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Cromatografia liquida de alta eficiencia

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2
	 
Albino Gimo Munharo 
António Augusto António
Daína Teresa Madoro
Hossane Ganda Marangaje
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Cromatografia por Afinidade
Licenciatura em Ensino de Química com Habilitação em Gestão de Laboratórios
Universidade Pedagógica
Beira
2018
 Albino Gimo Munharo
António Augusto António
Daína Teresa Madoro
Hossane Ganda Marangaje
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Cromatografia por Afinidade
 
	Trabalho de Pesquisa Bibliográfica apresentado ao Departamento de Química, Faculdade de Ciências Naturais e Matemática. Delegação da Beira, para fins de Avaliação na cadeira de Química Física II, do 1º semestre do 3º Ano.
Docente: dr. Mário Pereira
Universidade Pedagógica
Beira
2018
Índice
Introdução	3
1.	Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)	5
1.1.	Definição	5
1.2.	Instrumentação	5
1.2.1.	Reservatórios de Fase Móvel e Sistemas de Tratamento de Solventes	6
1.2.2.	Sistemas de Bombeamento	7
1.3.	Sistema de Injecção da Amostra	8
1.3.1.	Colunas para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência	8
1.3.2.	Colunas de Protecção ou de Guarda	9
1.3.3.	Termóstato para Colunas	10
1.4.	Detectores usados em CLAE	11
1.5.	Registo dos dados	17
1.6.	Cromatografia por Afinidade	18
Conclusão	19
Bibliografia	20
Introdução
O presente trabalho tem como tema "Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Cromatografia por Afinidade". O trabalho será abordado em duas secções aparentemente distintas, mas que ao fundo são a mesma coisa. Na primeira secção será tratada a questão da cromatografia líquida de alta eficiência, em que dar-se-á a conhecer a definição do seu conceito, também far-se-á a menção esquemática de como a técnica ocorre. Também de modo a tornar mais fácil a compreensão do mesmo, na parte de instrumentação mostrar-se-ão algumas figuras dos componentes do aparelho usado nesta técnica. Na segunda secção apresentar-se-á uma abordagem simples, clara breve, e concisa sobre a cromatografia por afinidade.
1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
1.1. Definição
A cromatografia líquida de alta eficiência, CLAE, é um tipo de cromatografia que emprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária muito finamente dividida. Para se obter vazões satisfatórias, o líquido deve ser pressurizado a muitas centenas de libras por polegada quadrada.
1.2. Instrumentação
Pressões de bombeamento de muitas atmosferas são requeridas para se obter vazões razoáveis com recheios na faixa de tamanho de 3 a 10 m, que é comum na cromatografia líquida moderna. Em consequência dessas altas pressões, o equipamento para a cromatografia líquida de alta eficiência tende a ser consideravelmente mais complexo e caro do que aquele encontrado em outros tipos de cromatografia. A figura abaixo apresenta um diagrama especificando os componentes importantes de um instrumento típico de CLAE.
Figura 1 Aplicações da cromatografia líquida. Observe que os tipos de cromatografia à direita do diagrama são mais adequados para os compostos polares. As técnicas na parte de baixo do diagrama são mais adequadas para as espécies de alta massa molecular.
Figura 2 Diagrama de blocos mostrando os componentes típicos de um sistema
1.2.1. Reservatórios de Fase Móvel e Sistemas de Tratamento de Solventes 
Um instrumento moderno de CLAE é equipado com um ou mais reservatórios de vidro, cada um deles tendo 500 mL ou mais de um solvente. Frequentemente são tomadas medidas para a remoção de gases dissolvidos e de partículas presentes nos líquidos. Os primeiros produzem bolhas na coluna causando, assim, um alargamento de banda; além disso, as bolhas e os particulados interferem no desempenho da maioria dos detectores.
Os desgaseificadores podem ser constituídos por sistemas de aplicação de vácuo, sistemas de destilação, um dispositivo de aquecimento e agitação ou, como mostrado na Figura 32-3, um sistema de sparging, no qual os gases dissolvidos são arrastados para fora da solução por pequenas bolhas de um gás inerte que não é solúvel na fase móvel.
Uma eluição com um único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante é isocrática. Na eluição por gradiente, dois (e às vezes mais) sistemas solventes que diferem significativamente em polaridade são empregados. A razão entre os dois solventes varia em uma forma pré-programada durante a separação, algumas vezes de forma contínua e por vezes em etapas. Como exposto na Figura 2, a eluição por gradiente geralmente melhora a eficiência da separação, da mesma forma que a programação de temperatura o faz na cromatografia gasosa.
