Aula 17 - Extração de ácidos nucleicos PDF

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Biologia Molecular
Técnicas - Aula III
Extração
de RNA
Fabio Hecht
biologiamolecularufrj@gmail.com
Tipos de extração
A extração por fenol-clorofórmio é uma 
extração do tipo líquido-líquido. Essas 
extrações são métodos que separam misturas 
de moléculas baseando-se na diferença de 
solubilidade de cada molécula em dois meios 
que não se misturam. 
A extração de fase sólida é um tipo de extração 
onde os componentes que estão dispersos ou 
dissolvidos em uma solução são retirados dessa 
solução baseando-se na afinidade dessas 
moléculas por um substrato sólido. Os kits de 
extração funcionam dessa maneira.
Extração por coluna de sílica
Recomendado para RNAs maiores que 200 nucleotídeos. Não serve para microRNAs! Embora rRNA 5S, 5.8S e tRNAs
sejam maiores que 200 nucleotídeos, não são eficientemente extraídos. Estas colunas são otimizadas para mRNA!
Matriz de dióxido de silício (SiO2)
Etanol + Tampão de lise
(ou fenol –> menos comum)
Extração por coluna de silica
Tampão de lise 
Tampão com detergente, tiocianato de guanidina (agente 
desnaturante, inibe RNAse) e β-mercapto-etanol (inibe RNAse 
e é também um potente agente redutor)
A enorme estabilidade das RNAses se deve, em parte, as inúmeras pontes 
dissulfeto intramoleculares presentes em sua estrutura. O betamercapto-
etanol reduz as pontes dissulfeto e desnatura irreversivelmente essa enzima.
Tampão de lise
(ou fenol –> menos comum)
Extração por coluna de silica
Tampão de lise 
Tampão com detergente, tiocianato de guanidina (agente 
desnaturante, inibe RNAse) e β-mercapto-etanol (inibe RNAse 
e é também um potente agente redutor)
A enorme estabilidade das RNAses se deve, em parte, as inúmeras pontes 
dissulfeto intramoleculares presentes em sua estrutura. O betamercapto-
etanol reduz as pontes dissulfeto e desnatura irreversivelmente essa enzima.
Extração por coluna de silica
Tubo 
coletor Coluna
Matriz de 
sílica
RNA
Sais
Proteínas
DNA
2) Tampão RW1 (contém etanol e 
guanidina: remove proteínas, lipídeos, 
parte do DNA, carboidratos e RNAs
menores que 200 bases)
3) Tratamento com DNAse remove o DNA
5) Tampão RPE (composto por 
etanol 80%, remove sais)
6) Água RNAse-free recupera o RNA
4) Tampão RPE (composto por 
etanol 80%, remove sais)
1) Amostra (tampão de lise+etanol) 
é adicionada na coluna de silica
Os tampões mencionados são nomes 
comerciais do Kit da marca Qiagen®, 
outros fabricantes darão outros 
nomes para os tampões similares
Molécula capaz de inativar RNAses
Mecanismo: modificação covalente de resíduos de histidina (principalmente), 
lisina, cisteína e tirosina. 
Utilização: Adiciona-se 0,1% (v/v) de DEPC na água por pelo menos 2 horas à 
37C. Assim esta água torna-se livre de RNAses (RNAse-free). Tubos e utensílios 
do laboratório podem ser tratados dessa maneira.
Para se livrar do DEPC, basta autoclavar a água por 15-30 minutos.
Obs: Etanol e CO2 podem ser formados como subprodutos da destruição do 
DEPC, atrapalhando algumas reações enzimáticas.
abreviado DEPC, do inglês diethylpyrocarbonate
Dicarbonato de dietila (DEPC)
Extração fenol/clorofórmio
Fenol/Clorofórmio: agentes desnaturantes
Rompe células e remove as proteínas associadas ao DNA/RNA
A mistura de clorofórmio com fenol é mais eficiente para desnaturar 
proteínas do que as duas substâncias sozinhas. 
O fenol pode reter até 15% da água da fase aquosa, o que poderia 
causar perda de parte do RNA. A mistura com clorofórmio evita que 
isso aconteça, aumentando o rendimento da extração.
Uma mistura fenol/clorofórmio típica pode ser 1:1 ou 5:1 (v/v). 
Em pH ácido, nenhum DNA é encontrado na fase aquosa, enquanto 
uma mistura 1:1, embora consiga extrair o máximo de RNA, também 
pode levar algum DNA para fase aquosa.
Álcool Isoamílico também pode ser adicionado na mistura para evitar 
a formação de espuma. Sais de guanidina foram incorporados para 
inativar nucleases.
