Esfregaço Sanguíneo

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UNIVERSIDADE POSITIVO
AGATHA LOUISE BRANDTNER
ISABELLE DAISY BOCHOSQUI 
KAROLINE INGE HERTEL 
LARA THAÍS ALVES DE SOUZA CARVALHO 
MELISSA ROCHA LEONARDO
THAYS STEINBERG
ESFREGAÇO SANGUÍNEO
CURITIBA
2019
AGATHA LOUISE BRANDTNER
ISABELLE DAISY BOCHOSQUI 
KAROLINE INGE HERTEL 
LARA THAÍS ALVES DE SOUZA CARVALHO 
MELISSA ROCHA LEONARDO
THAYS STEINBERG
ESFREGAÇO SANGUÍNEO
Trabalho acadêmico apresentado à disciplina de Imunologia do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Positivo, como requisito para a obtenção de parte da nota parcial do primeiro bimestre. 
 Professora: Márcia Regina Pincerati
CURITIBA
2019
INTRODUÇÃO 
As células do sangue geralmente são estudadas em esfregaços preparados pelo espalhamento de uma gota de sangue sobre uma lâmina, onde as células ficam estiradas e separadas, o que facilita a observação ao microscópio óptico (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). Em geral, este teste é realizado para a contagem e a identificação de anormalidades nas células sanguíneas já que, através dessa técnica, é possível analisar a morfologia das células, estimar um valor para o número de leucócitos e plaquetas no sangue de um determinado indivíduo e ainda investigar distúrbios hematológicos ou a presença de parasitas que possam acometer o paciente.
A observação das células sanguíneas por meio dessa técnica se dá pois os esfregaços são corados com misturas especiais que contêm eosina (corante ácido), azul de metileno (corante básico) e azures (corantes básicos de cor púrpura). São muito utilizadas as misturas de Leishman, Wright e Giemsa, designadas com os nomes dos pesquisadores que as introduziram. Com essas misturas de corantes, as estruturas acidófilas tornam-se de cor rosa, as basófilas, de cor azul e as que fixam os azures, ditas azurófilas, de cor púrpura (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). 
O sangue é formado pelos glóbulos sanguíneos e pelo plasma, parte líquida, na qual os primeiros estão suspensos. Os glóbulos sanguíneos são os eritrócitos ou hemácias, as plaquetas (fragmentos do citoplasma dos megacariócitos da medula óssea) e diversos tipos de leucócitos ou glóbulos brancos. Ele é principalmente um meio de transporte. Por seu intermédio, os leucócitos, células que desempenham várias funções de defesa e constituem uma das primeiras barreiras contra a infecção, percorrem constantemente o corpo, atravessam por diapedese a parede das vênulas e capilares e concentram-se rapidamente nos tecidos lesionados ou atacados por microrganismos, nos quais desempenham suas funções defensivas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). 
Os eritrócitos, ou hemácias dos mamíferos são anucleados e contêm grande quantidade de hemoglobina, uma proteína transportadora de O2 e CO2, devido à abundante presença dessa proteína, essas células coram-se com eosina (ABBAS, 2015). Por serem as células existentes em maior quantidade no sangue e não apresentarem núcleo, são facilmente distinguidas das células do sistema imune.
Os neutrófilos, também chamados de leucócitos polimorfonucleares, constituem a população mais abundante de células brancas sanguíneas circulantes e medeiam as fases iniciais das reações inflamatórias. O citoplasma contém grânulos de dois tipos. A maioria, chamada de grânulos específicos, é preenchida com enzimas tais como lisozima, colagenase e elastase. Estes grânulos não coram fortemente nem com corantes básicos nem com corantes acídicos (hematoxilina e eosina, respectivamente), que distinguem os grânulos dos neutrófilos daqueles de dois outros tipos de granulócitos circulantes, chamados de basófilos e eosinófilos (ABBAS, 2015). Desta forma, é possível identificá-los pela coloração rosa-claro do seu citoplasma e por seu núcleo multilobado. Os basófilos constituem menos de 1% dos leucócitos sanguíneos. Embora normalmente não estejam presentes nos tecidos, os basófilos podem ser recrutados para alguns locais inflamatórios e contêm grânulos que se ligam a corantes básicos (ABBAS, 2015). Esses grânulos são facilmente vistos através do microscópio óptico na técnica de esfregaço sanguíneo pois são grandes e corados com azul escuro. Os eosinófilos são granulócitos sanguíneos que expressam grânulos citoplasmáticos contendo enzimas que são danosas às paredes celulares de parasitas, mas também podem danificar os tecidos do hospedeiro. Os grânulos dos eosinófilos contêm proteínas básicas que ligam corantes acídicos tais como eosina. Assim como os neutrófilos e basófilos, os eosinófilos são derivados da medula óssea (ABBAS, 2015). Seus numerosos grânulos se coram em vermelho-alaranjado e seu núcleo aparece, normalmente, como bilobado.
