre variedades 
Necessidade de maior qntd de marcadores para mostrar todo o genoma.
Podem ser detectados, isolados e diferenciados por:
Cromatografia
Filtração
Eletroforese e outros. 
Porto Alegre, 2019
Apresentam outras limitações dependendo do estudo ou atividade. 
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Marcadores moleculares de DNA
Baseados em hibridização 
RFLP
Baseados em PCR
Amplificação Aleatória (RAPD / AP-PCR)
AFLP
SNP e InDel
Microssatélites
STS
SCAR
Expressão codominante
Expressão codominante
Expressão dominante
Porto Alegre, 2019
RFLP
	Polimorfismo para comprimento de fragmentos de restrição (Restriction fragmente length polymorphism) consiste na hibridização de sequências específicas de DNA (sondas) com o DNA total digerido por enzimas de restrição dos indivíduos a serem analisados. 
	
Os RFLPs podem ser causados por:
mudanças de pares de bases,
rearranjo de DNA, 
inserção e/ou deleção.
diversidade natural na sequência de nucleotídeos entre ou dentro de populações.
	
Porto Alegre, 2019
Baseados em hibridização
Polimorfismo são diferenças genéticas entre indivíduos de uma população causadas por variações nas sequências de bases do DNA. 
Sonda de DNA é grande com 5000pb
Sonda cDNA é pequena com 2000pb 
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RFLP
Procedimento para construir marcadores RFLP
DNA das amostras deve ser extraído e purificados
A solução de extração contém um tampão que estabiliza o pH = 8.
Um sal para dissociar as proteínas do DNA
Um agente dispersante para solubilizar as membranas.
Um agente inativador das DNAases, com o EDTA.
2. DNA é tratado com enzimas de restrição
Mais utilizadas: EcoR I, Hind III, BamH I e Pst I
3. Fragmentos de DNA são separados por eletroforese em gel de agarose
2 a 15 \u3bcg de DNA são colocados em cada canaleta do gel
Posteriormente, os fragmentos do DNA são transferidos por capilaridade para uma membrana.
Porto Alegre, 2019
Baseados em hibridização
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RFLP
Procedimento para construir marcadores RFLP
	RFLPs não podem ser diretamente visualizadas no gel, deve-se então:
Desnaturar o DNA
Transferir esse DNA para a membrana (capilaridade/vácuo)
\u201cCarimbar\u201d a mancha do gel para a membrana
Material será fixado na membrana por luz UV ou T=80ºC
DNA pode ser visualizado com sondas apropriadas que localizam os fragmentos complementares a essas sondas. 
As sondas são marcada com fosforo radioativo e depois pode ser visualizada ao ser exposta em uma placa do tipo usada em radiografias com raio X. 
Porto Alegre, 2019
Baseados em hibridização
NÃO VISUALIZAÇÃO : pois a mistura formada pelos diversos fragmentos de DNA de diferentes comprimentos forma um arraste contínuo no Gel. 
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Esquema RFLP
Porto Alegre, 2019
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RFLP
Vantagens
Todo o genoma em estudo pode ser analisado 
Nº de RFLPs é praticamente ilimitado 
Estudo sobre diversidade genética entre indivíduos, população, melhoramento genético para detectar formas semelhantes e divergentes 
	
Desvantagens
Não pode ser utilizado na construção de mapas genéticos 
Processo não automatizado
Caro, trabalhoso, muitas e
	
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Baseados em hibridização
1. pois as sondas utilizadas podem ser obtidas de regiões transcritas (cDNA), que são normalmente regiões de cópia única, ou de DNA genômico clonado ao acaso.
2. pois podem ser usadas diferentes enzimas de restrição, associação delas e diferentes sondas.
3.
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PCR
	Técnica de reação em cadeia da polimerase, PCR, consiste na replicação do DNA in vitro, catalisada por uma DNA polimerase. Com a presença de:
dATP, dCTP, dTTP, dGTP. 
Oligonucleotídeos sintéticos (primers)
	Cada ciclo de PCR envolve:
Desnaturação do DNA alvo
Anelamento dos primers 
Extensão da síntese da nova fita dupla de DNA
As fitas sintetizadas passam a funcionar como molde para os próximos ciclos. 
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Apresentam outras limitações dependendo do estudo ou atividade. 
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PCR
	Ao fim de vários ciclos, teremos, muitas cópias da região delimitada pelos primers. 
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RAPD
Baseados em PCR
	Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso, RAPDs, oferece a oportunidade de gerar grande quantidade de polimorfismo de fragmentos de DNA, usando amplificação por PCR.
		Não necessita de conhecimento da sequência alvo de DNA e nem a seleção trabalhosa de sondas. 
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Espalhados por todo genoma
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RAPD
Baseados em PCR
Vantagens
Execução simples 
Rápida
Barata
\u201cprimer universal\u201d
Automatização
	
Vantagens
DNA repetitivo
Identifica apenas um dos alelos
Dominância 
Perda de informação em relação aos RFLPs
Baixa reprodutibilidade dos resultados (sensibilidade da técnica)
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Dominância \u2013 não distingue homo e heterozigotos
	Assim, em uma população apenas duas classes podem ser diferenciadas:
	a)	A que não apresenta a banda em questão (homozigoto recessivo).
	b)	A que apresenta a banda (homozigoto dominante ou heterozigoto).
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AFLP
Baseados em PCR
	Polimorfismo no comprimento dos fragmentos amplificados, amplificação do DNA para detectar diferenças em um conjunto de fragmentos selecionados e digeridos com enzimas de restrição. 
Análise simultânea de várias regiões do genoma
Alta reprodutibilidade 
Independente de hibridização 
Grande nº de bandas podem ser obtidas variando as enzimas de restrição com primers e nº diferente de nuclotideos. 
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AFLP
Baseados em PCR
	O polimorfismo provém de mutações no sítio de restrição e na sequencia adjacente ao sítio de restrição. Também de InDel\u2019s dentro dos fragmentos amplificados. 
	Como construir um marcador AFLP
Digerir o DNA com duas enzimas de restrição (= 3 fragmentos)
Ligar adaptadores com seq. conhecida nas duas extremidades de cada fragmento. 
Amplificação seletiva do conjunto de fragmentos usando primers com sequência complementar à sequência do adaptador seguida de sequência específica do sítio de restrição da enzima e uma extensão de nucleotideos seletivos na extremidade 3\u2019
Porto Alegre, 2019
1 - fragmento cortado nas duas extremidades com a enzima de corte raro, fragmentos cortados com as duas enzimas.
2 \u2013 os adaptadores AFLP consistem de uma sequência principal do adaptador seguida de uma sequência específica da enzima de restrição
3 - O uso desses primers seletivos reduz a quantidade de fragmentos de DNA
Apenas os fragmentos que contêm os nts seletivos no sítio de restrição são amplificados.
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AFLP
Baseados em PCR
4. Produtos da PCR colocados no gel de poliacrilamida