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ATIVIDADE DA ENZIMA INVERTASE LIVRE EM FUNÇÃO DO PH Gabriela Cristina Bariona, Marina Martinsa, Tayná Camila Cortez Maroldia a Departamento de Engenharia de Alimentos - Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo 5790, 87020- 900, Maringá, Paraná, Brasil. RESUMO Amplamente utilizada na indústria alimentícia, a enzima invertase é responsável pela catalisação da reação de hidrólise da sacarose, convertendo-a em glicose e frutose, ou seja, o açúcar invertido. Devido a essa grande utilidade, é muito importante entender os parâmetros que influenciam em sua atividade. Um desses parâmetros é o pH e estudos apontam que a invertase possui elevada atividade na faixa de pH entre 3,5 e 5,5, sendo o pH ótimo igual a 4,5. Dessa forma, o experimento propõe verificar essa influência do pH na atividade enzimática pelo método das velocidades iniciais à temperatura ambiente. Sendo a concentração de glicose e frutose determinada pelo método do DNS Berkeley modificado. Os resultados obtidos confirmam a teoria de que o pH ótimo de atividade enzimática é o 4,5. 1 INTRODUÇÃO As enzimas são biomoléculas responsáveis pela catálise de diferentes reações em sistemas biológicos. Através da diminuição da energia de ativação reacional, elas possibilitam que a vida possa ocorrer em condições amenas de temperatura e pressão. Industrialmente, esse fato vem despertando muito interesse, pois permite a economia de energia a ser aportada aos processos de conversão, gera menos co-produtos e resíduos, sendo parte de um sistema ambientalmente amigável. (MOURA et al, 2007) A invertase ou sacarase, é a enzima responsável pela liberação do resíduo L-D- fructofuranosidio não-redutor, a partir da molécula de dissacarídeo. Seu substrato preferencial é a sacarose, resultando na sua hidrólise uma molécula de glicose e outra de frutose, porém, também, pode hidrolisar ramonose e estaquiose. (MOURA et al, 2007) Como mencionado, as enzimas possuem grande importância industrialmente e, como tal, a invertase possui papel fundamental em muitos processos de produtos alimentícios. Dessa forma, entender seu funcionamento frente a parâmetros como o pH é essencial para explorar da melhor forma sua utilização nesses processos. Portanto, o objetivo do experimento foi determinar a atividade da enzima invertase pelo método das velocidades iniciais à temperatura ambiente, nos pHs 4,0, 4,5 e 5,0. 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 ENZIMAS As enzimas são fundamentais para qualquer processo bioquímico. Agindo em sequências organizadas, elas catalisam as centenas de reações sucessivas pelas quais as moléculas nutrientes são degradadas, a energia química é conservada e transformada e as macromoléculas biológicas são sintetizadas a partir de moléculas precursoras simples. Todas as enzimas são proteínas e a sua atividade catalítica depende da integridade da sua conformação proteica nativa. (LEHNINGER, 2002). Muitas reações bioquímicas comuns envolvem eventos químicos que são desfavoráveis ou improváveis no ambiente celular. Uma enzima contorna esses problemas fornecendo um ambiente específico onde uma dada reação é energicamente mais favorável. A característica que distingue uma reação catalisada enzimaticamente é a de ela ocorrer no interior dos limites de uma cavidade na enzima chamada sítio ativo. (LEHNINGER, 2002). 2.2 PARÂMETROS 2.2.1 Concentrações Um dos principais fatores que afetam a atividade enzimática é a concentração do substrato. Entretanto, estudar os efeitos da concentração do substrato é complicado pelo fato de a concentração variar durante o curso de uma dada reação, à medida que o substrato é convertido em produto. Uma abordagem simplificada é medir a velocidade inicial da reação quando a concentração do substrato é muito maior que a da enzima. Dessa forma, se o tempo da reação for suficientemente curto, as mudanças da concentração de substrato serão desprezíveis, podendo ser considerada constante. (LEHNINGER, 2002). A partir de estudos como esse, observa-se que o aumento da concentração de substrato (S) causa um aumento gradual na velocidade inicial da reação catalisada (V0). Os valores de V0 são calculados pela inclinação das curvas do gráfico de formação de produto com o tempo. V0 aumenta até que tende a atingir um patamar. A partir daí, V0 não se modifica muito, mesmo que sejam adicionadas quantidades crescentes de