POP Letícia

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Procedimento Operacional Padrão - POP
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	Código: POP-BM001
	Data de emissão: 14/06/2018
	Versão nº: 01
	Área Emitente: Setor Biologia Molecular
	Assunto: POP PARA DIAGNÓSTICO GENÉTICO DA SINDROME LI-FRAUMENI POR MEIO DA ANÁLISE DA MUTAÇÃO R337H NO EXÓN 10 DO GENE TP53 PELA TÉCNICA PCR-RFLP
 
Objetivo:
Padronizar os Procedimentos Operacionais Padrão para a aplicação da técnica de PCR-RFLP para o diagnóstico da Síndrome Li-Fraumeni por meio da análise da mutação R337H NO EXÓN 10 DO GENE TP53, no Laboratório de Biologia molecular.
 
Aplicação:Competência: 
Biomédicos e auxiliares técnicos do laboratório UNA, setor de Biologia Molecular.
 
Aplicação clínica:
Esse exame laboratorial, tem por objetivo, diagnosticar A síndrome de Li-Fraumeni é uma síndrome rara, autossômica dominante, caracterizada por múltiplos casos de tumores primários de início precoce, que incluem sarcomas ósseos e de tecidos moles, câncer de tórax, câncer cerebral, leucemia e tumores adrenocorticais infantis. 
As mutações germinativas encontradas no gene TP53 levam ao desenvolvimento de câncer hereditário, um gene responsável por codificar, o fator de transcrição, responsável pelo controle do ciclo celular e apoptose na resposta ao estresse genotóxico.
O fato de existirem diversas síndromes genéticas ligadas ao câncer com quadros clínicos que podem se sobrepor e frente à presença da mutação germinativa no gene TP53 em tumores esporádicos, torna-se fundamental a realização de uma investigação mais aprofundada das famílias acometidas. A obtenção da história familiar de forma adequada, aprofundando-se quanto aos detalhes sobre os tumores ocorridos e incluindo informações sobre familiares provenientes de no mínimo três gerações devem ser sempre realizada, possibilitando a realização do diagnóstico diferencial das diferentes síndromes e aconselhamento genético. 
 
O padrão Gold para detecção dos mais de 30 tipos de polimorfismos do gene TP53 é o sequenciamento. Porém a presença da troca de G com A impede o reconhecimento da sequência pela enzima HhalI(LFS), no éxon 10 permite a escolhaatravé da técnica de s dos métodos PPCR-RFLP para a detecção de polimorfismos no gene TP53 no Éxon 10 R337.H, um gene responsável por codificar, o fator de transcrição, responsável pelo controle do ciclo celular e apoptose na resposta ao estresse genotóxico. É uma síndrome rara, autossômica dominante caracterizada por múltiplos casos de tumores primários de início precoce, que incluem sarcomas ósseos e de tecidos moles, câncer de tórax, câncer cerebral, leucemia e tumores adrenocorticais infantis.
 
Metodologia:
Marcador: RFLP
A metodologia usada no exame é PCR-RFLP
 
Princípio dos testes:
1. PCR-RFLP- (polymerase chain reaction - restriction fragmen t
length polymorphism), ou reação com cadeia da polimerase associado à
análise do polimorfismo de tamanho dos fragmentos de DNA obtidos por enzimas de restrição.restrição. São Fragmentos de DNA amplificados via PCR, utilizando-se primers específicos (20 a 30 pb). As etapas para obtenção dos marcadores são a extração e amplificação via PCR, a digestão do produto da amplificação com enzimas específicas e a visualização do polimorfismo em gel de agarose ou poliacrilamida pela coloração com brometo de etidio sob luz violeta ou com prata. Sendo uma vantagem a codominância e a alta reprodutibilidade e a principal desvantagem a necessidade do conhecimento prévio da sequência de DNA para a construção dos primers.
 FLUXOGRAMA:
AMOSTRA INAPTA
COLETA
EXTRAÇÃO DNA
RECEBIMENTO DA AMOSTRA
AMOSTRAAPTA
QUALIDADE DNA
DNA
 APTO
DNA
INAPTO
POSITIVO PARA CONTAMINAÇÃO 
AMPLIFICAÇÃO
PCR
LIBERAÇÃO LAUDO
AUSENCIA DE DIGESTÃO ENZIMA CONTROLE POSITIVO
NEGATIVO PARA CONTAMINAÇÃO
LEITURA
RESULTADO
ELETROFORESE
RFLP
DIGESTÃO ENZIMA
PRESENÇA DE DIGESTÃO ENZIMA CONTROLE POSITIVO
Amostra:
Sangue, Saliva, ou DNA extraído de alta qualidade
 
