CAP 6 - CRESCIMENTO MICROBIANO

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CAP.6 - CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento celular é definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celulares. Este aumento pode estar associado ao aumento do tamanho de uma célula ou do número de células, em consequência da multiplicação celular, ou a ambos.
O crescimento microbiano é normalmente associado ao crescimento de uma população de células de um dado microrganismo, ou seja, com o aumento do número de células da população.
Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fissão binária ou por gemulação, em resultado do que uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de geração ou de duplicação.
Durante um ciclo de divisão celular correspondente ao tempo de geração ou duplicação, todos os componentes celulares mensuráveis (por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas, lipídios) duplicam, acompanhando a duplicação do número de células e da quantidade de biomassa presente. Em condições nutricionais e ambientais adequadas, às quais o microrganismo está adaptado, a população celular encontra-se numa fase de crescimento equilibrado, a fase de crescimento exponencial.
O crescimento microbiano pode ocorrer em meio líquido com as células em suspensão ou associado a superfícies, sob a forma de biofilmes.
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO
Fatores físicos
- TEMPERATURA
Os microrganismos são classificados em três grupos principais, com base na faixa de temperatura que eles preferem: psicrófilos (micróbios que gostam de frio), mesófilos (micróbios que gostam de temperaturas moderadas) e termófilos (micróbios que gostam de calor).
Cada espécie bacteriana cresce a temperaturas mínima, ótima e máxima específicas. A temperatura mínima de cresci- mento é a menor temperatura na qual a espécie pode crescer. A temperatura ótima de crescimento é a temperatura na qual a espécie cresce melhor. A temperatura máxima de crescimento é a maior temperatura na qual o crescimento é possível.
- PH
A maioria das bactérias cresce melhor em uma faixa estreita de pH próxima da neutralidade, entre pH 6,5 e 7,5.
Acidófilas – São extraordinariamente tolerantes à acidez, crescem em ph ácido abaixo de 4.
Para neutralizar os ácidos e manter o ph apropriado, tampões químicos são incluídos no meio de cultura. As peptonas e aminoácidos atuam como tampões em alguns meios e também há fosfato em alguns meios. A vantagem do fosfato é que o seu efeito tampão atua na maioria das bactérias.
- PRESSÃO OSMÓTICA
O crescimento da célula é inibido à medida que a membrana plasmática se afasta da parede celular. Portanto, a adição de sais (ou outros solutos) em uma solução e o aumento resultante na pressão osmótica podem ser utilizados para preservar alimentos.
 Halófilos extremos/Halófilos obrigatórios: Adaptam-se bem às altas concentrações de sais, que eles, de fato, necessitam dos sais para o crescimento.
Halófilos facultativos: São mais comuns, não requerem altas concentrações de sais, mas são capazes de crescerem em concentrações salinas de até 2% podendo tolerar até 15% de sal, uma concentração que inibe o crescimento de muitos outros organismos.
Fatores químicos
- CARBONO
O carbono é o esqueleto estrutura da matéria viva; é necessário para todos os compostos orgânicos que constituem uma célula viva. 
Quimioheterotrófico – obtém carbono de fonte orgânica (proteína,carboidratos)
Quimioautotrófico e fotoautotrófico – obtém carbono do CO2.
- NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO
Os organismos utilizam o nitrogênio essencialmente para formar o grupo amino dos aminoácidos das proteínas.
O enxofre é utilizado para sintetizar os aminoácidos contendo enxofre e vitaminas, como a tiamina e a biotina.
O fósforo é essencial para a síntese dos ácidos nucleicos e dos fosfolípidios das membranas celulares.
- ELEMENTOS-TRAÇO
Os microrganismos requerem quantidades muito pequenas de outros elementos minerais, como ferro, cobre, molibdênio e zinco, os quais são chamados de elementos-traço. A maioria é essencial as funções de certas enzimas, geralmente como cofatores.
- OXIGÊNIO
Aeróbios obrigatórios: Organismos que precisam de oxigênio para viver.
Anaeróbios facultativos: Podem utilizar o oxigênio quando ele está presente, mas são capazes de continuar a crescer utilizando a fermentação ou respiração anaeróbia quando o oxigênio não está disponível. Contudo, sua eficiência é reduzida na presença do O2. Ex.: Escherichia coli;
Anaeróbios obrigatórios: Incapazes de utilizar o oxigênio molecular nas reações de produção de energia. Essas bactérias utilizam os átomos de oxigênio presentes nas matérias celulares; esses átomos geralmente são obtidos da água.
Anaeróbios aerotolerantes: Não podem utilizar o oxigênio para o seu crescimento, porém toleram bem a sua presença. 
