DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO (PROTOZOÁRIOS)

Prévia do material em texto

DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO (PROTOZOÁRIOS)
AMEBÍASE
Introdução
Amebíase é definida como a infecção pelo protozoário Entamoeba histolytica, do filo Sarcomastigota, classe Sarcodina, ordem Amoebida, gênero Entamoeba, apresentando ou não manifestações clínicas. 
Cerca de 10% exibem sintomas clínicos, que vão desde os não específicos de doença gastrintestinal até disenteria, colite e ameboma.
A transmissão de E. histolytica se dá por meio da ingestão de alimentos e água contaminados com cistos tetranucleados, ocorrendo o desencistamento no íleo, com formação de oito amebas metacísticas, que migram para o ceco, onde formam colônia. Moscas e baratas contribuem para sua transmissão em áreas endêmicas.
Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial de E. histolytica é feito tradicionalmente por meio do exame parasitológico das fezes, em que geralmente se encontram cistos em fezes consistentes e trofozoítos em fezes diarreicas ou semidiarreicas.
O exame de uma única amostra de fezes muitas vezes não leva a um diagnóstico definitivo, uma vez que o número de cistos liberados diariamente varia muito nos portadores. Trabalhos realizados concluem que, quando um portador elimina 100.000 cistos por dia, a probabilidade de diagnóstico mostra ser apenas de 50%, aumentando esse índice para 82% quando três amostras são analisadas em um período de 8 dias.
Nas fezes diarreicas, o tempo decorrente da coleta à realização do exame tem sido um fator que dificulta o diagnóstico em razão da natureza frágil das amebas.
A inexperiência técnica tem registrado erros no diagnóstico de E. histolytica, já que resultados falso-negativos têm sido observados quando parasitos encontrados nas fezes não são identificados, e resultados falso-positivos ocorrem quando leucócitos, outras amebas, células sanguíneas ou Blastocystis são identificados erroneamente como E. histolytica.
GIARDÍASE
Introdução 
O gênero Giardia inclui protozoários flagelados parasitos do intestino delgado de mamíferos, aves, répteis e anfíbios, sendo nestes hospedeiros, o agente responsável pela infecção denominada giardíase.
Dentre as seis espécies aceitas, Giardia duodenalis (= Giardia intestinalis = Giardia lamblia) é a única espécie que parasita o homem, podendo infectar outros mamíferos, incluindo animais de companhia como cães e gatos e uma variedade de animais domésticos e silvestres.
Morfologia
Giardia apresenta duas formas evolutivas, o trofozoíto e o cisto, que diferem quanto à organização estrutural e bioquímica. O trofozoíto é encontrado no intestino delgado, sendo a forma responsável pelas manifestações clínicas da infecção.
Sintomatologia 
A giardíase apresenta um espectro clínico diverso que inclui desde indivíduos assintomáticos até pacientes sintomáticos que podem apresentar um quadro de diarreia aguda e autolimitante, ou um quadro de diarreia persistente, com evidência de má absorção e perda de peso, que muitas vezes não responde ao tratamento específico, mesmo em indivíduos imunocompetentes.
Diagnóstico Laboratorial
Parasitológico 
Até o presente, o diagnóstico laboratorial das infecções por Giardia é feito tradicionalmente pelo exame microscópico de fezes e baseia-se na identificação das formas evolutivas do parasito (trofozoítos e/ou cistos). Embora muitos pesquisadores questionem a eficiência do exame coproparasitológico, esta ainda é a principal alternativa diagnostica nas infecções por este protozoário. Contudo, é necessário levar em consideração alguns fatores que podem interferir na eficiência de um determinado método e conduzir a resultados falso-negativos.