substrato. Essa situação é considerada como estando se aproximando da velocidade máxima da reação (Vmáx), uma situação em que todas as enzimas (E) estão com substratos ligados em seus sítios ativos, formando o complexo (ES). Caso seja utilizada uma concentração maior de enzimas, Vmáx será atingida com maiores concentrações de substrato. (BIANCONI, 2006) Figura 1: Gráfico da concentração de produto Figura 2: Gráfico da velocidade inicial V0 em função do tempo em função da concentração do substrato 2.2.2 pH O pH influencia a reação enzimática de algumas maneiras, sendo uma delas no processo catalítico, onde o mesmo requer que a enzima e o substrato tenham certos grupos químicos e um estado ionizado ou não-ionizado, de modo a interagirem, por exemplo, a atividade catalítica pode precisar que um grupo amino da enzima esteja na forma protonada e em pH alcalino, esse grupo não está protonado, logo, a velocidade da reação diminui. E a outra maneira quando se tem valores altos de pH, que podem levar à desnaturação da enzima (CHAMPE et al., 2006). As enzimas têm um pH ótimo (ou um intervalo de pH) no qual a sua atividade é máxima. Em um pH maior ou menor, a atividade diminui. Isso ocorre, pois, as cadeias laterais dos aminoácidos do centro ativo podem atuar como ácidos e bases fracas com funções críticas que dependem da manutenção de certos estados de ionização e, em algum lugar da proteína, as cadeias laterais ionizadas podem desempenhar um papel essencial nas interações que mantêm a estrutura da proteína. (LEHNINGER, 2002). 2.2.3 Temperatura A velocidade de uma reação enzimática aumenta com a temperatura até um pico de velocidade ser atingido devido ao aumento do número de moléculas com energia aceitável para atravessar a barreira de energia e formar os produtos de reação. Ao aumentar ainda mais a temperatura, ocorrerá uma redução na velocidade de reação devido a desnaturação da enzima, induzida pela temperatura (CHAMPE et al., 2006). 2.3 INVERTASE A enzima sacarase ou invertase (β-fructofuranosidase) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose (açúcar não redutor) em glucose e frutose (dois açúcares redutores, capazes de reduzir os íons férrico ou cúprico, presente no reagente de Fehling). Por definição, 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 µmol de sacarose a glicose e frutose por minuto, a pH 4,6 (25ºC). A reação pode seguir facilmente determinando a quantidade de açúcares redutores liberados por ação da enzima, utilizando, por exemplo, a reação do ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS) (BARRETO, 2011). Ao contrário à maioria das outras enzimas, a invertase exibe uma atividade relativamente alta em uma ampla gama de pH, de 3,5 a 5,5, com o ótimo pH próximo a 4,5. (WANG, 2009). A invertase enzima tem grande importância pois foi a primeira proteína a ser identificada como um biocatalisador. Os princípios fundamentais da enzimologia foram realizados a partir de estudos com a invertase, como a hipótese de chave-fechadura para atividade enzimática, a equação de Michaelis-Menten, o conceito de ponto isoelétrico e a hipótese de Briggs & Haldane, em que o complexo formado entre enzima e substrato não representa um equilíbrio, mas sim um estado estacionário. (MOURA, PINTO e RODRIGUES, 2007).Industrialmente, as invertases têm seu maior campo de aplicação na área de alimentos, especialmente na preparação de geleias, balas, doces e xaropes. No processo de fabricação de xaropes, seu uso tem vantagens significativas. Na sua forma imobilizada, essa enzima também apresenta potencial na fabricação de xaropes, o que permitiria sua utilização em várias bateladas ou de forma contínua e, também, na preparação de biossensores, que permitiriam a quantificação em tempo real, e dentro de bioreatores de concentração de sacarose em meios fermentativos. (MOURA, PINTO e RODRIGUES, 2007). 3 MATERIAIS E MÉTODO 3.1 MATERIAIS - Béquer; - Água destilada; - Pipetas automáticas; - Tubos de ensaio (com tampas); - Balão volumétrico; - Solução da enzima invertase; - Cronômetro; - Solução de sacarose a 5% p/v; - pHmetro; - Termômetro; - Recipientes para banhos de aquecimento e resfriamento; - Solução DNS; - Proveta; - Papel alumínio; - Agitador magnético; - Espectrofotômetro. 