Mircroaerófilas: São aeróbias e requerem oxigênio, contudo, crescem somente em concentrações de oxigênio inferiores às do ar. Não crescem perto da superfície rica em oxigênio, nem abaixo da faixa estreita de oxigênio adequado. Essa tolerância limitada provavelmente é devida a sua sensibilidade aos radicais superóxidos e peróxidos que são produzidos em concentrações letais sob condições ricas em oxigênio.
FATORES DE CRESCIMENTO ORGÂNICO
- BIOFILME
Os quais são uma camada fina e viscosa envolvendo bactérias que se aderem a uma superfície. Portanto, os biofilmes não são somente camadas limosas bacterianas, mas sistemas biológicos; as bactérias são organizadas em uma comunidade funcional coordenada. Os biofilmes geralmente são fixados em superfícies, como uma pedra em um lago, um dente humano ou uma membrana mucosa.
Os microrganismos nos biofilmes podem trabalhar em cooperação para desenvolver tarefas complexas. Por exemplo, o sistema digestório dos animais ruminantes, como o gado, requer muitas espécies diferentes de microrganismos para quebrar a ce- lulose. Os microrganismos no sistema digestório dos ruminantes estão localizados essencialmente em comunidades de biofilmes. Os biofilmes também são elementos essenciais para o funciona- mento adequado dos sistemas de tratamento de resíduos. Contudo, eles também podem ser um problema em canos e tubulações, onde seu acúmulo impede a circulação.
- MEIO DE CULTURA
Material nutriente preparado para o crescimento de microrganismos em laboratório.
Os microrganismos que são introduzidos em um meio de cultura para dar início ao crescimento são chamados de inoculo. Os micróbios que crescem e se multiplicam no interior ou sobre um meio de cultura são chamados de cultura.
Quais critérios o meio de cultura deve preencher? 
Primeiro, ele deve conter os nutrientes adequados para o microrganismo específico que queremos cultivar. Deve conter também uma quantidade de água suficiente, pH apropriado e um nível conveniente de oxigênio, ou talvez nenhum. O meio deve ser estéril – isto é, inicialmente não deve conter microrganismos vivos – dessa forma, a cultura conterá́ apenas os microrganismos (e sua descendência) que foram introduzidos. Por fim, a cultura em crescimento deve ser incubada em temperatura apropriada.
→ Meio quimicamente definido: É aquele cuja composição exata é conhecida.
Para um Quimioheterotrófico, o meio quimicamente definido deve conter fatores de crescimento orgânicos, que servem como fonte de carbono e energia.
→ Meio complexo: Feitos de nutrientes, como extratos de leveduras, carnes ou plantas, ou de produtos de digestão de proteínas. A composição química exata varia um pouco de acordo com o lote. No meio complexo, as necessidades de energia, carbono, nitrogênio e enxofre dos microrganismos em cultura são fornecidas essencialmente pelas proteínas.
Se um meio complexo se encontra na forma líquida, é chamado de caldo nutriente. Quando o ágar é adicionado, é chamado de ágar nutriente (ágar em si não é um nutriente!).
→ Meios e métodos para o crescimento anaeróbio (meios redutores): Esses meios contém ingredientes, como o tioglicolato de sódio, que se combinam quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam do meio de cultura. Para cultivar e manter rotineiramente culturas puras deanaeróbios obrigatórios, os microbiologistas utilizam meios redutores armazenados em tubos de ensaio comuns, firmemente tampados. Esses meios são aquecidos rapidamente antes de serem utilizados, a fim de eliminar o oxigênio absorvido.
→ Técnicas especiais de cultura: 
Muitos laboratórios clínicos têm estufas de dióxido de carbono especiais para o crescimento de bactérias aeróbias que requerem concentrações de CO2 mais altas ou mais baixas que a encontrada na atmosfera. Os níveis desejados de CO2 são mantidos por controles eletrônicos. Níveis de CO2 elevados também são obtidos com uma simples jarra com vela. As culturas são colocadas em uma jarra grande, selada, contendo uma vela acesa, que consome o oxigênio. A vela apaga quando o ar da jarra apresenta uma concentração de oxigênio reduzida (cerca de 17% de O2 ainda são adequados ao crescimento de bactérias aeróbias). Uma concentração elevada de CO2 (cerca de 3%) também está presente. Os micróbios que apresentam um melhor crescimento em altas concentrações de CO2 são chamados de capnofílicos. As condições de oxigênio baixo e CO2 alto são similares àquelas encontradas no trato intestinal, no trato respiratório e em outros tecidos corporais onde bactérias patogênicas crescem.
