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Transgenia
Biotecnologia vegetal
Ferramentas:
\u2013 Fisiologia vegetal:
\u2022 cultura de tecidos
\u2013 Biologia molecular:
\u2022 DNA recombinante
\u2022 Marcadores moleculares
\u2013 Engenharia genética
\u2022 transgenia
Transgenia
\u2022 Etapas:
\u2013 Isolar/clonar um gene de interesse e manipulá-lo \u2013 TECNOLOGIA 
DO DNA RECOMBINANTE
\u2013 Introduzi-lo na espécie de interesse \u2013 TRANSFORMAÇÃO
Transgenia em plantas
Vantagens:
- Autofecundação
- Grande progênie
- Totipotência
Desvantagens:
- Parede celular
- Poliploidia
- Variação somaclonal
- Dificuldade de 
regeneração
DNA recombinante
Clonagem gênica
Biblioteca genômica
Clonagem gênica
Expressão em bactéria
Transformação de
espécie vegetal
+ promotor bacteriano
(+ peptídio fusionado)
(+ seq. sinalizadora)
+ modificações
transcriptase
reversa
Biblioteca genômica
Biblioteca gênica/ de cDNA
Transformação
Transferência gênica em 
plantas:
\u2022 Agrobacterium \u2013 bem 
estabelecido para 
dicotiledôneas
\u2022 Bombardeamento \u2013
independente de espécie e 
para organela
\u2022 Eletroporação \u2013 requer 
protoplastos com regeneração
\u2022 Microinjeção \u2013 requer 
equipamentos e mão-de-obra 
altamente especializada e 
muito pouco eficiente
...
Agrobacterium
\u2022 Patógeno de planta encontrado 
no solo
\u2022 Infecta diversos hospedeiros
\u2022 Transfere seu DNA para o 
núcleo da planta com genes que 
estimulam a síntese hormonal
\u2022 DNA transferido é incorporado 
ao genoma da planta
\u2022 Produção hormonal alterada 
leva ao desenvolvimento de 
galha
Agrobacterium
200 kb
T-DNA:
\u2022 Opinas:
- nopalina e octopina
- sintetizadas pela planta
- nutriente para Agrobacterium
\u2022 Produção de tumor 
(iaaM, iaaH, iptZ):
-induz produção de auxina e
citocinina
Plasmídio Ti:
Genes de virulência (vir):
- transformação
- transferência do T-DNA
Genes bacterianos também são
importantes para transformação
Agrobacterium
vir
Transformação por sistema binário:
Vetor binário:
\u2022 T-DNA:
\u2022 Bordas (LB/RB): 25 pb \u2013 repetições imperfeitas
\u2022 sítios de clonagem
\u2022 gene de interesse com promotor \u2013 35S, induzível...
\u2022 genes marcadores \u2013 resistência a antibiótico...
\u2022 antibiótico para E. coli
Vetor ajudante Ti (mantido em Agrobacterium):
\u2022 vir
Vetor de transformação
LB RB
Transformação por co-integração
Transformação por sistema binário
Transformação por Agrobacterium
através de calo
Agrobacterium
4 \u2013 7 semanas
através de disco foliar
Imersão floral em Arabidopsis
solução com Agrobacterium
Agrobacterium
Plântulas de sementes transgênicas
crescendo em meio seletivo
Transgenia
Bombardeamento
Características:
\u2022 Projétil de tungstênio ou 
ouro
\u2022 1 µm de diâmetro
\u2022 430 m/s
\u2022 mesófilo de folhas, 
culturas\u2026
Vantagens:
\u2022 transformação de mono 
e dicotiledôneas
\u2022 transformação de 
organelas
Revólver de hélio
Bombardeamento
GUS: \u3b2-glicuronidase
X-glicuronide
Bombardeamento
Atividade de gene
reporter:
Bombardeamento
Southern blot
Seleção por gene
marcador
Confirmação da transgenia:
\u2022 Evidência molecular:
- Southern blot:
inserção única
uma ou mais cópias do gene de interesse
- PCR
\u2022 Expressão gênica e evidência fenotípica: 
- atividade de gene reporter
- Northern blot:
presença de transcrito
- Seleção por marcador
- Fenótipo desejado
\u2022 Análise de herança
Transgenia
Transgenia
clonagem gênica
transferência gênica
integração genômica
seleção para expressão
transmissão sexual