Coleta:
Deve ser realizada em tubo de EDTA, com volume recomendável de 4m.l, para amostra de sangue, e em tubo de tubo OG-500, para amostras de saliva.
Não é necessário a realização de jejum.
 
Conservação do Material:
Colher 2-4 ml de sangue em um tubo com EDTA (tampa roxa) e enviar a amostra num prazo máximo de 48h.
Colher 2 ml de saliva em um tubo OG-500 da marca Oragene e enviar a amostra num prazo máximo de 96h.
 
Critérios de Rejeição
· Amostra de sangue congelada.
· Presença de coágulo ou hemólise grosseira.
· Amostra coletada por mais de 48 horas.
· Quantidade de amostra insuficiente.
· Avarias no tubo e/ou recipiente do material enviado.
· Tubo com anticoagulante ou conservante inadequado.
· Amostra sem identificação. .
· Falta de requisição médica ou do termo de consentimento assinado pelo paciente ou responsável.
-Critério de admissão da qualidade do DNA, o cálculo 2 a razão deve estar entre o intervalo de 1,4>x>2,0
 
Siglas:
EDTA: ácido etilenodiamino tetracético
EPIs: Equipamentos de Proteção Individual
SNA: solicitação de nova amostra
LFS: Síndrome Li-Fraumeni
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
PBS: Tampão fosfato salino.
dNTPS: desoxirribonucleotídeos fosfatados
PB: pares de base
Documentos Obrigatórios
Termo de Consentimento, e formulário de Requisição de exame.
 
Reagentes e materiais: 
EPIs: Luvas, óculos, avental, máscara
Pêra
Pipeta graduada
Micro tubo
Tubos estéreis
Amostra a ser analisada
Amostra controle negativo para mutação
Solução PBSS
Cell Lysis Solution solução de Ficoll-Hypaque
Nuclei Lysis Solution
Solução para suspensão de proteínas
RNase Solution
Álcool isopropanol
Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) 
tampão 30 de reação para Taq Platinum
Pprimers intrônicos específicos para o gene Tp 53 exon 10 (FW 5’-caattgtaacttgaaccatc-3’ RW 5’-ctttccaacctaggaaggca-3’
dNTPs
Água Nuclease free
Taq Platinum DNA polymerase (Invitrogen)
Enzima HhaI
tampão de reação para enzima Hhal
Pipeta Eletrônica
Tubos Falcon de 15 e 50 ml
Pipeta Pasteur
Gel de Agarose 3% 
Brometo de etídio (1mg/mL)
Tampão TBE
Amostra DNA genômico ausente mutação
 