Os monócitos têm entre 10 a 15 µm de diâmetro e apresentam um núcleo em formato de feijão com citoplasma finamente granular contendo lisossomos, vacúolos fagocíticos e filamentos de citoesqueleto. Basófilos são granulócitos sanguíneos com muitas similaridades estruturais e funcionais com os mastócitos. Assim como os granulócitos, os basófilos são derivados de progenitores da medula óssea (uma linhagem diferente da dos mastócitos), amadurecem na medula óssea e circulam no sangue (ABBAS, 2015). Em geral, diferencia-se das demais células por seu núcleo em formato de ferradura ou feijão e seus grânulos pouco aparentes. Os linfócitos, as únicas células da imunidade adaptativa, são as células exclusivas no corpo que expressam receptores de antígenos clonalmente expressos, cada um específico para um determinante antigênico diferente. Cada clone de linfócitos T e B expressa receptores de antígenos com uma única especificidade, que é diferente das especificidades dos receptores em outros clones (ABBAS, 2015). Essas células apresentam um núcleo grande, deixando o citoplasma pouco aparente, mas não é possível, através do esfregaço sanguíneo, diferenciar os linfócitos T e B.
OBJETIVO
Identificar e diferenciar os principais tipos celulares pertencentes ao sistema imune.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
•	Lancetas descartáveis
•	Luva cirúrgica
•	Etanol 70%
•	Algodão
•	Lâminas de microscopia
•	Lâminas extensoras
•	Solução de ciclohexadienos 0,1%
•	Solução de azobenzenosulfônicos 0,1%
•	Solução de fenotiazinas 0,1%
•	Água deionizada
•	Microscópio óptico
3.2. Procedimentos
3.2.1. Esfregaço
Depois de efetuada a limpeza das lâminas de microscopia para eliminação de gorduras e outros materiais contaminantes, duas integrantes da equipe se ofereceram como voluntárias para retirada da gota de sangue para a realização do procedimento. Cada qual fez a assepsia do dedo com o algodão embebido em etanol 70% e, usando uma lanceta descartável, foi perfurado o dedo, coletado o sangue e colocada uma amostra diretamente na lâmina de microscopia. Logo em seguida, com o auxílio da lâmina extensora num ângulo de 45° e com um movimento de vai e volta, foi feita a extensão do sangue por toda a lâmina. Em seguida, a mesma foi agitada para que a amostra secasse e pudesse ser mergulhada em solução com os corantes necessários para a coloração das células sanguíneas. 
3.2.2. Coloração
Após a secagem completa da amostra, a lâmina foi inserida cuidadosamente na solução de ciclohexadienos 0,1% e deixada em repouso por 10 segundos, em seguida foi retirada e deixada escorrer por mais 5 segundos. Foi então inserida cuidadosamente na solução de azobenzenosulfônicos 0,1% e deixada em repouso por 10 segundos e em seguida retirada e deixada escorrer por mais 5 segundos. Por fim, foi inserida vagarosamente na solução de fenotiazinas 0,1% e deixada em repouso por 20 segundos. Posteriormente, a lâmina foi retirada para escorrer por 10 segundos e em seguida foi lavada com a água deionizada e deixada para secar em temperatura ambiente. Com papel toalha foi tirado o excesso de água sem que retirasse parte da amostra contida na lâmina e então foi feita a observaçãoem microscópio óptico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Para a análise do esfregaço sanguíneo é de extrema importância a obtenção de uma extensão sanguínea sublime, ou seja, livre de falhas e paradas, não muito espesso, nem fino demais e sem falhas na cauda. Além disso, a análise em microscópio óptico deve ser realizada em uma região específica da extensão, a qual não possua em excesso nem uma insuficiência de células. Para esta prática, o esfregaço obtido foi como necessário, sem falhas e com formação de cauda, formando uma camada delgada e uniforme, e a coloração realizada após a secagem do esfregaço foi satisfatória, permitindo a análise, diferenciação e classificação morfológica das células do sistema imune presentes na amostra. 
Após a secagem dos corantes utilizados para a coloração do esfregaço, foi possível realizar a análise da amostra em microscópio óptico. Nesta análise, foi possível observar e diferenciar a maioria das células que compõem o sistema imune através da morfologia e coloração, dentre elas estão os Neutrófilos, Basófilos, Eosinófilos, Monócitos e Linfócitos. Das células citadas, somente uma não foi observada durante a prática: o Basófilo. Essa célula realiza a defesa contra parasitas, o que torna sua visualização muito rara e pouco se sabe sobre sua contribuição para a defesa imune. Os eosinófilos também são mais dificilmente visualizados, pois eles estão relacionados à defesa contra parasitas e reações alérgicas. Neste caso, foi possível observá-lo devido a reações alérgicas apresentadas pelo organismo do qual proveu a amostra. Já neutrófilos, monócitos e linfócitos são visualizados com mais frequência, onde os neutrófilos são as células mais numerosas e importantes na resposta imune inata, os monócitos se diferenciam em macrófagos nos tecidos, realizando a fagocitose e os linfócitos também realizam a fagocitose e contem lisossomos ricos em enzimas que facilitam a destruição dos microrganismos infecciosos. 
CONCLUSÃO 
Para a obtenção de resultados satisfatórios na análise do esfregaço sanguíneo existem inúmeros fatores que interferem no mesmo, estando entre eles a extensão sanguínea, que deve formar uma cauda e sem apresentar falhas, e a coloração, que deve ser feita de forma correta, ou seja, após a secagem da amostra e na ordem correta dos corantes a serem utilizados. Assim, com o auxílio de um microscópio óptico, é possível distinguir as diferentes células que compõem o sistema imune, as quais possuem características morfológicas e colorações distintas. Além disso, há células que são mais fáceis ou mais difíceis de serem visualizadas, devido a sua função durante a resposta imunológica. 
Referências Bibliográficas
JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 12. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2013.
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 8. ed. Elsevier Editora, 2015.
CAPUTO, L. F. G. Manual da disciplina de histotecnologia do curso técnico de Pesquisa em Biologia Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2008.