BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS-Parte1

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BIOPROCESSOS
INDUSTRIAIS
Prof. Emerson Guarda
Mestrado em Agroenergia
APRESENTAÇÃO DA DISCIPLINA
• Encontros
– Dia e horário.
• Avaliações
– Prova, seminário, artigos.
• Conteúdo
– Histórico da biotecnologia.
– Catálise enzimática.
– Matérias primas
– Fisiologia celular.
– Cinética do crescimento celular.
– Meios de cultivo. Formulação, aeração, agitação.
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• Conteúdo (continuação)
– Fermentação de células livres e imobilizadas.
– Classificação dos bioprocessos.
– Tipos de reatores - parâmetros.
– Esterilização.
– Noções de ampliação de escala
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INTRODUÇÃO
BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS = BIOTECNOLOGIA
• “Conjunto de conhecimentos, técnicas e métodos
de base científica ou prática que permite a
utilização de seres vivos como parte integrante e
ativa do processo de produção industrial de bens e
serviços.” [Paes de Carvalho, A., Patentes para a biotecnologia,
Apresentado a Academia Brasileira de Ciências em 6.12.93]
• “Conjunto de processos industriais que englobam
processos biológicos.” [Office Technology Assessment]
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• APLICAÇÕES
– Agricultura: plantas modificadas mais resistentes à
pestes, secas e doenças; desenvolvimento de
bioinseticidas; modificação de plantas para melhorar
as características nutricionais e de processamento.
– Indústria química: ac. acético, etanol, ac. cítrico, e
outros; síntese de produtos de química fina
(enzimas, antibióticos, aminoácidos); biocatálise;
biossensores.
– Meio ambiente: recuperação de metais pesados em
efluentes; biorremediação de solo e água poluídos
com materiais tóxicos; tratamento de efluentes e do
esgoto.
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• APLICAÇÕES
– Indústria de alimentos:
produção de levedura de
panificação, queijo, iogurte,
alimentos e bebidas
fermentados; produção de
sabor (flavour) e aroma.
– Medicina: desenvolvimento de
novas moléculas terapêuticas,
diagnósticos, engenharia de
tecidos.
– Veterinária: produção de
vacina, controle de fertilidade.
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• CONHECIMENTOS ENVOLVIDOS
– Biologia.
– Química.
– Física.
– Engenharia mecânica.
– Engenharia química.
– Bioquímica.
– Microbiologia.
BiologiaBiologia QuímicaQuímica
EngenhariaEngenharia
BioquímicaBioquímica
BiologiaBiologia
molecularmolecular
QuímicaQuímica
IndustrialIndustrial
EngenhariaEngenharia
BioquímicaBioquímica
BiotecnologiaBiotecnologia
IndustrialIndustrial
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HISTÓRICO
• Microorganismos X decomposição de alimentos
• Microorganismos X fermentação de alimentos e
bebidas
• Vinho e vinagre  10.000 AC
• Cerveja  5.000 – 6.000 AC (Egito)
• Pão  4.000 – 7.000 AC (Egito)
• Queijo e leite fermentado  5.000 AC
• Soja fermentada  3.000 AC (China)
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HISTÓRICO
• Hooke – células  1655
• Leeuwenhoke – microscópio  1675
• Mendel – genética  1843
• Pasteur – pasteurização, fermentação  1854
• Fleeming – penicilina  1928
• Crick e Watson – estrutura do DNA  1953
• Engenharia genética  1970 (Organismos
geneticamente modificados).
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PROCESSO FERMENTATIVO
GENÉRICO
FermentadorFermentador
MicrorganismoMicrorganismo
PreparoPreparo
dodo
inóculoinóculo
NutrientesNutrientes
Preparo do meioPreparo do meio
Esterilização do meioEsterilização do meio
ControlesControles
EsterilizaçãoEsterilização
do ardo ar
RecuperaçãoRecuperação
do produtodo produtoArAr
TratamentoTratamento
de efluentede efluente
ProdutoProduto
ResíduoResíduo
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MICROORGANISMOS INDUSTRIAIS
• Tipos de microorganismos
– Bactérias  procariotos, quimioorganotrofos
– Fungos  eucariotos, quimioorganotrofos
• Bolores
• Leveduras
• Procariontes  parede celular, membrana celular,
ribossomos e região nuclear;
• Eucariontes  núcleo, ribossomos, retículo
endoplasmático, mitocôndria, complexo de Golgi,
lisossoma, cloroplastos (para quem faz
fotossíntese).
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METABOLISMO MICROBIANO
• Aspectos macroscópicos do metabolismo.