Os instrumentos modernos de CLAE são equipados com válvulas que introduzem líquidos a partir de dois ou mais reservatórios em proporções que podem ser variadas continuamente figura 2.
1.2.2. Sistemas de Bombeamento
Os requisitos para as bombas de cromatografia líquida incluem (1) habilidade de gerar pressões de até 6.000 psi (libras/polegadas quadradas), (2) saída livre de pulsação, (3) vazões na faixa de 0,1 a 10 mL/min, (4) reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor e (5) resistência à corrosão por uma grande variedade de solventes. As altas pressões geradas pelas bombas de cromatografia líquida não representam risco de explosão porque os líquidos não são muito compressíveis. Assim, a ruptura de um componente resulta somente em vazamento do solvente. Contudo, esse vazamento pode constituir um risco de incêndio ou para o ambiente, dependendo do tipo de solvente.
Há três tipos principais de bomba: a de seringa accionada por rosca, a bomba recíproca e a bomba pneumática de pressão constante. As bombas de seringa produzem uma saída livre de pulsação cuja vazão pode ser controlada facilmente; no entanto, elas apresentam pequena capacidade (250 mL) e se tornam inconvenientes quando é preciso trocar o solvente. A Figura 3 exibe o tipo de bomba mais amplamente empregado, a bomba recíproca. Esse dispositivo consiste em uma câmara pequena cilíndrica que é preenchida e esvaziada pela movimentação de ida e vinda de um pistão. O movimento da bomba produz um fluxo pulsado que deve ser atenuado posteriormente. As vantagens das bombas recíprocas incluem o volume interno pequeno, alta pressão de saída (até 10.000psi), pronta adaptação à eluição por gradiente e vazões constantes, as quais são bastante independentes da queda de pressão imposta pela coluna e da viscosidade do solvente. A maioria dos cromatógrafos comerciais modernos emprega bombas recíprocas.
Alguns instrumentos usam bombas pneumáticas, que, na sua forma mais simples, consistem em um reservatório maleável de solvente inserido em um vaso que pode ser pressurizado por um gás comprimido.
As bombas desse tipo são simples, de baixo custo e livres de pulsação; porém, elas apresentam capacidade e pressão de saída limitadas e as vazões são dependentes da viscosidade do solvente. Além disso, elas não podem ser adaptadas para eluição por gradiente.
1.3. Sistema de Injecção da Amostra
O método mais empregado de introdução da amostra em cromatografia líquida é baseado em um sistema com alça de amostragem como aquele mostrado na Figura 4. Esses dispositivos são partes integradas de alguns equipamentos de cromatografia líquida. Frequentemente as alças intercambiáveis estão disponíveis para permitir a escolha do volume da amostra de 5 a 500 mL. A repetibilidade relativa das injecções com uma alça de amostragem é de poucos décimos por cento. Muitos instrumentos de CLAE incorporam auto-amostradores que operam em conjunto com injectores automáticos. Esses dispositivos podem injectar volumes variáveis.
1.3.1. Colunas para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
As colunas cromatográficas são geralmente construídas de tubos de aço inoxidável, embora tubos de vidro ou Tygon sejam algumas vezes empregados em aplicações de baixa pressão (6 600 psi). A maioria das 
Figura 3 Uma bomba recíproca para CLAE
colunas apresenta comprimento na faixa de 10 a 30 cm e possuem diâmetros internos entre 2 e 5 mm. Os recheios das colunas tipicamenteapresentam partículas de diâmetros entre 3 e 10 m. As colunas desse tipo fornecem entre 40.000 e 60.000 pratos m-1. Recentemente, as microcolunas tornaram-se disponíveis com diâmetros internos de 1 a 4,6 mm e comprimentos de 3 a 7,5 cm. Essas colunas, as quais são recheadas com partículas de 3 a 5 m, contêm cerca de 100.000 pratos m-1 e apresentam vantagens quanto à velocidade e consumo mínimo de solventes. Essa última vantagem é de importância significativa, pois os solventes de altíssima pureza necessários à cromatografia líquida custam muito caro, tanto para ser adquiridos como para ser descartados após o uso. A Figura 32-7 ilustra a velocidade com a qual a separação pode ser realizada nesse tipo de coluna. Nesse caso, oito componentes de diversos tipos são separados em cerca de 15 s. A coluna é de 4 cm de comprimento e possui um diâmetro interno de 4 mm, sendo recheada com partículas de 3 mm.
