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Aula PCR e outras tecnicas

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Professores: Bruno Portela Brasileiro
Renata Faier Calegario
DNA recombinante, PCR e 
Eletroforese 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E 
FITOSSANITARISMO
AF 060- Biotecnologia Vegetal
BIOLOGIA MOLECULAR
❖ Possibilita a manipulação de moléculas
=> introdução de genes em um genoma receptor
✓ Enzimas cortar, copiar e colar o DNA
✓ Bases nitrogenadas
Tecnologia do DNA recombinante
Depende:
Enzimas
Arthur Kornberg 
DNA polimerase DNA ligase
Martin Gellert Werner Arber 
Enzimas de restrição 
Plasmídeos 
Stanley Cohen 
✓ Clivar DNA com enzimas de restrição
✓ Inserir DNA eucariótico em bactérias
✓ Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA
✓ Amplificar e sintetizar DNA
✓ Recombinar fragmentos de DNA, etc.
DNA RECOMBINANTE
Ferramenta permite:
MANIPULAÇÃO DO DNA
Enzimas de Restrição 
Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA
• Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar
moléculas de DNA exógeno)
• Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA
• Reconhecem sequências de 4 a 8 nucleotídeos
• Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
5’...
...5’
...3’
3’...
5’...
3’... ...5’
...3’
Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência 
das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’ 
Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta)
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com 
extremidades coesivas > eficiência de ligação
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas:
✓ Abreviação de 3 letras do nome da espécie
✓ Seguida da designação da linhagem
✓ Número Romano: se mais de uma enzima é produzida
Denominação Origem Sequência de Reconhecimento
ENZIMAS DE LIGAÇÃO
✓ Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os
nucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´)
✓ Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma
enzima de restrição
Ex: T4 DNA ligase
DNA DNA3’ OH
-
O O 5’P
O
-
O
DNA DNA3’ O O 5’
O
P
-
O
+
DNA-Ligase
ATP ou NAD
DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTE
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Kary Mullis 
“A revelação me ocorreu numa 
noite enluarada de sexta-feira de 
abril de 1983, enquanto dirigia por 
uma estradinha tortuosa nas 
montanhas do norte da Califórnia 
que atravessa uma floresta de 
sequóias”.
TESTES MOLECULARES
PCR: Polymerase Chain Reaction
✓ Método in vitro para produzir DNA
✓ Baseado nas propriedades do DNA:
Reação de Polimerização em cadeia
Elementos necessários:
 DNA molde: Proveniente de extração
 Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers e
nucleotídeos
Kary Mullis: 1983
Prêmio Nobel: 1993
Desnaturação e Renaturação
REPLICAÇÃO X PCR
Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA? 
DNA molde
Abertura das fitas = helicase
Adição de nt = síntese
Primers = Primase
Nucleotídeos
Temperatura
Primer: desenhar
DNA: extrair
Nt Sintéticos
DNA polimerase
CÉLULA IN VITRO
Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf)
• DNA extraído: 20 a 200ng
• dNTPs: Nucleótidos livres A, T, C, G
• Par de Primers (iniciadores)
=> anelando nas bordas da
região a ser amplificada
• Taq DNA polimerase: Thermus
aquaticus (estável em  T°)
• Tampão 10X: estabiliza pH
• MgCl2: ajuda ligação dos primers
e cofatores (Mg+2) Taq
REAÇÃO DE PCR
H2O
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
Primer
5’ - 3’
Primer
3’ – 5’
Taq DNA 
Polimerase
Mg+2
Tampão 10X
dNTPs
Figura: http://slideplayer.com.br/slide/366864/
DNA
25µL
=> Amplificação da sequência específica do DNA = amplicon
=> Tamanho e sequência definidos
=> Grande quantidade
Ao final da Reação:
PCR
Equipamento necessário:
 Termociclador
 Propicia ciclos de temperaturas
Desnaturação = 94°C
Anelamento = 54°C
Extensão = 72°C
1 Ciclo
✓ Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar
✓ Adicione o DNA por último na reação: evita transferência de
amostras de DNA de um tubo para outro
✓Faça sempre um controle negativo, sem DNA. Prepare-o por
último - representativo da manipulação
✓Controle positivo: material conhecidamente positivo
PCR
Recomendações:
PRIMERS
O QUE É UM PRIMER?