Equipamentos:
 Centrífuga
Cuba de Eletroforese
Espectrofotômetro
Termociclador
Transluminador
Banho Maria
Cálculos:
1-Concentração do DNA da amostra:
 1nn 50ng/ml de DNA
(Abs da amostra a 260nn) X
2-Cálculo qualidade do DNA:
Razão entre Abs a 260nn e Abs a 280nn
Qualidade DNA= Abs a 260nn
 Abs a 280nn
3-Cálculo volume/concentração da amostra:
CI.VI=CF.VF
4-Cálculo quantidade de DNA a ser retirado da amostra:
1ml de DNA (Resultado concentração de DNA na amostra)
 X (Concentração de DNA necessária para fazer a PCR conforme kit fabricante)
FLUXOGRAMA:
EXTRAÇÃO DNA
COLETA
RECEBIMENTO DA AMOSTRA
AMOSTRAAPTA
QUALIDADE DNA
DNA
 APTO
DNA
INAPTO
POSITIVO PARA CONTAMINAÇÃO 
AMPLIFICAÇÃO
PCR
LIBERAÇÃO LAUDO
AUSENCIA DE DIGESTÃO ENZIMA CONTROLE POSITIVO
NEGATIVO PARA CONTAMINAÇÃO
LEITURA
RESULTADO
ELETROFORESE
RFLP
DIGESTÃO ENZIMA
PRESENÇA DE DIGESTÃO ENZIMA CONTROLE POSITIVO
Procedimentos:Procedimentos:
1. Usar EPIs padronizados para o procedimento;
2. Verificar se a amostra está em de acordo com os critérios de rejeição e admissibilidade da amostra;
Seguir para procedimento de extração do DNA da amostra a analisar 
3. 
Extração do DNA
1. Homogeneizar o sangue vertendo delicadamente o tubo de EDTA contendo a amostra 
2. Transferir o sangue da amostra para um tubo Falcon de 50mL 
3. Adicionando 15 ml de solução PBS 1X pH 7,4 (123mM de NaCl; 2,7mM de KCl; 4,3mM de Na2HPO4; 1,4mM de K2HPO4) com a pipeta 
4. Com a pipeta graduada adicione 15mL de solução de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences)
5. Colocar o tubo contendo a amostra na centrífuga, programando para centrifugar a 1.200rpm por 30 minutos a 24º C
6. Após centrifugação aspirar o halo linfocitário com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferido para um tubo Falcon de 15mL.
7. Realizar lavagem com 10mL de solução PBS 1X seguida de centrifugação por
15 minutos a 2.000rpm e descarte do sobrenadante
8. Ressuspender o pellet de linfócitos com 1,5mL ml pipetado na pipeta eletrônica de PBS por uma vez
9. Levar a amostra ressuspendida para a centrífuga, ciclar por 4 minutos a 13.000 rpm
10. Aspirar o sobrenadante com cuidado com a pipeta de Pasteur e descartar no descarte
11. Estocar os pellets de linfócitos a –70° C
Realizar extração conforme instrução do kit de extração de DNA Genômico conforme fabricante.
12. Homogeneizar o tubo suavemente até ficar bem misturado; 
13. Transferir 3 ml da quantidade de sangue para o tubo de centrifuga de 1,5 ml
14. Homogeneíze o tubo delicadamente
15. Adicione 6 ml de solução para lise célula (Cell Lysis Solution)
16. Inverte o tubo de 5 a 6 vezes para misturar
17. Deixe a mistura incubar por 10 min a temperatura ambiente
18. Coloque na centrífuga e programe para centrifugar a 13.000 e 16.000 × g por 20 segundos à temperatura ambiente.
19. Retire da centrifuga e descarte o sobrenadante 
20. Observe o liquido residual de 10 a 20 µL, caso verifique a presença de glóbulos vermelhos, adicione uma alíquota de solução para lise celular e refaça os passos de 5 a 8 ou se negativo, continue para o passo 10
21. Agite vigorosamente o tubo de 10 a 15 segundos, ressuspendendo os glóbulos brancos
22. Coloque 300µL da amostra em um novo tubo, adicionando 300µL de solução Nuclei Lysis Solution , pipetando de 5 a 6 vezes, até a solução obter aparência viscosa
23. Incube a 37° no banho maria por 1 hora até que todos os aglomerados sejam rompidos. Caso não estiverem rompidos incube novamente retirando 300µL da solução com mais 100µL de Nuclei Lysis Solution 
24. Opcional: Adicione RNase Solution (1,5μl para 300μl de volume de amostra) ao lizado nuclear e misture a amostra invertendo o tubo de 2 a 5 vezes. Incubar a mistura a 37 ° C por 15 minutos, e depois esfriar à temperatura ambiente. 
25. Adicione a solução de precipitação de proteínas (100μl para 300μl de volume de amostra) ao lisado nuclear e vortex vigorosamente por 10 a 20 segundos. Observando pequenos aglomerados proteicos visíveis após o vórtice. Nota: Se a Solução de Lise de Núcleos adicional foi adicionada no Passo 11, adicione um total de 130μl de Solução de Precipitação de Proteína para 300μl de volume de amostra 
26. Coloque o tubo com 300µL da amostra na centrífuga a 13.000–16.000 × g por 3 minutos. Após a centrifugação deverá ser observado um pellet escuro visível.
27. Transfira o sobrenadante para um tubo de micro centrífuga de 1,5mL contendo 300µL de isopropanol à temperatura ambiente
28. Suavemente, o tubo foi invertido várias vezes para lavar o pellet de DNA e as laterais do tubo de micro centrífuga.
29. Centrifugou-se novamente.
30. Com cuidado, o etanol foi aspirado usando uma ponteira de pipeta. O pellet de DNA é muito solto neste momento e deve-se ter cuidado
para evitar a aspiração do pellet na pipeta.
31. O tubo foi invertido em papel absorvente limpo para secar o pellet.
32. Foi adicionada a Solução de Reidratação de DNA ao tubo e foi incubado, misturando a solução periodicamente, batendo levemente o tubo.
33. O DNA foi armazenado.
34. Levar amostra do DNA para quantificação no espectrofotômetro
35. Quantificar o DNA analisado e do DNA controle negativo da mutação no espectrofotômetro e medir absorbância da amostra a 260nn e 280nn.
36. Calcule conforme instrução de cálculos 1 para quantificar o DNA e verificar a qualidade do DNA no conforme cálculo 2 e critérios de admissão de qualidade do DNA da amostra
Descrição: VR para quantificação de DNA
37. Após obter valores da concentração e qualidade do DNA da amostra, e estando dentro dos parâmetros de admissão qualidade de DNA, prosseguir para etapa de realização de PCR 
Etapa de PCR para extração e amplificação do Gene TP 53 do Éxon 10
1. Proceder cálculos para volume final da reação de 25µl conforme critérios 
de concentração final da amostra com DNA eanalisado e reagentes
	REAGENTES
	CONCENTRAÇÃO ESTOQUE(CI)
	CONCETRAÇÃO DA REAÇÃO(CF)
	VOLUME INICIAL PARA
REAÇÃO(VI)
	Taq Platinum DNA polymerase
	2X
	1X
	CÁLCULO 3
	PRIMER RW
	10nn
	0,5nn
	CALCULO 3
	PRIMER FW
	10nn
	0,5nn
	CALCULO 3
	DNA MOLDE
	Concentração DNA amostra
	100ng
	CALCULO 4
	ÁGUA NUCLEASE FREE
	
