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Aula 3 - Avaliação laboratorial das proteínas plasmáticas

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Letícia Morais | Bioquímica Aplicada às Análises Clínicas – Aula 3: Avaliação laboratorial das proteínas plasmáticas 
BURTIS, C.A.; BRUNTS, D. Tietz Fundamentos de Química Clinica e Diagnostico Molecular. 7ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2016. Capítulo 18.
AMINOÁCIDOS
► Unidades básicas dos peptídeos e proteínas.
► Diversas funções no metabolismo e neurotransmissão.
► Mensuração em fluidos fisiológicos → estudo do metabolismo e diagnóstico de patologias e doenças genéticas.
► Bioquímica básica:
· Compostos orgânicos contendo grupo amino e carboxílico;
· Possui cadeia lateral variável → participação na manutenção do balanço de nitrogênio em mamíferos;
· Maioria das proteínas é composta por 20 dos 21 aa;
· Com exceção da glicina, todos os α-aminoácidos são assimétricos em relação ao C α e apresentam configuração L;
· Propriedades acidobásicas:
· Dependem da cadeia lateral;
· pH 7,0: rede de carga é 0 → cargas positivas e negativas balanceadas = anfótero;
· ↓pH: aa tem rede de carga positiva, grupos protonados;
· ↑pH: aa tem rede de carga negativa, grupos desprotonados.
· Influência das cadeias laterais:
· Fornecem variações consideráveis na estrutura e propriedades físicas;
· Podem ser acidas, básicas ou neutra, variando em tamanho e hidrofobicidade.
· Metabolismo de aminoácidos:
Figura 1: Origem e destino dos aminoácidos
· Sintetizados como α-cetoácidos → transaminados por outro aa (glutamato);
· Proteína proveniente da dieta: fonte primaria de aa para síntese proteica;
· Renovação proteica endógena: fonte alternativa de aa livre (degradação de proteínas musculares → fonte de aa);
· Aporte inadequado de proteínas é um problema frequente para pacientes cirúrgicos, queimados e que sofreram traumas;
· Aa são precursores de muitos hormônios e moléculas de sinalização;
· Fígado: órgão ativo no metabolismo e síntese de aa, sendo principal local para ocorrer ciclo da ureia e absorção de aa da circulação e conversão para fonte de combustível por meio da transaminação. Fonte primaria de proteínas plasmáticas complexas da circulação.
► Implicações clínicas:
· Analises de aa no plasma e urina = avaliação de distúrbios no metabolismo de aa;
· ↑excreção de aa na urina: primário (defeito enzimático genético) ou secundário (aminoacidúria, distúrbio em um órgão como o fígado, que é o local mais propicio para metabolismo de aa ou doença renal tubular generalizada).
► Análise de aminoácidos:
· Concentrações de aa são avaliadas no plasma, urina ou LCR;
· Aa são filtrados pelas membranas glomerulares renais e maioria é reabsorvido nos túbulos renais por sistema de transporte ativo (dependente dos transportadores ligados à membrana e da concentração intracelular de → ↑excreção na urina pode ser resultado de concentração plasmática excessiva, dano tubular ou defeito no sistema de reabsorção de um aa;
· Excreção urinaria de aa varia com idade, gravidez (↑aminoacidúria);
· Testes quantitativos:
· Testes de confirmação com analise de plasma/urina em doenças incomuns;
· Monitoramento de pacientes;
· Técnicas para quantificação: cromatografia de troca iônica com reação pós-coluna, cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massas, CLAE em fase-reversa; eletroforese capilar e CG;
· Principal uso clinico: detecção e monitoramento de doenças hereditárias.
PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS
► Proteínas: classificadas como fibrosas (estruturais) ou globulares (↑interesse clinico – hemoglobina, enzimas, hormônios e proteínas plasmáticas).
► Funções das proteínas: componentes estruturais, auxiliar catalise de reações químicas, geração de energia, produzir motilidade de elementos contrateis, atuar como canais iônicos e bombas, transporte, defesa imunológica (Ac e componentes do sistema complemento), receptores, rede de sinalização. 
► Proteínas defeituosas e enzimas reguladoras de vias metabólicas: ↓
► Bioquímica básica:
· Proteínas são formadas por polímeros de aa ligados pela ligação peptídica;
· Diferentes cadeias laterais dos aa = diversidade estrutural e funcional;
· Estrutura:
· Primaria: sequência de aa;
· Secundaria: organização α-hélice e β-folheada;
· Terciaria: dobragem da cadeia em estrutura tridimensional;
· Quaternária: associação de múltiplas cadeias peptídicas;
· Ligantes e grupos prostéticos: elementos estruturais adicionais. Classificadas como metaloproteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, mucoproteínas e fosfoproteínas.