Fenol
Clorofórmio
Agente caotrópico e desnaturante
Função na extração de RNA: 
inativar RNAses (mais eficiente 
que o fenol e clorofórmio)
A incorporação do tiocianato de 
guanidina foi uma otimização do 
método fenol/clorofórmio. Este 
método, tal como é usado hoje, 
foi publicado em 1987
Tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio (ácida)
Tiocianato de guanidina
Guanidina tiocianato-fenol-clorofórmio (ácida)
Nomes comerciais:
Sigma-Aldrich TRI Reagent
Invitrogen TRIzol
Bioline Trisure
Tel-Test STAT-60
Extração por fenol/clorofórmio
Fenol + Tiocianato
(TriReagent®)
Extração por fenol/clorofórmio
+ Clorofórmio 
Fenol + Tiocianato
(TriReagent®)
Formação de fases após centrifugação
Fase aquosa (fase polar)
A água da mistura fica nesta fase, junto 
com moléculas polares como o RNA
Fase orgânica (fase apolar)
Contém o fenol e o clorofórmio, e nele estão 
diluídas as proteínas, lipídios e açúcares
Fase intermediária
Fina camada onde se encontra o DNA
Fenol: 1,07 g/cm3
Clorofórmio: 1,47 g/cm3
Água: 1,00 g/cm3
Protocolo de extração
1. Remover o meio de cultura e lavar as placas 
com 3-5mL de PBS
2. Adicionar 1mL de Tri Reagent® 
(Fenol+Guanidina da marca Sigma-Aldrich)
3. Raspar a placa vigorosamente durante 1 
minuto
4. Transferir o fenol da placa para um tubo de 
1,5mL
5. Adicionar clorofórmio (quantidade de 
clorofórmio = 1/5 do volume de fenol)
6. Vortexar por pelo 
menos 20 segundos
7. Centrifugar 10 minutos à 14.000 RPM à 4ºC
Atividade Função
1. Remover células mortas (não-aderidas), debris celulares 
e moléculas indesejadas
2. Romper as células e desnaturar as proteínas que 
interagem com DNA/RNA
3. Soltar mecanicamente as células aderidas do fundo da 
placa de petri, melhorando a extração
4.
. 
5. O clorofórmio, ao se juntar com o fenol, otimiza a 
desnaturação e leva a formação das fases
6. Importantíssimo para garantir que fenol e clorofórmio 
se misturem adequadamente
7. Acelera o processo: faz com que a separação das fases, 
que demoraria horas, aconteça em alguns minutos
Protocolo de extração
8. Remover delicadamente a fase aquosa e 
transferir para um novo tubo
9. Adicionar 500uL de isopropanol sob a fase 
aquosa e vortexar
10. Aguardar 10 minutos à temperatura 
ambiente e centrifugar 14.000 RPM por 10’
11. Descartar o sobrenadante, sem encostar no 
pequeno pellet de RNA que se formou
12. Adicionar 1mL de etanol 75%, vortexar e 
centrifugar 14.000 RPM por 10’
13. Descartar o etanol, retirando o máximo 
possível, e deixar os tubos secarem
14. Ressuspender o pellet “seco” de RNA com 
30uL de água RNAse-free (Água DEPC)
Atividade Função
8. Separar a fase que contém o RNA (fase aquosa) da fase 
que contém DNA (interfase) e proteína (orgânica) 
9. Como o RNA não se solubiliza em isopropanol, a adição 
de isopropanol fará com que o RNA precipite
10. Promove a precipitação do RNA, fazendo com que saia 
da solução e vire um precipitado (pellet)
11. Remove o isopropanol, para que junto com ele sejam 
eliminados os contaminantes da fase aquosa
12. A “lavagem” do pellet faz com que os contaminantes 
sejam realmente removidos
13. Eliminar todo o etanol, que atrapalharia o uso do RNA 
nas reações que faremos em seguida
14. Solubiliza o RNA em um volume pequeno de água, 
fazendo com que ele fique bastante concentrado, 
como precisamos que ele esteja
Análise do RNA extraído
Espectrofotômetro NanoVue (GE)
Como calcular a concentração:
Uma unidade de absorbância em 260nm corresponde a 44μg de RNA por mL (em pH neutro)
Como calcular a pureza:
260/230 à Indica se a amostra está contaminada por fenol. Valor ideal = 2,00 
260/280 à Indica se a amostra está contaminada por proteínas. Valor ideal = 2,00 
Ácidos nucleicosabsorvem em 260nm
Proteínas 
absorvem em 280nm
Fenol e outros 
contaminantes 230nm
Tampão de amostra
Xileno Cianol
Azul de 
Bromofenol
RNA
Glicerol
Tampão de amostra
Xileno Cianol
Azul de 
Bromofenol
RNA
Glicerol
Brometo 
de etídio
(ou similares)
EM ALGUNS CASOS, A MOLÉCULA INTERCALANTE JÁ ESTÁ NO TAMPÃO DE AMOSTRA
Migração
Sem Ultra-Violeta Com UV + Brometo de Etídio
Xileno Cianol
Azul de 
bromofenol
28S
18S
5S
Para géis de RNA, evite xileno cianol!
Guanidina tiocianato-fenol-clorofórmio (ácida)
O que um gel de RNA deve ter:
1. Boa definição das banda 28S + Banda18S + 
eventualmente a banda 5/5,8S 
2. A razão entre a intensidade das bandas 
28S/18S deve ser próximo de 2,00
3. Não ter “arraste” abaixo da banda 18S
4. Não ter material preso no poço (típico sinal 
de contaminação do DNA genômico)
28S
18S
5S
Guanidina tiocianato-fenol-clorofórmio (ácida)
Contaminação com DNA genômico
Degradação
Obs: estas amostras não são RNA, mas o aspecto da contaminação com DNA genômico em amostras de RNA 
com contaminação é como mostrado nesta imagem
Guanidina tiocianato-fenol-clorofórmio (ácida)