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METABOLISMO MICROBIANO
• Catabolismo e anabolismo
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METABOLISMO MICROBIANO
GlicóliseGlicólise
Sem OSem O22Sem OSem O22
OO22 COCO22
Ciclo de Krebs eCiclo de Krebs e
cadeia respiratóriacadeia respiratória
• FERMENTAÇÃO
Mecanismo
anaeróbio de
produção de energia
que não envolve
cadeia respiratória
ou citocromos.
A maioria dos
processos não
constituem
metabolicamente
uma fermentação
mas sim processos
aeróbicos.
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NUTRIÇÃO MICROBIANA
• Fonte de energia dos organismos fermentadores
– Quimiorganotróficos  obtém energia de reações
químicas
• Fonte de carbono  energia x esqueleto carbônico
– Carboidratos  açúcares e polissacarídeos
– Aminoácidos, protídeos e proteínas
– Ácidos monocarboxílicos
– Lipídios
• Fonte de nitrogênio  síntese material plástico
– Orgânico  Aminoácidos, protídeos, proteína
– Inorgânico  sais de amônio, (nitratos e nitritos)
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NUTRIÇÃO MICROBIANA
• Sais minerais
– Macronutrientes
• P  ATP e ácidos nucleicos
• S  aminoácidos / proteínas
• K  ativador enzimático, regulador da pressão
osmótica
• Mg  cofator enzimático
• Ca  cofator enzimático
– Micronutrientes  Cu, Co, Zn, Mn, Na, B, etc.
• Fatores de crescimento
– Vitaminas
– Aminoácidos
– Nucleotídeos
– Ácidos graxos
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NUTRIÇÃO MICROBIANA
• Água
– Não é considerada nutriente
– Solvente universal  nutrição celular e reações
enzimáticas
– Regulação da pressão osmótica
– Regulação térmica  alto calor específico
• Oxigênio atmosférico
– Não é considerado nutriente
– Receptor de elétrons na respiração
• Aeróbios: Acinetobacter
• Microaerófilos: Campylobacter jejuni
• Anaeróbios: Clostridium tetani
• Facultativos: Escherichia coli
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a
um aumento da população de células e não ao
aumento das dimensões celulares.
• Crescimento Populacional: é definido como o
aumento do número, ou da massa microbiana.
• Reprodução bacteriana
– Fissão binária transversa
– Brotamento (Rhodopseudomonas acidophila)
– Fragmentação (Nocardia)
– Esporulação (Streptomyces)
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Fungos e leveduras (assexuada e sexuada)
– Formação de esporos (Aspergillus fumigatus)
– Fragmentação (fissão binária)
– Crescimento apical (extensão das hifas)
– Brotamento ou gemulação(Saccharomyces cerevisae)
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Crescimento exponencial ou em progressão
geométrica.
11
2 ou 22 ou 211
4 ou 24 ou 222
8 ou 28 ou 233
16 ou 216 ou 244 22nnTotalTotal
nn = número de gerações= número de gerações
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Tempo de geração (g ou G): é o intervalo de tempo
necessário para que uma célula se divida ou para
que a população duplique.
– variável para os diferentes organismos
– dependente de fatores genéticos e nutricionais e
ambientais
Tempo de geração de algumas bactérias em condições ótimas deTempo de geração de algumas bactérias em condições ótimas de
crescimentocrescimento
BacteriaBacteria MeioMeio Tempo de geração (Tempo de geração (minmin))
EscherichiaEscherichia colicoli GlicoseGlicose--saissais 1717
BacillusBacillus megateriummegaterium SacaroseSacarose--saissais 2525
StreptococcusStreptococcus lactislactis LeiteLeite 2626
StreptococcusStreptococcus lactislactis CaldoCaldo lactosadolactosado 4848
StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus BHIBHI 2727--3030
LactobacillusLactobacillus acidophilusacidophilus LeiteLeite 6666--8787
RhizobiumRhizobium japonicumjaponicum Meio ManitolMeio Manitol 344344--461461
MycobacteriumMycobacterium tuberculosistuberculosis SintéticoSintético 792792--932932
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Expressão matemática para o crescimento
microbiano
– Crescimento exponencial
– Divisão binária
– População Total (N)
N= No x 2n onde:
N= número final de células
No= número inicial de células
n= número de gerações
– Aplicandologaritmo (log):
log N= log No + n log 2 n = log N - log No / 0,301
n = log N - logNo / log 2 n = 3,3 (log N-log No)
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• A partir da equação anterior é possível calcular o
número de gerações (n) que ocorreram em uma
cultura se o n° inicial de células for conhecido.