3.2 MÉTODO O método utilizado para determinar a atividade da enzima livre foi o método das velocidades iniciais em reator batelada (béquer) com 50 mL de solução de sacarose nos pH’s 4,0, 4,5 e 5,0. Ao atingir a temperatura ambiente, a solução referente a cada pH foi colocada sob agitação em agitador magnético e retirou-se 0,5 mL da solução antes de colocar a enzima a fim de utilizar como o branco. Após, foi adicionado 0,5% mL de solução de invertase solubilizada na concentração de 0,1 mol/L. A cada cinco minutos, durante 30 minutos foi retirado 0,5% mL de amostra que foram adicionadas em um tubo contendo 2,5 mL de água destilada. Conforme fosse adicionando a amostra, os tubos foram levados a um banho contendo água em ebulição e deixados por 10 minutos com intuito de inativar a enzima. Pelo método de dosagem do DNS Berkeley-modificado foi possível determinar o teor de glicose e frutose em cada pH para que a atividade enzimática fosse determinada, utilizando a curva padrão da aula anterior. Sendo assim, a partir de cada leitura de absorbância das amostras, a quantia de glicose + frutose foi calculada com auxílio da curva padrão de glicose + frutose. Como a equação da reta é do tipo 𝑦 = 𝑎 ± 𝑏𝑥 (Equação 01), onde: a= Coeficiente linear da reta; b= Coeficiente angular da reta; x= Concentração da glicose (mg/mL); y= Absorbância da amostra a equação da glicose + frutose presente na amostra foi calculada por 𝑀𝐺 = (𝑦−𝑎) 𝑏𝑑 (Equação 02) onde d= diluição da amostra. Após esse cálculo, foi determinado o número de micromoles de glicose + frutose presentes na amostra por: 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 = 𝑀𝐺 𝑀𝑀 𝑉𝑟 (Equação 03) em que: MG= quantia de glicose + frutose formada na reação (mg/mL); MM= peso molecular glicose + frutose (0,360 mg/𝜇mol); Vr= volume de reação (mL) no tempo considerado que está na tabela 1. Com o cálculo de 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 foi possível construir o gráfico 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 x tempo e adquirir a equação da reta: 𝑦1 = 𝑎1 + 𝑏1𝑡 (Equação 04), sendo a1= Coeficiente linear da reta; b1= Coeficiente angular da reta; t= tempo de reação (min); y1 = 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 Para a construção do gráfico foi medido a absorbância referente a cada amostra de cada pH e calculado glicose + frutose, completando tabelas iguais a Tabela 1 para cada valor de pH. Tabela 1: Determinação da Atividade Enzimática pelo Métodos das Velocidades Iniciais - pH 4,0. Tempo de reação (min) Volume de reação (mL) Diluição da amostra (d) Absorbância Glicose + frutose presente (mg/mL) Micromoles de glicose + frutose (𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠) 0 50,0 1:6 5 49,5 1:6 10 49,0 1:6 15 48,5 1:6 20 48,0 1:6 25 47,5 1:6 30 47,0 1:6 A atividade enzimática foi determinada em Unidade/mL, onde Unidade = 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒/𝑚𝑖𝑛e b1 = 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒, dado por: 𝐴 = 𝑏1 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑎 (Equação 05); E a atividade específica é encontrada por: 𝐴𝑒 = 𝐴 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎 (Equação 06); sendo o teor de proteína da enzima solúvel 0,171 mg de proteína/mL de solução. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Após utilizar a equação 1 a 4 foi possível completar as tabelas referente à cada pH e construir o gráfico referente a cada pH para o cálculo da atividade específica da enzima: Tabela 1: Determinação da Atividade Enzimática pelo Métodos das Velocidades Iniciais - pH 4,0. Tempo de reação (min) Volume de reação (mL) Diluição da amostra (d) Absorbância Glicose + frutose presente (mg/mL) Micromoles de glicose + frutose (𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠) 0 50,0 1:6 0 0 0 5 49,5 1:6 0,001 0,006 0,825 10 49,0 1:6 0,006 0,036 4,900 15 48,5 1:6 0,023 0,138 18,592 20 48,0 1:6 0,035 0,21 28,000 25 47,5 1:6 0,061 0,366 48,292 30 47,0 1:6 0,087 0,522 68,150 Tabela 2: Determinação da Atividade Enzimática pelo Métodos das Velocidades Iniciais - pH 4,5. Tempo de reação (min) Volume de reação (mL) Diluição da amostra (d) Absorbância Glicose + frutose presente (mg/mL) Micromoles de glicose + frutose (𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠) 0 50,0 1:6 0 0 0 5 49,5 1:6 0 0 0 10 49,0 1:6 0,023 0,138 18,783 15 48,5 1:6 0,059 0,354 47,692 20 48,0 1:6 0,096 0,576 76,800 25 47,5 1:6 0,134 0,804 106,083 30 47,0 1:6 0,169 1,014 132,383 Tabela 3: Determinação da Atividade Enzimática pelo Métodos das Velocidades Iniciais - pH 5,0. Tempo de reação (min) Volume