	
	ATE COMPLETAR VOLUME FINAL 25µL
Quadro 1: obtenção do volume inicial das amostras
2. Após os cálculos de concentração final da amostra obtidos no quadro 1 pipetar a quantidade de cada reagente com DNA da amostra analisada e primers para TP 53 éxon 10 e colocar em um tubo
3. Colocar em outro tubo a mesma quantidade de reagentes do passo 2, sendo que no lugar do DNA colocar água
4. em outro tubo fazer nova reação contendo primers do com o DNA controle a ser analisado
5. Levar os 4 tubos no termociclador, programando para etapa de desnaturação inicial de 94° C por 2 minutos, seguida por 21 35 ciclos de desnaturação a 94º C durante 45 segundos, anelamento a 63° C por 45 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto., reduzida de 0,5° C a cada 3 ciclos.
6. Após esses 21 ciclos, seguir com mais 30 ciclos adicionais de desnaturação a 94° C durante 45 segundos, anelamento a 60° C por 45 segundos e uma etapa final de extensão a 72° C por 10 minutos.
Etapa RFLP, Eletroforese
1. Pipetar quantidade dos reagentes do quadro 2 conforme volume final, após obter os cálculos necessários, colocando em um micro tubo:
	REAGENTES
	CONCENTRAÇÃO ESTOQUE(Ci)
	CONCENTRAÇÃO REAÇÃO(CF)
	VOLUME/REAÇÃO PARA 20µL(VF)
	Enzima Hha l
	20.000U/mL
	10U/mL
	Cálculo 3
	Solução tampão Hha l
	10X
	1X
	Calculo 3
	Produto PCR
	