• Tendo-se o valor de n pode-se calcular o tempo de
geração (g)
g = t/n
• Exemplo:
• Calcular o tempo de geração de uma cultura cuja população
celular passa de 103 para 108 após 5 horas de cultivo.
n = 3,3 (log 108 - log 103) ----> n = 3,3 (8-3) = 16,5 gerações
g = 5 / 16,5 = 0,3 horas
Tempo para duplicar a população celular foi de 0,3 horas.
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Taxa de crescimento específica ou velocidade
específica de crescimento (k ou ) : número de
gerações por unidade de tempo.
 = 1/g (h-1) ou  = n/t
Se g = 0,3 horas então m = 1/0,3 = 3,3 gerações/h
• A taxa específica de crescimento pode ser relacionada com o
número, a massa ou a concentração de componentes
celulares em função do tempo.
dN = N dX = X dZ = Z onde
dt dt dt
• N = número células/mL X = massa células / mL
• Z = concentração qualquer componente celular/mL
• t = tempo  = taxa específica de crescimento
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Integrando:
ln Z – ln Z0 =  (t-to) (1)
usando base log decimal:
log Z – log Z0 =  (t-to) (2)
2,303
 = (log Z – log Z0) . 2,303 (3)
t-t0
Ex: Se houver aumento de 104 celulas /mL para 108 celulas/mL
depois de 4 horas a taxa especifica de crescimento desta
cultura será:
 = (log 108 -log 104) . 2,303 = 2,303 h-1
4 h
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• A relação entre a taxa de crescimento  e o tempo
de geração g pode ser derivada da equação (1)
considerando o intervalo de tempo t-t0 = g então Z
= 2Z0 :
 = ln2 = 0,693 e g = 0,693
g g 
• No exemplo acima o valor do tempo de geração
seria:
g = 0,693/2,303 = 0,30 h ou 18 minutos.
• Estas equações levam em consideração a
proporcionalidade entre a taxa de crescimento e o
aumento do numero (massa, constituinte celular)
com o tempo.
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• Para determinar m graficamente:
Inclinação da reta ln Z (X, N) x t
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• A taxa específica de crescimento () , e o tempo de geração
ou duplicação (g) , de uma população microbiana são
parâmetros muito importantes em Microbiologia.
• Permitem prever a evolução da concentração de um m.o. ao
longo do tempo de crescimento exponencial. São parâmetros
que indicam a resposta do m.o. às diversas condições
ambientais incluindo a modificação do meio de cultura.
• O cálculo dos valores de g e  de um dado microrganismo,
em condições de cultura diferentes, é útil para:
– selecionar as condições de cultura ótimas para o crescimento
desse microrganismo;
– estudar o efeito que uma determinada alteração das condições
ambientais exerce sobre o crescimento do microrganismo.
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CURVA DE CRESCIMENTO
MICROBIANO
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CURVA DE CRESCIMENTO
MICROBIANO
Fase da
crescimento
Taxa de
crescimento
Características
Lag ou adaptação zero nenhum aumento no número de células,
aumentam de tamanho, são sintetizadas
novas enzimas para as células se
adaptarem ao novo meio.
Exponencial ou
Log
máxima ou constante condições de crescimento balanceado; as
células são uniformes em termos de
composição química e atividade metabólicas
e fisiológicas. Pico da atividade e eficiência
Fisiológica.
Estacionária zero acúmulo de produtos metabólicos tóxicos
e/ou exaustão de nutrientes. Algumas
células morrem, outras crescem e se
dividem. O número de células viáveis
diminui
Morte ou declínio negativa acúmulo adicional de produtos metabólicos
inibitórios. A taxa de morte é acelerada; o
número de células diminui de modo
exponencial. Tipicamente todas as células
morrem em dias ou Meses
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CRESCIMENTO MICROBIANO
MODELO DE MONOD
• Relaciona a taxa específica de crescimento (μ) e a
concentração de substrato limitante (S).
μ = μmax S
Ks+S
• onde:
• μmax = máxima taxa específica de crescimento
• Ks = constante de saturação
• A equação de Monod é baseada no modelo de cinética
enzimática de Michaelis-Menten
• μmax e Ks são dependentes do m.o, meio de cultivo,
substrato limitante e de condições ambientais como pH e T
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• A taxa de crescimento exibe uma curva de saturação μ = μmax
• Ks é a concentração de substrato na qual se obtém a metade
da velocidade de crescimento específica máxima (μ = 0,5
μmax).
• Representa a afinidade do microrganismo pelo substrato.
• Geralmente valores são baixos (menor 0,1 g/l).
SeSe háhá excessoexcesso dede substrato,substrato,
S>>>S>>>KsKs entãoentão μμ == μmaxμmax ee aa
culturacultura sese encontraencontra nana fasefase
exponencialexponencial dede crescimentocrescimento..