O tipo mais comum de recheio para a cromatografia líquida é preparado a partir de partículas de sílica, as quais são sintetizadas aglomerando-se partículas de sílica de tamanho submicrométrico sob condições que levam à formação de partículas maiores com diâmetros altamente uniformes. As partículas resultantes são geralmente recobertas com filmes orgânicos, os quais são quimicamente ou fisicamente ligados à superfície. Outros materiais de recheio incluem as partículas de alumina, de polímeros porosos e resinas de troca iónica.
Figura 4 Sistema com alça de amostragem para a cromatografia líquida.
1.3.2. Colunas de Protecção ou de Guarda
Com frequência, uma coluna curta de protecção é posicionada à frente da coluna analítica com a finalidade de aumentar a vida útil desta última, removendo o material particulado e os contaminantes dos solventes. Além disso, em cromatografia líquida, a coluna de protecção serve para saturar a fase móvel com a fase estacionária de forma que as perdas de fase estacionária na coluna analítica sejam minimizadas. A composição da coluna de protecção deve ser similar àquela da coluna analítica; o tamanho de partícula, contudo, é normalmente maior para minimizar a queda de pressão.
1.3.3. Termóstato para Colunas
Para muitas aplicações, um controle rigoroso da temperatura não é necessário e as colunas operam à temperatura ambiente. Frequentemente, contudo, obtêm-se melhores cromatogramas mantendo-se a coluna à temperatura constante dentro de poucos décimos de graus Célsius. A maioria dos instrumentos comerciais está equipada com aquecedores que controlam a temperatura da coluna com tolerância de poucos décimos de graus desde a temperatura próxima à ambiente até 150 ºC. As colunas podem também ser munidas de uma camisa de termostatização pela qual flui a água de um banho termostático de forma a promover um controle preciso da temperatura.
Figura 5 Modelo molecular do p-xileno.
Figura 6 Separação isocrática de altavelocidade. Dimensões da coluna: comprimento de 4 cm, diâmetro interno de 0,4 cm; recheio:spherisorb 3 fase móvel: 4,1 % de acetato deetila em n-hexano. Compostos: (1) p-xileno, (2)anisol, (3) acetato de benzila, (4) ftalato de dioctila,(5) ftalato de dipentila, (6) ftalato de dibutila, (7)ftalato de dipropila, (8) ftalato de dietila.
1.4. Detectores usados em CLAE
Uma instrumentação melhor é requerida para a CLAE, em relação à sensibilidade dos detectores, para monitorização do efluente que sai da coluna. Infelizmente as propriedades físicas ou físico-químicas da amostra e fase móvel são, muitas vezes, similares. Algumas soluções para o problema de detecção têm sido procuradas no desenvolvimento da CLAE:
- Medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas: amostras e fase móvel
- Medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel.
- Detecção após a eliminação da fase móvel.
Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma destas soluções. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes características:
a) Alta sensibilidade e baixo limite de detecção
b) Resposta rápida a todos os solutos
c) Insensibilidade a mudanças nas temperatura e na vazão da fase móvel.
d) Resposta independente da fase móvel
e) Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector.
f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto
g) Não destruição do soluto.
h) Segurança e conveniência de uso.
i) Informação qualitativa do pico desejado.
Infelizmente, não existe um detector que apresente todas estas propriedades, a não ser que ele seja desenvolvido.
· Detectores por absovância no ultravioleta e no visível
Nos detectores espectrofotométricos o seu funcionamento baseia-se na absorvância de luz por parte da amostra ao passar através dela qualquer radiação eletromagnética; normalmente isto ocorre no ultravioleta até o infravermelho, em um dado comprimento de onda. Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta: o de comprimento de onda variável (espectrofotómetros), que não só é de aplicação mais variada e sensível, mas também é mais caro, e o chamado fotométrico que funciona com um ou dois comprimentos de onda fixos. Este último é sensível, económico e mais que suficiente para se conseguir bons resultados com todos os compostos que absorvem luz no comprimento de onda em que ele funciona. Este tipo de detector é normalmente insensível a variações de vazão e temperatura. A maioria dos detectores de comprimento de onda fixo, oferecidos no mercado, opera em um comprimento de onda de 254 nm e um de 280 nm, resultado da absorvância de luz em 254 nm e da emissão de luz em 280 nm por uma substância fosforescente. Em óptimas condições, pode-se atingir sensibilidades de até 0,001 unidades de absorvância e, se o composto absorve intensamente na faixa de UV, é possível detectar quantidades de amostras da ordem de nanogramas (10 -9 g). Quando se aplica gradiente na fase móvel e ela apresenta variação significativa de absorvância para o UV, é necessário utilizar a cela de referência para compensar esta variação. Se a fase móvel não absorve ou se a absorvância é constante, pode-se deixar a cela de referência vazia ou cheia com um dos componentes da fase móvel. A Figura 7 mostra o desenho de uma célula para CLAE.
