Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Professores: Bruno Portela Brasileiro Renata Faier Calegario DNA recombinante, PCR e Eletroforese UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 060- Biotecnologia Vegetal BIOLOGIA MOLECULAR ❖ Possibilita a manipulação de moléculas => introdução de genes em um genoma receptor ✓ Enzimas cortar, copiar e colar o DNA ✓ Bases nitrogenadas Tecnologia do DNA recombinante Depende: Enzimas Arthur Kornberg DNA polimerase DNA ligase Martin Gellert Werner Arber Enzimas de restrição Plasmídeos Stanley Cohen ✓ Clivar DNA com enzimas de restrição ✓ Inserir DNA eucariótico em bactérias ✓ Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA ✓ Amplificar e sintetizar DNA ✓ Recombinar fragmentos de DNA, etc. DNA RECOMBINANTE Ferramenta permite: MANIPULAÇÃO DO DNA Enzimas de Restrição Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA • Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar moléculas de DNA exógeno) • Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA • Reconhecem sequências de 4 a 8 nucleotídeos • Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 5’... ...5’ ...3’ 3’... 5’... 3’... ...5’ ...3’ Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’ Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta) ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com extremidades coesivas > eficiência de ligação ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas: ✓ Abreviação de 3 letras do nome da espécie ✓ Seguida da designação da linhagem ✓ Número Romano: se mais de uma enzima é produzida Denominação Origem Sequência de Reconhecimento ENZIMAS DE LIGAÇÃO ✓ Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´) ✓ Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição Ex: T4 DNA ligase DNA DNA3’ OH - O O 5’P O - O DNA DNA3’ O O 5’ O P - O + DNA-Ligase ATP ou NAD DNA RECOMBINANTE DNA RECOMBINANTE DNA RECOMBINANTE Reação em cadeia da polimerase (PCR) Kary Mullis “A revelação me ocorreu numa noite enluarada de sexta-feira de abril de 1983, enquanto dirigia por uma estradinha tortuosa nas montanhas do norte da Califórnia que atravessa uma floresta de sequóias”. TESTES MOLECULARES PCR: Polymerase Chain Reaction ✓ Método in vitro para produzir DNA ✓ Baseado nas propriedades do DNA: Reação de Polimerização em cadeia Elementos necessários: DNA molde: Proveniente de extração Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers e nucleotídeos Kary Mullis: 1983 Prêmio Nobel: 1993 Desnaturação e Renaturação REPLICAÇÃO X PCR Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA? DNA molde Abertura das fitas = helicase Adição de nt = síntese Primers = Primase Nucleotídeos Temperatura Primer: desenhar DNA: extrair Nt Sintéticos DNA polimerase CÉLULA IN VITRO Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf) • DNA extraído: 20 a 200ng • dNTPs: Nucleótidos livres A, T, C, G • Par de Primers (iniciadores) => anelando nas bordas da região a ser amplificada • Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus (estável em T°) • Tampão 10X: estabiliza pH • MgCl2: ajuda ligação dos primers e cofatores (Mg+2) Taq REAÇÃO DE PCR H2O dATP dCTP dTTP dGTP Primer 5’ - 3’ Primer 3’ – 5’ Taq DNA Polimerase Mg+2 Tampão 10X dNTPs Figura: http://slideplayer.com.br/slide/366864/ DNA 25µL => Amplificação da sequência específica do DNA = amplicon => Tamanho e sequência definidos => Grande quantidade Ao final da Reação: PCR Equipamento necessário: Termociclador Propicia ciclos de temperaturas Desnaturação = 94°C Anelamento = 54°C Extensão = 72°C 1 Ciclo ✓ Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar ✓ Adicione o DNA por último na reação: evita transferência de amostras de DNA de um tubo para outro ✓Faça sempre um controle negativo, sem DNA. Prepare-o por último - representativo da manipulação ✓Controle positivo: material conhecidamente positivo PCR Recomendações: PRIMERS O QUE É UM PRIMER? ✓ Sequência de nucleotídeos complementar às extremidades da sequência alvo do DNA ✓ Tamanho: 17-24 nucleótidos ✓ Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA a ser amplificado COMO FAZER UM PRIMER ? ✓ Conhecer a sequência do gene ✓ Lembrar: Polimerização sempre 5’-3’ PRIMERS …GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTC AACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGT TATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACC ATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTT GTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTG ATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAG ATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTG TTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGG CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG... 5’- - 3’ Sequência do Gene 5’…GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’ 3’…CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC.…5’ 5’…CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3’ 3’- GTGATACGCTTACCAGATGC…5’ Fita 1 - Molde Fita 2 - Complementar Fita 1 - Molde Fita 2 - Complementar PRIMERS 5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’ Sequência do Primer Forward (Left) Amplifica Fita 5’- 3” molde Sequência do Primer Reverse (Right) 5’- CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3’ Amplifica Fita 5’ - 3’ Complem. ✓ Tamanho: 17-25 bases ✓ Composição: 50% C+G ✓ Extremidade 3’com G ou C ✓ Evitar três ou mais Gs ou Cs (3´): Anelamento inespecífico em regiões ricas em G ou C ✓ Evitar primers F e R com complementaridade de bases (dímeros de primers) ✓ Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin, estruturas secundárias) PRIMERS Características desejáveis dos Primers ✓ Determina o anelamento específico ✓ Temperatura alta: maior especificidade ✓ Temperatura baixa: menor especificidade ✓ Depende da %GC ✓Temp. Anelamento: ~ 5º C abaixo do menor Tm do par de primers ✓Tm varia de 55-72oC : Tm dos dois primers próximas PRIMERS Condições de Anelamento TEMPERATURA Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C) Melting Temperature (TM) = Temperatura Desnaturação Fórmula de Wallace PRIMERS 5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’ Sequência do Primer Forward (Left) Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4) Tm = 58°C TA = 53°C PCR Equipamento necessário: Termociclador Propicia temperaturas distintas Desnaturação = 94°C Anelamento = 54°C Extensão = 72°C 1 Ciclo REAÇÃO DE PCR Anelamento ou Primer Forward Primer Reverse Forward Reverse REAÇÃO DE PCR REAÇÃO DE PCR 1° CICLO APÓS REAÇÃO Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica Quantidade de cópias = 2 n Onde, n = n° de ciclos 2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos “primers” serve como molde para síntese de uma nova fita. ANÁLISE DA PCR Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse ➢ Eletroforese: Análise em gel de agarose • Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento) • Marcador conhecido: para estimar o peso molecular • Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV Presença de Banda = Positivo Ausência de Banda = Negativo • Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanho do fragmento de DNA amplificado ANÁLISE DA PCR Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002 (A) Esquema da localização relativa no gene dos primers utilizados para os experimentos de PCR e o isolamento do Vip3A B) Resultados de amplificação para a cepa HD125, confirmando a presença do gene, que demonstrou ser 99,8% idêntico à sequência de nucleotídeos publicada para o gene Vip3A(a) Detecção do gene Vip3A em cepas transformadas Bacillus turingiensis ANÁLISE DA PCR Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A, compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum Rep CP - Apresenta alguns falsos positivos - Importante controles +/- - Sensível (fentograma: 10-18) - Rápido - Grande n° amostras Vantagens: Desvantagens: PCR Controle positivo = amostra conhecidamente positiva Controle negativo = sem DNA Controle negativo = com DNA, sem primer PCR - Detecção de genes em DNA genômico - Clonagem de DNA - Sequenciamento - Evolução molecular - Análise de estrutura genômica - Identificação de mutações - Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas - Teste de paternidade APLICAÇÕES ..... DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades diferentes => formam diferentes bandas ✓ Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob ação de um campo elétrico ✓ Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica COMO ANALISAR