→ Meios de cultivo seletivo e diferencial: Os meios seletivos são elaborados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas e favorecer o crescimento dos microrganismos de interesse. Ex.: O ágar sulfito de bismuto é um meio utilizado para o isolamento bacteriano; os meios diferenciais facilitam a diferenciação das colônias de um microrganismo desejado em relação a outras colônias crescendo na mesma placa. De maneira similar, culturas puras de microrganismos têm reações identificáveis com meios diferenciais em tubos ou placas. Ex.: O ágar-sangue utilizado para identificar espécies bacterianas que destroem hemácias.
→ Meios de enriquecimento: Para enriquecer uma cultura geralmente é líquido e fornece nutrientes e condições ambientais que favorecem o crescimento de um microrganismo específico, e não de outros. Nesse sentido, também é meio seletivo, mas elaborado para amplificar até níveis detectáveis um número muito pequeno do microrganismo de interesse.
- OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS
A maioria dos trabalhos de microbiologia requer culturas puras ou clones da bactéria. O método de isolamento mais comumente utilizado para a obtenção de culturas puras é o método do esgotamento em placa.
O método do esgotamento em placa funciona bem quando o organismo a ser isolado está presente em grande número em relação à população total. Contudo, quando o microrganismo a ser isolado está presente em um número muito pequeno, sua quantidade pode ser aumentada por enriquecimento seletivo antes do isolamento pelo método do esgotamento em placa.
- PRESERVAÇÃO DE CULTURAS
Dois métodos comuns de preservação de culturas microbianas por longos períodos são o ultracongelamento e a liofilização.
O ultracongelamento é um processo no qual uma cultura pura de microrganismos é colocada em um líquido em suspensão e submetida a um rápido congelamento em temperaturas variando entre -50 a -95°C. A cultura, em geral, pode ser descongelada e cultivada até́ mesmo vários anos depois. 
Durante a liofilização (criodessecação), uma suspensão de micróbios é rapidamente congelada em temperaturas variando entre -54 a -72°C, e a água é removida por um alto vácuo (sublimação). Ainda sob vácuo, o recipiente é selado, derretendo o vidro com uma chama de alta temperatura. O pó́ obtido desse processo, contendo os microrganismos sobre- viventes, pode ser armazenado por anos. Os organismos podem ser reativados a qualquer momento por hidratação com um meio nutriente líquido apropriado.
CRESCIMENTO DE CULTURAS BACTERIANAS
A determinação das quantidades de microrganismos tanto diretamente, por contagem, quanto indiretamente, pela medida de sua atividade metabólica, também é um aspecto importante da microbiologia.
- DIVISÃO BACTERIANA:
Fissão binária/Cissiparidade: Fissão binária é o nome dado ao processo de reprodução assexuada dos organismos unicelulares que consiste na divisão de uma célula em duas por mitose, cada uma com o mesmo genoma da “célula-mãe” (com o mesmo DNA ou material genético da "célula-mãe"). O processo inicia-se com a replicação do DNA, em que cada nova cadeia se liga à membrana celular que, então se invagina e acaba por dividir a célula em duas, num processo chamado citocinese. Os organismos que se reproduzem por fissão binária incluem: bactérias e protozoários.
Brotamento: esse tipo de reprodução assexuada forma o broto, o qual pode soltar-se do organismo que o gerou e formar novo indivíduo. O brotamento é um tipo de reprodução assexuada, assim como a divisão binária, a divisão múltipla, a propagação vegetativa e a fragmentação.
→ Tempo de geração: Tempo necessário para uma célula se dividir (e sua população dobrar). Ela varia consideravelmente entre os organismos e com as condições ambientais, como a temperatura. Para o cálculo do tempo de geração das bactérias, consideraremos somente a reprodução por fissão binária, que é o método mais comum.
- FASES DE CRESCIMENTO
Há quatro fases básicas de crescimento: a fase lag, a fase log, a fase estacionária e a fase de morte celular.
A FASE LAG
Durante esse tempo, as células não estão dormentes. A população microbiana passa por um período de intensa atividade metabólica, envolvendo principalmente a síntese de enzimas e várias moléculas. Ou seja, há atividade de preparação, mas não há produção imediata.
A FASE LOG/EXPONENCIAL
A reprodução celular é mais ativa durante esse período, e o tempo de geração (intervalo durante o qual a população dobra) atinge um mínimo constante. Como o tempo de geração é constante, uma representação logarítmica do crescimento durante a fase log gera uma linha reta. A fase log é o momento de maior atividade metabólica, sendo o preferido para fins industriais, pois o produto precisa ser produzido de maneira eficiente.
A FASE DESACELERAÇÃO
Durante esta fase ocorre um declínio da taxa específica máxima de crescimento, em resultado da diminuição para valores limitantes do crescimento da concentração de um (ou mais) nutrientes essenciais ao metabolismo celular e/ou do aumento da concentração de produtos do metabolismo tóxicos para as células.