· Propriedades:
· Tamanho molecular: proteínas possuem tamanhos distintos = separação por dialise ou ultrafiltração. Técnicas: cromatografia de filtração em gel, eletroforese em gel por poro gradiente e ultracentrifugação em gradiente de densidade;
· Diferença de solubilidade: solubilidade é afetada por pH, força iônica, temperatura, constate dielétrica do solvente e varia em pH, concentração de sal ou concentração de solvente orgânico;
· Carga elétrica: permite separação por eletroforese, focalização isoelétrica e cromatografia de troca iônica;
· Adsorção diferencial: adsorção em materiais inertes finamente divididos (interações hidrofóbicas, absortivas, iônicas e moleculares);
· Interações moleculares especificas: envolvem ligação de Ac com Ag, receptor com ligante ou enzima com inibidor/substrato. Atividade = cromatografia de afinidade, ensaios imunoquímicos;
· Densidade: ultracentrifugação por gradiente de densidade.
ANÁLISE DE PROTEÍNA
► Envolve métodos qualitativos e quantitativos.
► Quantitativo: métodos físicos (corante, absorbância, precipitação seletiva, espectrometria de massa), medição da atividade para componentes e imunoensaios.
► Qualitativo: revela mudanças em estrutura por meio da eletroforese, cromatografia, analise genética, ensaios funcionais e espectrometria de massa.
► Medidas da Concentração Total de Proteínas:
· Determinar [proteína] por secagem da solução e pesagem: técnica simples e imprecisa (presença de sais, água adsorvida e impurezas);
· Reagente de biureto: presença de peptídeos com ≥ 3 resíduos de aa, moderada sensibilidade, útil para soluções com ↑[proteínas];
· Espectrofotometria direta: conteúdo variável de aa entre proteínas em mistura → compromete precisão e especificidade do teste;
· Ligação de corante: ligação variável de corantes para diferentes proteínas = limitação;
· Refratometria: avalia em curto tempo, altas concentrações de proteína;
· Turbidimetria e nefelometria: fácil, ágil, amplamente usados;
· Intervalos de referência: concentração sérica de proteína total em adultos saudáveis é cerca de 6,4-8,3 g/dL.
► Técnicas eletroforéticas:
· Eletroforese: estudar e medir mudanças qualiquantitativas de proteínas presentes em fluidos biológicos;
· Mobilidade das proteínas: depende da razão entre carga e tamanho da molécula;
· Eletroforese do soro é realizada em pH 8,6 com ↓força iônica.
PROTEÍNAS DO SORO E DO PLASMA
► Muitas proteínas tem concentrações similares no soro e plasma.
► Soro e plasma consistem em duas frações: albumina e globulinas.
► Proteínas plasmáticas mais abundantes são segregadas pelo fígado ou por linfócitos B.
► Aplicações clinicas: alterações quantitativas de proteínas especificadas são o principal indicador de diagnóstico.
► Proteínas plasmáticas são distribuídas entre os espaços intra e extravascular → proteínas grandes = intravascular; proteínas pequenas = distribuídas uniformemente.
► Fatores fisiológicos e patológicos, como estado nutricional, função hepática, mudanças fisiológicas e mudanças terapêuticas nas concentrações de hormônios esteroidais, afetam seletivamente as concentrações de subconjuntos de proteínas plasmáticas.
► Concentrações de proteínas plasmáticas dependem de suas taxas de síntese, distribuição extracelular e taxas de depuração.
► Eletroforese de Proteínas (EEP): técnica simples para se separar proteínas do soro, sendo teste de triagem mais utilizado para investigação de anormalidades das proteínas séricas. Em condições normais, são separadas 5 bandas do soro: albumina, α-1, α-2, β e γ-globulinas.
► Existem mais de 300 proteínas plasmáticas já identificadas, algumas sendo avaliadas rotineiramente em amostras(sangue, urina, LCR, liquido amniótico, peritoneal, pleural ou sinovial, fezes e saliva).
► Proteínas totais: alteração na concentração de proteínas em doenças resulta da resposta ou reação de fase aguda, resposta inespecífica à inflamação ou lesão tecidual. Dosagem isolada da proteína total = pouco valor (alteração em uma das frações pode ser compensada por alteração oposta de outra). Ex.: doenças crônicas → ↓albumina, ↑γ-globulina.
► Hiperproteinemia:
► Hipoproteinemia:
► Proteínas totais x Interferências com resultados falsos:
PROTEÍNAS PLASMÁTICAS INDIVIDUAIS
Albumina
► Proteína plasmática mais abundante (60%).
► Principal componente proteico dos líquidos corporais extravasculares.
► ↑solúvel em água → ↑carga liquida negativa em pH fisiológico.