Figura 7 Célula do detector de ultravioleta para CLAE.
Espectrofotómetros de comprimentos de onda variável UV-VIS, cobrindo a faixa de 190-800 nm, através de monocromador que selecciona o comprimento de onda desejado do feixe de luz emitido pelas lâmpadas de deutério (UV) ou tungsténio (VIS), oferecem várias vantagens sobre os instrumentos de comprimento de onda fixo:
a) Apresenta alta absorvância para vários componentes devido à escolha de comprimento de onda e, consequentemente, tem maior sensibilidade.
b) Permite maior selectividade, desde que um determinado comprimento de onda pode ser escolhido, onde o soluto de interesse absorve bastante e outros não.
c) Promove eficiência em eluição por gradiente através da habilidade de seleccionar um comprimento de onda onde os componentes da fase móvel não apresentam uma variação de absorvância para diferentes concentrações.
d) Permitir obter o espectro de absorvância de cada componente em separado após parar a vazão da fase móvel.
Análises em diferentes comprimentos de onda também são possíveis com os detectores espectrofotométricos através de um conjunto de fotodiodos. Esses fotodiodos, selectivos a determinados comprimentos de onda, em grande número, cerca de 250, permitem levantar o espectro da substância durante a eluição. Este detector é denominado detector de rede de diodos (diode array detector), cujo esquema se encontra na figura 8. Os detectores de rede de diodos eram, até a alguns anos, pouco sensíveis, mas na actualidade, com a melhora dos computadores com programas dedicados para este fim, com o aumento da sensibilidade dos diodos e com correcções da aberração da rede de difracção, eles aumentaram sua sensibilidade e aplicabilidade. 
Figura 8 Esquema de um detector de rede de diodos.
Na figura 9, pode-se observar um espectro deabsorção, obtido em três dimensões por microcomputador acoplado ao detector de rede de diodos, da eluição de uma mistura de três
esteróides, obtido em intervalos de 5 segundos.
Figura 9 Espectro de absorção da eluição de uma mistura de três esteróides, varreduras em intervalos de 5 segundos.
· Detectores por Índice de Refracção
É o segundo detector mais usado na CLAE. Este detector acompanha continuamente a diferença de índice de refracção entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. Para solutos que não absorvem no UV ou visível e, consequentemente, não são detectados por detectores fotométricos, a melhor escolha é o detector por índice de refracção. A resposta deste detector é universal e sua sensibilidade é moderada, geralmente da ordem de micrograma (10 -6 g). Este nível de concentração corresponde a uma diferença no índice de refracção entre a amostra e a fase móvel de aproximadamente 10 -7 unidades de índice de refracção. Para observar esta diferença é necessário um controle de temperatura de aproximadamente 0,001 o C, o que normalmente é conseguido por circulação de água, de uma boa fonte termostatizada, através do refractómetro ou um bom controle da temperatura ambiente.
Além deste problema com a temperatura, existem ainda outros: a sensibilidade às variações de vazão e mudanças na composição da fase móvel, que impedem o uso de gradiente por ser difícil encontrar um par de solventes com índices de refracção idênticos. Qualquer mudança na composição da mistura mudará o índice de refracção da fase móvel, então, o lado da referência terá que mudar, o que é quase impossível.
Figura 10 Esquema de um detector refratométrico do Tipo Frescl
Figura 11 Esquema de um detector refratométrico por deflexão
· Detectores por Fluorescência
A espectroscopia de fluorescência é um método de detecção dos mais sensíveis da actualidade, específico para compostos que fluorescem. Em boas condições é possível detectar quantidades da ordem de picogramas (10- 12g), o que é comparável aos detectores por captura de electrões em CG. Uma alta intensidade de fluorescência é esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que não podem produzir estruturas fortemente iónicas.
A fase móvel empregada nos detectores de fluorescência deve ser cuidadosamente seleccionada, pois a intensidade de emissão depende do meio em que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicações, tais como análise quantitativa e eluição por gradiente, nas quais deve-se seleccionar os componentes da fase móvel para não atrapalhar a fluorescência.
Os detectores para fluorescência também podem proporcionar espectros de emissão das amostras retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV é necessária em ambos os detectores, por absorvância no UV e por fluorescência, eles podem ser combinados em um só detector.