de reação (mL) Diluição da amostra (d) Absorbância Glicose + frutose presente (mg/mL) Micromoles de glicose + frutose (𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠) 0 50,0 1:6 0 0 0 5 49,5 1:6 0 0 0 10 49,0 1:6 0 0 0 15 48,5 1:6 0,012 0,072 10,000 20 48,0 1:6 0,022 0,132 18,333 25 47,5 1:6 0,038 0,228 31,667 30 47,0 1:6 0,055 0,330 45,833 Sendo os respectivos gráficos representados por: Figura 3: Gráfico representativo do pH 4,0. Figura 4: Gráfico representativo do pH 4,5. Figura 5: Gráfico representativo do pH 5,0 Figura 6: Gráfico representativo comparando os três pHs. Por meio das equações 05 e 06 foi possível encontrar a atividade enzimática referente aos três pHs, sendo a atividade específica para o pH 4,0, 4,5 e 5,0: 26,941 U/mg, 55,751 U/mg e 18,309 U/mg, respectivamente. Analisando os resultados da atividade específica de cada pH, pode-se observar que para o pH 4,5 a atividade foi maior que a encontrada nos outros dois tendo também o R² maior e mais próximo de 1. O pH do meio influencia diretamente a reação enzimática, tendo em vista que no pH ótimo a atividade é máxima Denison et al., (2013) observaram que o pH ótimo da enzima invertase está entre 4 e 5. Barbosa (2009) utilizando a enzima extraída de células de Saccharomyces cerevisiae encontrou o valor ótimo de pH como 4,5. Outros autores também encontraram esses valores de pH ótimo para a enzima invertase. (GÁSCON et al., 1981; ANDJELKOVIC et al., 2009). 5 CONCLUSÃO Com a realização do experimento foi possível avaliar a atividade enzimática da invertase à temperatura ambiente e frente à variação de pH nos seguintes valores: 4,0, 4,5 e 5,0. Através dos dadosexperimentais, dos cálculos realizados e da análise gráfica foi possível concluir que o pH ótimo para a atividade enzimática da invertase à temperatura ambiente foi 4,5. O valor obtido corresponde ao encontrado por diversos autores como Gáscon, 1981 e Barbosa, 2009, ambos utilizaram a invertase extraída de microrganismos do gênero Saccharomyces. Analisando a relação entre a concentração de glicose e frutose no decorrer do tempo, conclui-se que a concentração aumenta com o aumento do tempo. Isso se deve ao fato de que quanto maior o tempo de exposição, maior é a quantidade de açúcar invertido formado. Em relação às atividades enzimáticas e específicas obtivemos 4,607 U/mL e 26,941 U/mg para o pH 4,0; 9,533 U/mL e 55,751 U/mg para o pH 4,5 e 3,131 U/mL e 18,309 U/mg para o pH 5,0. Confirmando a maior atividade da invertase em pH 4,5. 6 REFERÊNCIAS ANDJELKOVIC, U., et al. Purification and characterization of Saccharomyces cerevisiae external invertase isoforms. Food Chemistry. 2009. BARBOSA, Eduardo Fernandes. Avaliação da atividade da invertase de Saccharomyces cerevisiae imobilizada em polianilina sobre o caldo de cana. 2009. 62 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biologia, Biologia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2009. BARRETO, Maria do Carmo. Estudo cinético da enzima invertase, 2011. Disponível em: <http://www.barreto.uac.pt/bq2_prat/01invertase_introd.pdf>. Acesso em: 18 out. 2017. BIANCONI, M Lucia. Efeito da Concentração de Substrato na Atividade Enzimática. 2006. Disponível em: <http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/concn_subst.htm>. Acesso em: 18 out. 2017. CHAMPE, P.C.; HARVEY. R. A.; FERRIER, D.R. Bioquímica Ilustrada. 3 ed. São Paulo: Artmed, 2006.cap 5. p. 54-63. DENISON et al. EFEITO DA AÇÃO ENZIMÁTICA. 2013. Disponível em: <https://www.passeidireto.com/arquivo/2239180/efeito-da-acao-enzimatica>. Acesso em: 18 out. 2017. GÁSCON S., NEUMANN N. P., LAMPEN J. O. Comparative study of the properties of the purified internal and external invertase from yeast. The Journal of Biological Chemistry, v. 3, p. 33-38, 1981. MOURA, Cynthia Ladyane Alves de; PINTO, Gustavo Adolfo Saavedra; RODRIGUES, Sueli. Determinação da Atividade de Invertase em Extratos Enzimáticos. 2007. Disponível em: <https://www.embrapa.br/web/mobile/publicacoes/publicacao/426318/ determinacao-da- atividade-de-invertase-em-extratos-enzimaticos>. Acesso em: 18 out. 2017. NELSON, D. L.; COX, M. Lehninger – Princípios de Bioquímica. 3ed. São Paulo: Sarvier, 2002. WANG, Nam Sun. Enzyme Kinetics of Invertase via Initial Rate Determination. 2009. Disponível em: <https://eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htm>. Acesso em: 18 out. 2017.
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