	
	5µL
	Água nuclease free
	
	
	Até completar volume 20µL
Quadro 2: orientação para reação das amostras para RFLP 
2. Proceder com as etapas 1 com a amostra de DNA controle ausente mutação no lugar do produto da PCR do DNA analisado
3. Proceder com as etapas 1 com a amostra controle positivo para enzima 
4. Proceder com as etapas 1 com a amostra de DNA analisada sendo que no lugar da enzima substituir por água
5. Incubar as reações a 37° por 4 horas
6. 
Etapa Eletroforese
1. Pegar 50 ml tampão TBE diluindo com 0,5g de agarose com brometo de etidio ( 1mg por mL) solubilizando bem
2. Levar ao micro-ondas até a agarose derreter
3. Coloque em um suporte e leve para geladeira até começar a solidificar
4. Antes de solidificar completamente inserir o pente para formação das canaletas, observando para não atravessar o gel
5. Após 4 horas, preencher a cuba eletroforética com tampão TBE até o limite indicativo
6. Colocar o tampão da amostra na amostra
7. colocar o gel de agarose na cuba eletroforética
8. Aplicar o padrão do peso molecular no primeiro poço
9. Aplicar controle sem DNA no poço do gel de agarose
10. Aplicar controle amostra DNA ausente mutação no poço do gel de agarose
11. Aplicar controle amostra da positivo negativo enzima no poço do gel de agarose
12. Aplicar a amostra contendo ausência de enzima
13. Aplicar o produto da digestão do DNA a ser analisado no poço do gel de agarose 3%
14. Feche a cubeta
15. Ligar a cubeta na fonte a 1020 volts por 20 30 minutos
16. Após 30 minutos retirar o gel
17. Abra a tampa de proteção do transluminador e coloque o gel de agarose
18. Feche a tampa
19. Ligue a luz UV
20. Verifique o padrão apresentado das bandas das amostras
21. Confirme os controles negativos e positivos se estão corretos, apresentando o resultado esperado. Se não estiverem, refazer os testes verificando a qualidade das amostras e produtos utilizados. Se estiverem dentro do esperado siga para interpretação e leitura resultados.
Interpretação e Leitura dos Resultados:
1. Compare a leitura do padrão da amostra analisada com o peso molecular
2. Compare o resultado com os valores de referência para o Gene TPp 53 Éxon 10
3. Libere o laudo.
Valores de Referência para mutação no Gene TP53 Tp 53 ÉXON 10: 
 Ausência de mutação: visualização de 2 fragmentos com 146pb e 92pb, conforme exemplo abaixo:
 Presença mutação: visualização de fragmento contendo 2388 pb, conforme exemplo abaixo:
Cálculos:	Comment by Patricia Silva
Cunha tiça: MAIS NO FINAL DO DOCUMENTO
1-Concentração do DNA da amostra:
 1nn 50ng/ml de DNA
(Abs da amostra a 260nn) X
2-Cálculo qualidade do DNA:
Razão entre Abs a 260nn e Abs a 280nn
Qualidade DNA= Abs a 260nn
 Abs a 280nn
3-Cálculo volume/concentração da amostra:
CI.VI=CF.VF
4-Cálculo quantidade de DNA a ser retirado da amostra:
1ml de DNA (Resultado concentração de DNA na amostra)
 X (Concentração de DNA necessária para fazer a PCR conforme kit fabricante)
Referências:
ACHATZ MIW; Diagnóstico Molecular da Síndrome de Li-Fraumeni em Famílias Brasileiras;Dissertação de Mestrado 2006
Faleiro FG; Marcadores Genéticos-Moleculares ligados a programas de conservação e de uso de recursos genéticos; EMBRAPA Cerrados, 2007
Extração