OO modelomodelo dede MonodMonod éé muitomuito
utilizadoutilizado parapara descreverdescrever oo
crescimentocrescimento dede váriosvários
microrganismosmicrorganismos..
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CRESCIMENTO MICROBIANO
• PRODUTIVIDADE
P = Xf – X0
TF
• X0= Biomassa inicial;
• XF= Biomassa final;
• TF= Tempo total de cultivo.
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EXERCÍCIOS
1.O crescimento de um dado microrganismo em meio contendo
glicose como fonte de carbono apresentou os seguintes
parâmetros μm = 0.65 h-1 e Ks = 0.05 g.l-1. Calcular a taxa de
crescimento específica (μ) para as concentrações de glicose
abaixo:
[glicose] g.l-1: 90, 20, 1.0, 0.5, 0.1, 0.01
2.Candida utilis cresce em glicerol com velocidade específica e
crescimento máxima de 0,095 h-1. Qual o tempo necessário
para esse microrganismo duplicar a sua massa na fase
exponencial de crescimento de um processo batelada?
3.Qual a diferença entre respiração e fermentação?
4.Cite exemplos práticos de aplicação industrial de leveduras,
bactérias e mofos.
5.Quais os principais substratos utilizados na indústria para
processos fermentativos?
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
• QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
– Contagem em placas
– Filtração
– Método do número mais provável
– Contagem direta ao microscópio
• QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
– Turbidimetria
– Atividade metabólica
– Peso seco
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO - DIRETA
1.CONTAGEM EM PLACAS
• Técnica mais utilizada na quantificação de uma população
bacteriana
• Vantagem: quantificação de células viáveis
• Desvantagem: tempo (24 h para o aparecimento das colônias)
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
• Metodologia contagem
em placas e diluição
seriada
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
• 2. FILTRAÇÃO
• < nº de bactérias: pode ser utilizado método de filtração para
contagem.
• Concentração de bactérias sobre a superfície de uma
membrana de filtro de poros muito pequenos após a
passagem de um volume definido de amostra
• Filtro posteriormente transferido para placa contendo meio
sólido
• Muito utilizado para controle microbiológico de água
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
• 3. MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
• Utilizado para microrganismos que não crescem bem em
meio sólido
• Muito comum no controle de qualidade de água e alimentos
(coliformes)
• 1) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)
• 2) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)
• 3) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)
• 4) contagem do nº de tubos positivos
• 5) estimativa do nº de células/mL de bactérias
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
TabelaTabela dede combinaçõescombinações (NMP)(NMP)
66--33--11
ÍndiceÍndice dede NMP/NMP/100100 mLmL == 110110
InferiorInferior == 4040
SuperiorSuperior == 300300
ConfiabilidadeConfiabilidade dede 9595%%
CálculoCálculo dodo númeronúmero maismais
provávelprovável (NMP)(NMP)::probabilidadeprobabilidade
estatísticaestatística
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
4. CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
• Um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado
em uma área definida da lâmina de microscópio.
• A amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
• Utilizam câmaras de contagem
• DESVANTAGENS:
• Não distingue células mortas e vivas
• Pode haver erros de contagem
• Difícil contagem para bactérias móveis
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO - INDIRETA
1.TURBIDIMETRIA
• Monitoramento do crescimento bacteriano através da
turbidez em espectrofotômetro (610 nm)
2.ATIVIDADE METABÓLICA
• Quantidade de um certo produto (proteína, ácidos nuclêicos )
é diretamente proporcional ao número de células
3.PESO SECO
• Principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removido do meio por filtração
b) seco em estufa
c) posterior pesagem: massa seca por diferença
OBS: Todas as técnicas consideram vivos e mortos
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MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO - INDIRETA
• Curva de crescimento utilizando dois métodos de
quantificação.
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	BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS
	APRESENTAÇÃO DA DISCIPLINA
	Slide3
	INTRODUÇÃO
	Slide5
	Slide6
	Slide7
	HISTÓRICO
	HISTÓRICO
	PROCESSO FERMENTATIVO GENÉRICO
	MICROORGANISMOS INDUSTRIAIS
	METABOLISMO MICROBIANO
	METABOLISMO MICROBIANO
	METABOLISMO MICROBIANO
	NUTRIÇÃO MICROBIANA
	NUTRIÇÃO MICROBIANA
	NUTRIÇÃO MICROBIANA
	CRESCIMENTO MICROBIANO
	CRESCIMENTO MICROBIANO
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	CRESCIMENTO MICROBIANO
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	MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
	MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO - DIRETA
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