Figura 12 Esquema de um detector por fluorescência
· Detectores Electroquímicos
Métodos electroquímicos de detecção oferecem a mais promissora solução para o problema de desenvolvimento de um detector para CLAE suficientemente sensível e não baseado em absorvância de luz. Eles oferecem vantagens de alta selectividade, alta sensibilidade e serem muito bons para as análises de traços. É importante destacar que, neste tipo de detecção, a amostra tem que ser constituída de iões ou compostos que sofram ou oxidação ou redução (detectores polarográficos). Este detector é selectivo, porque detecta somente as espécies que se oxidam (ou reduzem) em um potencial inferior ou igua1 ao fixado. Os detectores electroquímicos são bons para as modalidades de cromatografia que usam fases móveis aquosas, tais como a cromatografia por troca iónica, por exclusão ou com fase reversa por pares de iões ou ate com fase reversa com compostos oxidáveis na fase água -álcool.
· Detectores de Espectrometria de Massas
Os espectrómetros de massas são um tipo de detector para CLAE que pode combinar sensibilidade, versatilidade e universalidade e seu potencial de utilização é muito grande. A maior dificuldade na utilização destes detectores é o interfaceamento com o sistema de CLAE e o seu alto custo quando comparado aos outros detectores mais usados.
1.5. Registo dos dados
Para registar ou manipular os dados obtidos pelos detectores na CLAE pode se usar simplesmente um registador ou, de maneira sofisticada, um integrador ou mesmo um microcomputador.
No caso de registador utiliza-se, normalmente, um potenciómetro de 1 a 10mV. Sua função é representar graficamente o sinal eléctrico emitido pelo detector. As características importantes destes registadores são respostas rápidas da pena e velocidade do papel.
Além do tempo de retenção para cada pico, o integrador fornece área de cada um dos picos e a área total de todos eles, que são dados mais precisos do que a altura ou área dos picos que normalmente é utilizada quando se faz somente o registo.
Para manter ou aumentar a versatilidade, exactidão e precisão da CLAE, pode se utilizar um microcomputador. Este microcomputador é usado tanto para processar os dados obtidos pelo detector, armazenando e registando, como para controlar a composição da fase móvel para separação com eluição isocrática ou com gradiente, a vazão que sai da bomba, Injecção da amostra e temperatura da coluna.
Outra vantagem do microcomputador é que ele monitora continuamente todos os parâmetros da separação e diagnostica problemas, o quer facilita muito o serviço do operador.
1.6. Cromatografia por Afinidade
A cromatografia por afinidade envolve a ligação covalente de um reagente denominado ligante de afinidade a um suporte sólido. 15 Os ligantes de afinidade típicos são anticorpos, inibidores enzimáticos ou outras moléculas que se ligam reversivamente e selectivamente com as moléculas do análito na amostra. Quando uma amostra passa através da coluna, somente as moléculas que se ligam selectivamente ao ligante de afinidade são retidas. As moléculas que não se ligam passam pela coluna juntamente com a fase móvel. Após a remoção das moléculas indesejadas, os análitos retidos podem ser eluídos alterando-se as condições da fase móvel.
A fase estacionária para a cromatografia por afinidade é um sólido como a agarose ou microesferas de vidro poroso no qual o ligante de afinidade é imobilizado. A fase móvel em cromatografia por afinidade desempenha dois papéis distintos. Primeiro, ela deve permitir uma forte ligação das moléculas do análito com o ligante. Segundo, uma vez que as espécies indesejáveis tenham sido removidas, a fase móvel deve enfraquecer ou eliminar a interacção entre o análito e o ligante de forma que o análito possa ser eluído.
Geralmente as alterações no pH ou na força iónica são empregadas para se alterar as condições de eluição durante os dois estágios do processo.
A cromatografia por afinidade apresenta uma extraordinária selectividade como sua vantagem principal. O seu principal uso é no isolamento de biomoléculas durante a etapa preparativa.
Conclusão
Conclui-se que a cromatografia líquida de alta eficiência, é uma técnica que utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sob altas pressões. Também conclui-se que esta técnica pode dar resultados de forma mais rápida, e eficiente em relação a outras formas cromatográficas.
Bibliografia
HARRIS, Daniel C., Analise Química Quantitativa, 7ª edição, LTC, São Paulo, 2008.
SKOOG, Douglas A, et al, Fundamentos de Química Analitica, 8ª edição, Cengage Learning, São Paulo, 2011.
COLLINS, Carol H, et al., Fundamentos de Cromatografia, s/ed, Editora Unicamp, São Paulo, 2006.

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