Após a coleta do sangue do paciente, em tubo de EDTA, deve ser realizada a separação dos linfócitos. O precipitado linfocitário (pellet) foi obtido a partir das amostras de sangue através de centrifugação a 1.500rpm por 15 minutos, sendo o plasma sobrenadante transferido para tubos de 1,5mL e estocado a –70º C. O sangue restante foi homogeneizado e transferido para tubos Falcon de 50mL, aos quais foram adicionados 15mL (aproximadamente o mesmo volume do sangue homogeneizado) de solução PBS 1X pH 7,4 (123mM de NaCl; 2,7mM de KCl; 4,3mM de Na2HPO4; 1,4mM de K2HPO4). Em seguida, foram adicionados 15mL de solução de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences). Após centrifugação a 1.200rpm por 30 minutos a 24º C, o halo linfocitário foi aspirado com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferido para um tubo Falcon de 15mL. Foi realizada lavagem com 10mL de PBS 1X seguida de centrifugação por 15 minutos a 2.000rpm e descarte do sobrenadante. O pellet de linfócitos foi ressuspendido em 1,5mL ml de PBS 1X e transferido para tubo 1,5mL. Repetiu-se então o processo de lavagem das células com PBS 1X. Após 29 centrifugação por 4 minutos a 13.000rpm e aspiração do sobrenadante, os pellets de linfócitos foram estocados a–70o C. A extração de DNA foi feita com a utilização do Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e o DNA assim obtido foi quantificado em espectrofotômetro GeneQuant Pro (Amershan-Pharmacia Biotech) e estocado a -20º C. No caso das amostras provenientes de outros estados do Brasil, o DNA foi extraído no centro de origem e enviado através de empresas privadas de transporte. As amostras levaram um período máximo de sete dias entre o envio e o seu recebimento e quando recebidas foram estocadas a -20º C. 
PCR
Os éxons foram amplificados a partir da utilização de primers intrônicos específicos, a partir de 100ng de DNA genômico, na presença da enzima Taq Platinum DNA polymerase (Invitrogen). As condições da reação de PCR foram: 1,5mM de MgCl2, 0,2mM de dNTPs; 1,2μM de cada primer; 1,25U de Taq Platinum DNA polymerase (Invitrogen); 2,5μL de tampão 30 de reação para Taq Platinum 10X (concentração final 1X) e água em quantidade suficiente para 25μL. Para todos os éxons a reação de amplificação foi realizada utilizando-se a estratégia touchdown, iniciada a partir de uma etapa de desnaturação inicial de 94o C por 2 minutos, seguida por 21 ciclos de desnaturação a 94o C durante 45 segundos, anelamento a 63o C por 45 segundos e extensão a 72o C por 1 minuto. Nesta etapa, a temperatura de anelamento foi reduzida de 0,5o C a cada 3 ciclos. Após esses 21 ciclos, seguiram-se 30 ciclos adicionais de desnaturação a 94o C durante 45 segundos, anelamento a 60o C por 45 segundos e uma etapa final de extensão a 72o C por 10 minutos.
Rflp
A técnica de PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism reação), ou reação com cadeia da polimerase associado à análise do polimorfismo de tamanho dos fragmentos de DNA obtidos por enzimas de restrição, foi empregada na avaliação da freqüência da alteração R337H no éxon 10 do gene TP53 em 53 voluntários saudáveis. Um fragmento de 238 pb contendo o códon 337 foi amplificado a partir de DNA genômico com primers específicos para a região e digerido com a enzima de restrição HhaI. (Amersham Biosciences). A 5μL do DNA amplificado, foi adicionado 1μL da enzima HhaI (20.000U/mL) (New England Biolabs), 2μL de tampão de reação 10X, 2µl BSA 10X e água para o volume final de reação de 20μL. A reação foi incubada a 37o C por 4 horas. O produto da digestão foi aplicado em gel de agarose 3% contendo 20μL de brometo de etídio (1mg/mL), submetido a eletroforese (120 volts, por 30 minutos aproximadamente) e visualizado sob luz UV.