O DNA ❖ Método para separar ácidos nucleicos e proteínas Eletroforese DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo • Gel Agarose = agarose (polissacarídeo) => separação de fragmentos pequenos e grandes • Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros) => separação de proteínas ou partículas muito pequenas ELETROFORESE ✓ Meios de suporte sólido ✓ Visualização das bandas: corantes de DNA • Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico) • SYBRGreen • GelRed Moléculas se ligam ao DNA ELETROFORESE ELETROFORESE - + Gel Cuba de eletroforese Gel Fonte Luz UV ELETROFORESE http://www.jove.com/video/3923/electroforese-em-gel-de-agarose-para-separao-dos- fragmentos-de-dna?language=Portuguese LABORATÓRIO DE BIOMOL Recomendações: ✓ Uso de luvas e Material estéril ✓ Soluções autoclavadas ✓ Exceção: enzimas, detergentes, DNA e RNA, etc ✓ Água: deionizada (autoclavada) ✓Cuidado com soluções tóxicas, carcinogênicas e teratogênicas: Brometo de etídeo, Fenol, Clorofórmio, βME, Luz UV. INTRODUÇÃO Isolamento do DNA da planta = Extração de DNA ✓ Fundamental para análise de DNA exógeno no genoma vegetal 1º Passo para Técnicas Moleculares de detecção • PCR = Presente ou ausente • Southern Blot = Nº de cópias Confirmar a integração do DNA exógeno EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Diferentes protocolos => variam em função da espécie e do tecido a ser utilizado ✓ Reflete a variabilidade da composição bioquímica de diferentes plantas e tecidos Maioria dos protocolos => variação de 2 protocolos básicos • Dellaporta et al (1983) • Doyle & Doyle, (1987) Baseado na utilização do detergente CTAB Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos por acetato de potássio na presença de SDS Romper as membranas celulares para liberação do DNA Romano, 1998 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Você deve ter em mente: ✓ Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos, proteínas e polissacarídeos ✓ Manter Integridade: informação/sequência ✓Polifenois e polissacarídeos = interferem na atividade de enzimas usadas para manipulação de DNA => ligases, polimerases e enzimas de restrição ✓ Use tubos plástico novos e esterilizados => O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o) EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Etapas básicas de protocolos de extração ✓ Lise celular = liberar o DNA • N2 líquido • Diretamente no Tampão de extração Tampão de extração • Tris pH 8.0 e 9.0 = mantém pH (desfavorável às DNAses, pH 7.0) • EDTA = agente quelante Mg+2 e Ca+2 (co-fator de DNAses) • β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas => DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS ✓ Tampão de extração (continuação) • NaCl = auxilia na dissociação de proteínas ligadas aos ácidos nucleicos (íons rompem ligações de cadeias polipeptídicas) • CTAB e SDS = detergentes = auxiliam na lise das membranas celulares (libera os componentes) Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA Usado para precipitar o DNA seletivamente • RNAse = elimina RNA ✓ Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos • Fenol • Clorofórmio:álcool isoamílico Fase aquosa (superior): DNA + Contaminantes (Polissacarídeos e RNAs) Interface: proteínas desnaturadas Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos ✓ Recuperação do DNA: Precipitação • Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita • Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos • Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos Centrifugação EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS ✓ Lavagem do DNA: remoção de sal • Etanol 70% EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB Romano, 1998 CTAB, NaCl, Tris, EDTA, β me, H2O ✓ Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA (oxidação) ✓ Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso e muito viscoso ✓ Presença de DNAses endógenas: visualização do DNA genômico em gel de agarose – degradado (arraste vertical) EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Problemas comumente encontrados: Baixa qualidade do DNA PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES R o m an o & B ra sl ei ro , 1 9 9 8 Continuação Romano & Brasileiro, 1998 PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES ANÁLISE DA EXTRAÇÃO ➢ Análise da OD em espectrofotômetro • DNA absorve luz no 260 nm / Proteínas a 280 nm • 1 OD 260 = 50 mg de DNA DNA = leitura DO260 x 50 x fator de diluição • Parâmetro da qualidade do DNA => Relação DO260/DO280 Valores < 1,8 => contaminação com proteínas Valores >1,8 => contaminação com fenol Avaliação DNA purificado: Concentração e Pureza ➢ Eletroforese: Análise em gel de agarose • Concentração: 0,8% e 1% • Marcador: DNA de concentração conhecida (Padrão) • Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV • Amostras comparadas aos padrões, determinando-se as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra ANÁLISE DA EXTRAÇÃO ANÁLISE DA EXTRAÇÃO 1Kb = 1000pb ANÁLISE DA EXTRAÇÃO Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas 1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz http://www.uniscience.com/homogeneizador/bullet-blender-next-advance Sorgo Folha Arroz Folha Trigo Kit de extração DNA HiPurA™ - Hemedia Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida 5 Min 30 Min Tratamento com Topoisomerase ANÁLISE DA EXTRAÇÃO A dupla-hélice enrola-se sob si mesma Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo superenrolamentos HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex Teste de complementaridade DNA Southern Blot Northern Blot RNA Sonda: sequência complementar de DNA alvo SOUTHERN BLOT Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico COMO? Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA ✓ Sondas Radioativas = nt 32P ✓ Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica ou quimioluminescente) Nick Translation Marcação por Random primers • DNAse: digestão controlada • DNA polimerase I • Atividade exonucleásica = retira nt do lado 5’-P do corte • Atividade polimerásica = adiciona nt do lado 3’-OH do corte Marcação de Sonda • Primers aleatórios anelam vários pontos do DNA • dNTPs marcados e não marcados • Fragmento Klenow da DNA polimerase I KIT DE MARCAÇÃO Kit Dig DNA Labeling: Randon Primers Produto PCR purificado Fervido: 100° C/10 min => Gelo PCR desnaturado Nt (primers aleatórios - hexameros) dNTP- Digoxigenina Enzima Klenow DNA Polimerase I Δ 37°C 12hs Gel: Fragmentos DNA TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO SOUTHERN BLOT REVELAÇÃO Tratamentos: Depurinação Desnaturação Neutralização - - -- - - - - -- - - -- - Lavagens Retira excesso de sonda DNA imobilizado Sonda fria Nucleotídeos marcados com digoxigenina E E E IgG anti-digoxigenina conjugadocom Fosfatase alcalina Membrana (+) Adição substrato NBT/BCIP: clivagem e precipitação sobre a membrana O QUE ACONTECE NA MEMBRANA Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos SOUTERN BLOT VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja Separou fragmentos Gel - 3hs Hibridização 18hs α32P: d-CTP 3 3 4 1 11 4 4 6 6 6 6 4 Cópias do transgene DNA total Hind III PCR Souther Blot ✓ Possibilita rearranjos complexos das inserções que podem levar a perda das mesmas ou ao silenciamento ✓ Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da planta, pelo efeito posicional das inserções (podem comprometer genes do metabolismo primário) Alto número de inserções do transgene: SOUTERN BLOT ✓ Importante para a expressão estável ✓ Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da real interação entre as moléculas Poucas cópias: SOUTERN BLOT Plantas Transgênicas de Batata DNA total digerido Eco RI 1 e 5: Marcador Peso Molecular 2 e 4: DNA total batata transgênica digerido com Eco RI 3: DNA total batata Não-transgênica digerido com Eco RI Southern Blot do gel ✓ Sensibilidade (fentograma) ✓ Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma ✓ Envio de membranas para outro laboratório ✓ Demorado ✓ Caro ✓ Perigoso (sondas radioativas) ✓ É limitada quando o local exato do gene de interesse é desconhecido SOUTHERN BLOT Vantagens: Desvantagens: - Importante experimentos de Transformação => Prova molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal - Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de alterações no material genético - Detecta fragmento específico em meio a milhões de fragmentos - Usado para distinguir estirpes de um organismo SOUTHERN BLOT APLICAÇÕES
Compartilhar