Entre esses fatores, destacam -se as características associadas ao aspecto e à consistência da amostra fecal. Estas características fornecem informações sobre a forma evolutiva a ser pesquisada, uma vez que em fezes formadas e fezes diarreicas predominam cistos e trofozoítos, respectivamente. Assim, os cistos são encontrados nas fezes da maioria dos indivíduos com giardíase, enquanto o encontro de trofozoítos é menos frequente, e está, geralmente, associado às infecções sintomáticas. Além disso, é importante destacar que, com essas informações, o profissional pode orientar-se quanto às condições em que as amostras de fezes devem ser coletadas. Diante disso, deve-se estar atento ao fato de que, como nas fezes diarreicas encontram-se trofozoítos que perecem rapidamente (15-20 minutos), recomenda-se a coleta das amostras fecais em recipientes contendo substâncias fixadoras como formol a 10%, MIF (mertiolato-iodo-formol) ou SAF (acetato de sódio-ácido acético-formaldeído). Por outro lado, as formas císticas são mais resistentes, no entanto, se o tempo após a coleta das fezes até a análise do material ultrapassar 48 horas sugere-se que a amostra seja mantida a 4°C, por no máximo 1 semana, ou que seja preservada em substâncias fixadoras.
CRIPTOSRIDIOSE
Cryptosporidium spp.
As espécies do gênero Cryptosporidium são protozoários que pertencem ao filo Apicomplexa e ordem Coccidia. Cryptosporidium parvum, descrito como parasito de animais inferiores em 1907, somente foi reconhecido infectando seres humanos em 1976 e, até o surgimento dos primeiros casos clínicos de AIDS, a infecção humana por esse coccídeo foi considerada rara. A partir de 1983, muitos pacientes com AIDS e outros tipos de imunodepressão foram identificados apresentando surtos de diarreia causados por Cryptosporidium spp. em decorrência do desenvolvimento de técnicas mais sensíveis de diagnóstico coprológico.
Posteriormente, ficou evidente que o Cryptosporidium spp. não se limitava a desenvolver comportamento oportunista em pacientes imunodeprimidos, mas era encontrado associado a processos diarreicos autolimitados em indivíduos imunocompetentes.
A identificação de oocistos nas fezes dos indivíduos infectados ainda constitui a maneira mais usada para diagnosticar a criptosporidiose. Esse processo tornou-se viável após a descoberta de que os oocistos de Cryptosporidium são corados e facilmente distinguíveis de outras estruturas habitualmente presentes nas fezes, como as leveduras, por meio de corantes álcool-acidorresistentes. Diversas técnicas têm sido utilizadas e, embora não se saiba com certeza quantas amostras devam ser examinadas para garantir elevada sensibilidade, recomenda-se que, no mínimo, três amostras fecais, colhidas em ocasiões diferentes, sejam empregadas. Outras técnicas de coloração, incluindo imunofluorescência com anticorpo monoclonal, podem ser utilizadas. Métodos de imunodiagnóstico, mais úteis em levantamentos epidemiológicos do que no diagnóstico individual, têm sido descritos. Mais recentemente, a obtenção de primers permitiu o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular para o diagnóstico de infecções por Cryptosporidium capazes de detectar a existência de pequenas quantidades de oocistos nas fezes e identificar com segurança as espécies envolvidas.
TOXOPLASMOSE
Aspectos epidemiológicos e parasitológicos
Zoonose de felídeos causada pelo Toxoplasma gondii, a toxoplasmose é universalmente disseminada, infectando principalmente aves e mamíferos e, notadamente, o ser humano com níveis elevados de prevalência.
O contágio pelo Toxoplasma se dá, predominantemente, pela ingestão de oocistos, os quais são eliminados pelas fezes de gatos ou de outros felídeos e podem permanecer viáveis no solo por muito tempo, resistindo a variações de temperatura e à dessecação, o que torna provável a infecção por inalação de poeira contaminada pelo parasito. Ocorre também pelo consumo de alimentos de origem animal, especialmente de carnes mal cozidas, contendo cistos (bradizoítas). Quando oocistos e cistos são digeridos no intestino delgado dos felídeos, liberam, respectivamente, esporozoítos e taquizoítos – estes últimos oriundos da transformação de bradizoítas que estavam dentro dos cistos. Os parasitos penetram nas células do hospedeiro e se reproduzem rapidamente,disseminando­se por via hematogênica, abrangendo variados órgãos e tecidos.
 Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose tem base na pesquisa de anticorpos contra o parasito. Segundo as características imunoquímicas desses anticorpos, diferentes marcadores sorológicos têm sido descritos para distinguir entre infecção latente, comum na população, e infecção recente ou toxoplasmose doença. Outras respostas se esperam, também, da sorologia da toxoplasmose, como datar na gestante seu contágio pelo Toxoplasma, ou no imunodeficiente, detectar a reagudização de uma toxoplasmose latente.
Detecção de ácidos nucleicos | Reação em cadeia da polimerase
Ainda que presente em número extremamente reduzido, ou mesmo quando lisado, o Toxoplasma pode ser identificado pela detecção de segmentos característicos de seus ácidos nucleicos, depois de amplificados pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Dependendo do que se quer demonstrar, pode­se realizar a detecção de fragmentos de DNA do parasito ou a análise de expressão gênica quando a técnica utiliza amostras de RNA submetidas à transcrição reversa. Ainda dispendioso e exigindo a adoção de medidas rigorosas para evitar resultados falso­positivos, esse teste tem sido muito utilizado, podendo ser completado em até 24 h. Entretanto, não existem até o momento kits comerciais de desempenho comprovado, tampouco consenso quanto aos procedimentos de extração dos ácidos nucleicos ou aos segmentos a serem amplificados, com resultados bastante heterogêneos entre laboratórios. Assim, para identificação do Toxoplasma, podem ser amplificados vários segmentos de DNA oriundos de diferentes genes, como P30, AF146527 ou p529, DNA ribosomal, gene B1,13–19 sendo este último o mais empregado.
Testes sorológicos
Descrito por Sabin e Feldman, o teste do corante deu lugar ao teste de imunofluorescência indireta (IFI), que, além de mais prático e fornecer resultados comparáveis, permitiu a identificação de anticorpos IgG, IgM e demais imunoglobulinas. 
Teste de avidez de anticorpos IgG
A afinidade ou avidez com que os anticorpos IgG se ligam a seus respectivos antígenos pode ser avaliada pela maior ou menor facilidade de quebra dessa ligação. Mede­se por teste imunoenzimático ELISA­IgG modificado, pela dissociação dos complexos antígeno­anticorpo formados e liberação dos anticorpos IgG de baixa avidez e por meio de solução caotrópica (p. ex., de ureia 6M [ELISA­ureia]). Para esse fim, após a incubação do soro na placa, esta é lavada com a solução de ureia e, em seguida, procede­se à reação pela incubação com o conjugado enzimático. Uma baixa avidez é indicada por acentuada diminuição do título com relação ao título original obtido sem o tratamento pela ureia. O resultado é expresso pela porcentagem de IgG remanescente, dada pelo cálculo: (título após ureia/título original) × 100.
O teste de avidez de anticorpos IgG tem sido utilizado para estimar a época em que a toxoplasmose foi adquirida pela gestante, e também quando não se dispõe de testes quantitativos de detecção de IgM e há suspeita da presença de IgM residual, não indicativa de infecção aguda ou recente. Nesses casos, é factível a utilização de anticorpos dirigidos contra antígenos de excreção/secreção de T. gondii em testes de avidez de anti­ corpos IgG, com resultados bastante satisfatórios.
Detecção de anticorpos IgM
A pesquisa de anticorpos IgM pelas técnicas indiretas, com conjugados fluorescentes ou enzimáticos, está sujeita a resultados falso­positivos, pela interferência de fatores reumatoides (FR) frequentemente presentes no soro. O fator reumatoide é um anticorpo IgM contra IgG. Assim, durante o teste, quando anticorpos IgG antitoxoplasma presentes no soro fixam­se aos antígenos do parasito, o FR, por sua vez, fixa­se aos IgG e irá reagir com o conjugado anti­IgM. Um teste prévio para detecção do fator reumatoide nos soros não soluciona a maioria dos casos por ser positivo apenas em níveis muito elevados de FR encontrados na artrite reumatoide, para cujo diagnóstico o teste se destina. A remoção prévia das IgG dos soros por precipitação com um soro anti­IgG soluciona o problema. Esse procedimento evita o aparecimento de resultados falso­negativos que decorrem da competição dos anticorpos IgG, impedindo os IgM de se fixarem aos antígenos.