► Sintetizada pelas células parenquimais hepáticas → taxa de síntese controlada pela Pressão Osmótica Coloidal (POC) e consumo de proteínas, sendo reduzida por citocinas inflamatórias.
► Funções: manutenção da POC nos espaços vasculares e extravasculares, ligação e transporte de vários compostos (ác. graxos, fosfolipídios, íons metálicos, fármacos, hormônios e bilirrubina).
Figura 2: Efeitos fisiológicos da albumina
► Importância clínica:
· Hiperalbuminemia: rara, desidratações agudas;
· Hipoalbunemia: ↓síntese (má absorção, má nutrição e disfunção hepática), perda proteica extravascular (nefropatias, enteropatias, insuficiência cardíaca congestiva e queimaduras extensas), analbuminemia e distribuição anormal ou diluição.
► Consequências da hipoalbuminemia: edema, ascite e anasarca, icterícia, bradicardia, hipotensão e hipotermia, cardiomegalia, esplenomegalia e hepatomegalia, encefalopatias, atrofia testicular e ginecomastia.
α-1-glicoproteína ácida
► ↑carga liquida negativa e muito solúvel em água. 
► Síntese: células parenquimais hepáticas.
► Liga-se e inibe hormônios básicos e lipofílicos. ↓disponibilidade de fármacos (propranolol, quinidina, clopromazina, BZD).
► ↑concentração plasmática: doença inflamatória TGI e neoplasias; ↓concentração plasmática: síndrome nefrótica.
α-1-Antitripsina
► Inibe serina protease especifica estruturalmente relacionada à tripsina.
► Síntese e catabolismo: células parenquimais hepáticas.
► Inibidor mais importante da elastase leucocitária (liberada no processo de fagocitose por leucócitos polimorfonucleares).
► Previne perda do recolhimento elástico (enfisema pulmonar). Se ↓concentração devido a deficiências genéticas → ↑risco.
► ↑concentração plasmática: reações de fase aguda e estrógenos; ↓concentração plasmática: síndrome do desconforto neonatal, pancreatite grave e doenças associadas à perda proteica.
α-1-Fetoproteína
► Proteína sérica dominante no início da fase embrionária. Concentração sérica em adultos serve como marcador de tumores hepatocelulares e de carcinoma celular germinativos.
► ↑concentração no líquido amniótico ou soro materno: tubo neural aberto ou defeito na parede abdominal do feto.
► ↑concentração plasmática: gestação múltipla, morte fetal, hemorragias fetomaternas, carcinomas hepatocelulares e de células germinativas.
α-2-macroglobulina
► Inibe protease (que apresentam serina, cisteína e íons metálicos em seus sítios proteolíticos) no plasma. Molécula grande que não se difunde do espaço plasmático para líquidos extracelulares em quantidades significativas.
► ↑Concentração plasmática: estrogênios e síndrome nefrotica; ↓concentração plasmática: pancreatite aguda grave e carcinoma avançado de próstata.
Haptoglobina
► Liga-se irreversivelmente à Hb e apresenta 4 cadeias polipeptídicas ligadas por pontes dissulfeto.
► Forma grandes complexos com Hb → impede perda renal de Hb e ferro.
► Importante nos processos inflamatórios e atuam como bacteriostático em bactérias que requerem ferro.
► ↑Concentração plasmática: hormônios corticosteroides, AINES, síndrome nefrotica, obstrução biliar na ausência de doença hepatocelular grave. ↓concentração: doença hepatocelular aguda ou crônica.
Ceruloplasmina
► Contém 95% do cobre sérico total.
► Síntese: células parenquimais hepáticas → adição do cobre por ATPase intracelular.
► Envolvida em reações de oxido-redução no plasma e incorporação de ferro na Transferrina sem formação de produtos tóxicos.
► Deficiência: genética (primária) ou causas secundarias (falta de incorporação de cobre nas moléculas sintetizadas → insuficiência de cobre na dieta, doença de Menkes, doença de Wilson e perda de sangue ou síndrome de perda proteica renal ou TGI).
Transferrina
► Principal proteína plasmática de transporte do ferro.
► Complexo transporta ferro para células → incorporação nos citocromos, Hb, mioglobina, locais de reserva (fígado e sistema reticuloendotelial).
► Diagnostico diferencial e monitoramento da anemia ferropriva.
► ↓Ferro = ↑Transferrina (mas menos saturada).
► ↑Concentração plasmática: gravidez, administração de estrógenos, inflamação e tumores malignos.
Proteína C Reativa
► Uma das primeiras proteínas de reação de fase aguda a se tornar elevada em doenças inflamatórias.
► Ativa via do complemento e inicia opsonização, fagocitose e lise de organismos invasores.
► ↑Concentração após infarto do miocárdio, estresse, trauma, infecção, inflamação, cirurgia, proliferação neoplásica.