✓ Sequência de nucleotídeos complementar às extremidades
da sequência alvo do DNA
✓ Tamanho: 17-24 nucleótidos
✓ Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA a
ser amplificado
COMO FAZER UM PRIMER ?
✓ Conhecer a sequência do gene
✓ Lembrar: Polimerização sempre 5’-3’
PRIMERS
…GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTC
AACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGT
TATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACC
ATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTT
GTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTG
ATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAG
ATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTG
TTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGG
CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...
5’-
- 3’
Sequência do Gene
5’…GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’
3’…CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC.…5’
5’…CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3’
3’- GTGATACGCTTACCAGATGC…5’
Fita 1 - Molde
Fita 2 - Complementar
Fita 1 - Molde
Fita 2 - Complementar
PRIMERS
5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’
Sequência do Primer
Forward (Left)
Amplifica 
Fita 5’- 3” 
molde
Sequência do Primer
Reverse (Right) 5’- CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3’
Amplifica 
Fita 5’ - 3’
Complem.
✓ Tamanho: 17-25 bases
✓ Composição: 50% C+G
✓ Extremidade 3’com G ou C
✓ Evitar três ou mais Gs ou Cs (3´): Anelamento inespecífico em
regiões ricas em G ou C
✓ Evitar primers F e R com complementaridade de bases
(dímeros de primers)
✓ Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin,
estruturas secundárias)
PRIMERS
Características desejáveis dos Primers
✓ Determina o anelamento específico
✓ Temperatura alta: maior especificidade
✓ Temperatura baixa: menor especificidade
✓ Depende da %GC
✓Temp. Anelamento: ~ 5º C abaixo do menor Tm do par de primers
✓Tm varia de 55-72oC : Tm dos dois primers próximas
PRIMERS
Condições de Anelamento TEMPERATURA
Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C)
Melting Temperature (TM) = Temperatura Desnaturação
Fórmula de Wallace
PRIMERS
5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’
Sequência do Primer
Forward (Left)
Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4)
Tm = 58°C TA = 53°C
PCR
Equipamento necessário:
 Termociclador
 Propicia temperaturas distintas
Desnaturação = 94°C
Anelamento = 54°C
Extensão = 72°C
1 Ciclo
REAÇÃO DE PCR
Anelamento
ou
Primer Forward
Primer Reverse
Forward
Reverse
REAÇÃO DE PCR
REAÇÃO DE PCR
1° CICLO
APÓS REAÇÃO 
Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica
Quantidade de cópias = 2 n
Onde, n = n° de ciclos 
2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento 
Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos “primers”
serve como molde para síntese de uma nova fita.
ANÁLISE DA PCR
Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse
➢ Eletroforese: Análise em gel de agarose
• Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento)
• Marcador conhecido: para estimar o peso molecular
• Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV
Presença de Banda = Positivo
Ausência de Banda = Negativo
• Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanho
do fragmento de DNA amplificado
ANÁLISE DA PCR
Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
(A) Esquema da localização relativa no
gene dos primers utilizados para os
experimentos de PCR e o isolamento do
Vip3A
B) Resultados de amplificação para a cepa
HD125, confirmando a presença do gene, que
demonstrou ser 99,8% idêntico à sequência de
nucleotídeos publicada para o gene Vip3A(a)
Detecção do gene Vip3A em cepas transformadas Bacillus turingiensis
ANÁLISE DA PCR
Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco
Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A,
compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum
Rep
CP
- Apresenta alguns falsos positivos
- Importante controles +/-
- Sensível (fentograma: 10-18) 
- Rápido
- Grande n° amostras
Vantagens:
Desvantagens:
PCR
Controle positivo = amostra conhecidamente positiva
Controle negativo = sem DNA
Controle negativo = com DNA, sem primer
PCR
- Detecção de genes em DNA genômico
- Clonagem de DNA
- Sequenciamento 
- Evolução molecular
- Análise de estrutura genômica
- Identificação de mutações
- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas
- Teste de paternidade
APLICAÇÕES
.....
DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades
diferentes => formam diferentes bandas
✓ Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob 
ação de um campo elétrico
✓ Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica
COMO ANALISAR O DNA
❖ Método para separar ácidos nucleicos e proteínas 
Eletroforese 
DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo
• Gel Agarose = agarose (polissacarídeo)
=> separação de fragmentos pequenos e grandes
• Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros)
=> separação de proteínas ou partículas muito pequenas
ELETROFORESE
✓ Meios de suporte sólido
✓ Visualização das bandas: corantes de DNA
• Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico)
• SYBRGreen
• GelRed
Moléculas se ligam ao DNA
ELETROFORESE
ELETROFORESE
-
+
Gel
Cuba de 
eletroforese
Gel
Fonte
Luz UV
ELETROFORESE
http://www.jove.com/video/3923/electroforese-em-gel-de-agarose-para-separao-dos-
fragmentos-de-dna?language=Portuguese
LABORATÓRIO DE BIOMOL
Recomendações:
✓ Uso de luvas e Material estéril
✓ Soluções autoclavadas
✓ Exceção: enzimas, detergentes, DNA e RNA, etc
✓ Água: deionizada (autoclavada)
✓Cuidado com soluções tóxicas, carcinogênicas e
teratogênicas: Brometo de etídeo, Fenol, Clorofórmio,
βME, Luz UV.
INTRODUÇÃO
Isolamento do DNA da planta = Extração de DNA
✓ Fundamental para análise de DNA exógeno no
genoma vegetal
1º Passo para Técnicas Moleculares de detecção
• PCR = Presente ou ausente
• Southern Blot = Nº de cópias
Confirmar a integração do DNA exógeno
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Diferentes protocolos => variam em função da espécie e
do tecido a ser utilizado
✓ Reflete a variabilidade da composição bioquímica de
diferentes plantas e tecidos
Maioria dos protocolos => variação de 2 protocolos básicos
• Dellaporta et al (1983)
• Doyle & Doyle, (1987)
Baseado na utilização do detergente CTAB
Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos por acetato de
potássio na presença de SDS
Romper as membranas celulares para liberação do DNA
Romano, 1998
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Você deve ter em mente:
✓ Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos,
proteínas e polissacarídeos
✓ Manter Integridade: informação/sequência
✓Polifenois e polissacarídeos = interferem na atividade de
enzimas usadas para manipulação de DNA
=> ligases, polimerases e enzimas de restrição
✓ Use tubos plástico novos e esterilizados
=> O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o)
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Etapas básicas de protocolos de extração
✓ Lise celular = liberar o DNA
• N2 líquido
• Diretamente no Tampão de extração
Tampão de extração
• Tris pH 8.0 e 9.0 = mantém pH (desfavorável às DNAses, pH 7.0)
• EDTA = agente quelante Mg+2 e Ca+2 (co-fator de DNAses)
• β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas
=> DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
✓ Tampão de extração (continuação)
• NaCl = auxilia na dissociação de proteínas ligadas aos ácidos
nucleicos (íons rompem ligações de cadeias polipeptídicas)
• CTAB e SDS = detergentes = auxiliam na lise das membranas
celulares (libera os componentes)
 Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA
 Usado para precipitar o DNA seletivamente
• RNAse = elimina RNA
✓ Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos
• Fenol
• Clorofórmio:álcool isoamílico
 Fase aquosa (superior): DNA + Contaminantes (Polissacarídeos e RNAs)
 Interface: proteínas desnaturadas
 Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos
✓ Recuperação do DNA: Precipitação
• Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita
• Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos
• Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos
Centrifugação
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
✓ Lavagem do DNA: remoção de sal
• Etanol 70%
EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB
Romano, 1998
CTAB, NaCl, 
Tris, EDTA, 
β me, H2O
✓ Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA
(oxidação)
✓ Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso e
muito viscoso
✓ Presença de DNAses endógenas: visualização do DNA
genômico em gel de agarose – degradado (arraste
vertical)
EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS
Problemas comumente encontrados:
Baixa qualidade do DNA
PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES
R
o
m
an
o
 &
 B
ra
sl
ei
ro
, 1
9
9
8
Continuação
Romano & Brasileiro, 1998
PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
➢ Análise da OD em espectrofotômetro
• DNA absorve luz no  260 nm / Proteínas a 280 nm
• 1 OD 260 = 50 mg de DNA
DNA = leitura DO260 x 50 x fator de diluição
• Parâmetro da qualidade do DNA => Relação DO260/DO280
Valores < 1,8 => contaminação com proteínas
Valores >1,8 => contaminação com fenol
Avaliação DNA purificado: Concentração e Pureza 
➢ Eletroforese: Análise em gel de agarose
• Concentração: 0,8% e 1%
• Marcador: DNA de concentração conhecida (Padrão)
• Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV
• Amostras comparadas aos padrões, determinando-se as
concentrações aproximadas de DNA em cada amostra
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
1Kb = 1000pb
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas
1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz
http://www.uniscience.com/homogeneizador/bullet-blender-next-advance
Sorgo Folha Arroz Folha Trigo
Kit de extração DNA
HiPurA™ - Hemedia
Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes 
velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida
5 Min 30 Min
Tratamento com Topoisomerase
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
A dupla-hélice 
enrola-se sob si 
mesma
Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou
removendo superenrolamentos
HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização
Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex
Teste de complementaridade
DNA
Southern Blot Northern Blot
RNA
Sonda: sequência complementar de DNA alvo
SOUTHERN BLOT
Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico
COMO?
Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA
✓ Sondas Radioativas = nt 32P
✓ Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica 
ou quimioluminescente)
Nick Translation
Marcação por Random primers
• DNAse: digestão controlada
• DNA polimerase I
• Atividade exonucleásica = retira nt
do lado 5’-P do corte
• Atividade polimerásica = adiciona nt
do lado 3’-OH do corte
Marcação de Sonda
• Primers aleatórios anelam vários
pontos do DNA
• dNTPs marcados e não marcados
• Fragmento Klenow da DNA
polimerase I
KIT DE MARCAÇÃO
Kit Dig DNA Labeling: Randon Primers
Produto PCR purificado
Fervido: 100° C/10 min => Gelo
PCR desnaturado
Nt (primers aleatórios - hexameros)
dNTP- Digoxigenina
Enzima Klenow DNA Polimerase I
Δ 37°C 12hs
Gel: Fragmentos DNA
TRANSFERÊNCIA
HIBRIDIZAÇÃO
SOUTHERN BLOT
REVELAÇÃO
Tratamentos:
Depurinação
Desnaturação
Neutralização
-
- --
-
-
-
-
--
-
-
--
-
Lavagens
Retira excesso 
de sonda
DNA imobilizado
Sonda fria
Nucleotídeos marcados com 
digoxigenina
E E E
IgG anti-digoxigenina
conjugadocom Fosfatase
alcalina
Membrana (+)
Adição substrato NBT/BCIP: clivagem e precipitação sobre a membrana
O QUE ACONTECE NA MEMBRANA
Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos
SOUTERN BLOT
VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja
Separou 
fragmentos 
Gel - 3hs
Hibridização 
18hs
α32P: d-CTP
3 3
4
1 11
4 4 6 6 6 6
4
Cópias do transgene
DNA total 
Hind III
PCR
Souther
Blot
✓ Possibilita rearranjos complexos das inserções que podem
levar a perda das mesmas ou ao silenciamento
✓ Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da
planta, pelo efeito posicional das inserções (podem
comprometer genes do metabolismo primário)
Alto número de inserções do transgene: 
SOUTERN BLOT
✓ Importante para a expressão estável
✓ Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da
real interação entre as moléculas
Poucas cópias: 
SOUTERN BLOT
Plantas Transgênicas de Batata
DNA total digerido Eco RI
1 e 5: Marcador Peso Molecular
2 e 4: DNA total batata transgênica
digerido com Eco RI
3: DNA total batata Não-transgênica
digerido com Eco RI
Southern Blot do gel
✓ Sensibilidade (fentograma)
✓ Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma
✓ Envio de membranas para outro laboratório
✓ Demorado
✓ Caro
✓ Perigoso (sondas radioativas)
✓ É limitada quando o local exato do gene de interesse é 
desconhecido
SOUTHERN BLOT
Vantagens: 
Desvantagens: 
- Importante experimentos de Transformação => Prova
molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal
- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de
alterações no material genético
- Detecta fragmento específico em meio a milhões de
fragmentos
- Usado para distinguir estirpes de um organismo
SOUTHERN BLOT
APLICAÇÕES

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