Transtirretina e Proteína de Ligação ao Retinol (PLR)
► Proteínas de transporte que migram juntas como complexo molecular (1:1). Estão aumentadas no tratamento com corticosteroides, AINES e doença de Hodgkin. Menores concentrações: doença hepática, má nutrição proteica, reação de fase aguda.
► Transtirretina: transporta (10%) hormônios T3 e T4. Síntese hepática e CNS (↓quantidade).
► PLR: proteína transportadora do retinol, ↑concentração na doença renal crônica. 
PROTEÍNAS DO COMPLEMENTO
► 20 proteínas do sangue e dos fluidos teciduais.
► Interagem sequencialmente com complexos Ag-Ac, entre si e com membranas celulares.
► Envolvidas na defesa do hospedeiro.
► Síntese: fígado e monócitos (pequenas quantidades).
► Após reação aguda: ↑C3 e ↑C4; obstrução biliar: ↑C3 e ↑C4.
► ↓C3 = infecção grave causada por bactérias encapsuladas.
IMUNOGLOBULINAS
► Ac: produzidos por plasmócitos (linfócitos B transformados após exposição a Ag estranho) da MO → resposta imune.
► Ig: 2 cadeias polipeptídicas leves idênticas e 2 cadeias polipeptídicas pesadas (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM) idênticas que estão ligadas por pontes dissulfeto.
	Imunoglobulinas
	Características
	IgG
	Principal Ig sérica. Envolvida na ativação do complemento e opsonização. VR: 700-1500 mg/dL
	IgM
	Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda). Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados. VR: 55-200 mg/dL; 45-180 mg/dL
	IgA
	Presente no soro, secreções e mucosas. Funções de opsonização. VR: 80-385 mg/dL
	IgD
	Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como receptor de Ag.
	IgE
	Desencadeia liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e eosinófilos. Responsável pelas alergias e confere proteção contra parasitas
GAMOPATIAS
► Policlonal: forma não especifica em uma grande variedade de infecções (↑difuso das várias Ig em toda região das γ-globulinas observada na eletroforese de proteínas). Ex.: hepatopatia crônica, cirrose hepática e hepatite crônica.
► Monoclonal (paraproteína): elevação de uma determinada Ig formando pico estreito na fração gamaglobulinas). Proliferação de um só tipo de clone de plasmócitos que irão sintetizar um único tipo de Ig. Ex.: mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, calazar.
MIELOMA MULTIPLO
► ↓Produção da serie branca e vermelha e de formação de plaquetas.
► Metástase óssea, manifestando dor óssea.
► ↓Produção de Ig normais.
► Consequências: anemia e susceptibilidade à infecção.
► Tratamento: drogas supressoras da MO e plasmaférese.
Proteína de Bence-Jones
► 5% dos casos de mieloma: somente cadeias leves são eliminadas na urina. Essas proteínas = proteína de Bence-Jones.
► Detecção: eletroforese de urina ou pesquisa de Bence-Jones na urina.
Proteínas plasmáticas
Mantêm pressão osmótica do plasma;
Apolipoproteínas
Solubilizam lipidios
Transporte de hormônios, vitaminas,metais e fármacos
Hemoglobina
Transporte de oxigênio
Fatores de coagulação proteicos 
Regulam hemostasia
Desidratação
Mieloma múltiplo
Macroglobulinemia
Hepatite autoimune crônica
Lupus Eritematoso Sistêmico (LES)
Artrite Reumatóide (AR)
Endocardite bacteriana subaguda
Sarcoidose
Leishmaniose visceral
Linfogranuloma
Gravidez
Hemodiluição ou hiper-hidratação
Queimaduras severas
Cirrose hepática e alcoolismo crônico
Desnutrição grave
Hipertireoidismo
Hemorragia grave
Síndrome nefrótica
Distúrbios da síntese proteica
Deficiência de cálcio e vitamina D
Síndrome de má absorção
Imobilização prolongada
Resultados falsamente elevados
Anabólicos
Corticoesteroides
Resultados falsamente reduzidos
Estrogênios
Laxativos
Esteroides
Digitálicos
Tiroxina
Contraceptivos
Albumina
Manutenção da pressão intravascular
Equilíbrio ácido base
Efeito antioxidante
Transporte de drogas
Transporte de íons, ác. graxos, bilirrubina e hormônios
Efeito anticoagulante
Integridade microvascular
Aminoacidúria de transbordamento
↑concentração elevada;
Excede limite de reabsorção renal.
Aminoacidúria renal
Concentração normal;
Defeito congênito ou adquirido no sistema de reabsorção tubular renal.
Aminoacidúria sem limite
Concentração plasmática normal;
Todo aa excretado na urina.

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