FASE ESTACIONÁRIA
Na fase estacionária o esgotamento de um nutriente essencial e/ou a acumulação de produtos inibidores do metabolismo leva a que divisão da população pare. No entanto, em carência de nutrientes, as células podem manter-se viáveis durante períodos de tempo mais ou menos longos, à custa das reservas endógenas, que usam em processos de manutenção. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declínio da concentração de células viáveis durante a fase de morte celular.
FASE DE MORTE CELULAR
O número de mortes eventualmente excede o número de novas células, e a população entra em uma fase de morte, ou fase de declínio logarítmico. Essa fase continua até que a população tenha diminuído para uma pequena fração do número de células da fase anterior ou até que a população morra totalmente.
- MEDIDA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
→ Contagem em placas: Uma grande vantagem desse método é que ele mede o número de células viáveis. Uma desvantagem é que são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas. Isso pode ser um problema sério para certas aplicações, como o controle de qualidade do leite, quando não é possível manter um lote do produto durante esse tempo. 
As contagens em placas consideram que cada bactéria viva cresce e se divide para produzir uma única colônia. Isso não é sempre verdadeiro, pois as bactérias frequentemente crescem unidas em agregados ou cadeias. Portanto, uma colônia muitas vezes resulta não de uma única bactéria, mas de um curto fragmento de uma cadeia ou de um agregado bacteriano. Para refletir essa realidade, as contagens em placas são frequentemente reportadas como unidades formadoras de colônias (UFC). 
Quando uma contagemem placas é feita, é importante que somente um número limitado de colônias se desenvolva na placa. Quando muitas colônias estão presentes, algumas células são reprimidas e não podem se desenvolver; essas condições causam imprecisão na contagem. Uma recomendação da Food and Drug Administration é a contagem de placas com somente 25 a 250 colônias, porém muitos microbiologistas preferem placas com 30 a 300 colônias. Para assegurar que algumas contagens de colônias estejam nessa faixa, o inoculo inicial é diluído várias vezes, em um processo chamado de diluição seriada.
→ Diluição seriada: é a técnica que permite a contagem do número de microrganismos de amostras com concentrações muito elevadas. A amostra deve então ser diluída seriadamente para que a concentração de microrganismos diminua, dando origem a colônias suficientemente separadas, possibilitando assim a contagem.
→ Incorporação em placas (Pour plate) e espalhamento em placas: No método por incorporação, a amostra diluída é pipetada diretamente sobre a placa de Petri e só depois é adicionado o meio de cultura sólido apropriado, no estado liquefeito. Neste método, obtêm-se colónias à superfície e no interior do ágar.
Em todos os métodos, as placas devem ser incubadas em posição invertida. A temperatura e tempo de incubação dependem do microrganismo em causa.
Essa técnica tem algumas desvantagens, pois alguns microrganismos relativamente sensíveis ao calor podem ser danificados pelo ágar fundido, sendo incapazes de formar colônias. Além disso, quando certos meios diferenciais são utilizados, a aparência diferenciada da colônia na superfície é essencial para fins diagnósticos.
Para evitar esses problemas, o método do espalhamento em placa é utilizado com frequência. Um inoculo de 0,1 mL é adicionado à superfície de um meio de ágar previamente solidificado. O inoculou é, então, espalhado de modo uniforme na superfície do meio com um bastão de vidro ou metal com um formato específico, esterilizado. Esse método espalha todas as colônias na superfície e evita o contato entre as células e o ágar fundido.
→ Filtração: Quando a quantidade de bactérias é muito pequena, como em lagos ou correntes de água relativamente puras, as bactérias podem ser contadas pelo método de filtração.
Nessa técnica, pelo menos 100 mL de água são passados por um filtro de membrana fino, cujos poros são muito pequenos para permitirem a passagem de bactérias. Dessa forma, as bactérias são filtradas e ficam retidas na superfície do filtro. Esse filtro é, então, transferido para uma placa de Petri contendo meio nutriente, onde as colônias das bactérias presentes na superfície do filtro se desenvolvem. Esse método é aplicado frequentemente para a detecção e a enumeração de bactérias coliformes, que são indicadoras de contaminação fecal em alimento ou água. As colônias formadas por essas bactérias são distintivas quando é utilizado um meio nutriente diferencial.
→ O método do número mais provável (MNP): 
Essa técnica estatística tem como base o seguinte princípio: quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto no qual mais nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada. 
O MNP é utilizado quando os microrganismos não crescem em um meio sólido (como as bactérias quimioautotróficas nitrificantes). Também é prático quando o crescimento de bactérias em um meio líquido diferencial é utilizado para identificar microrganismos (como bactérias coliformes em água, que fermentam seletiva- mente lactose, produzindo ácido). O MNP fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de uma população bacteriana estar em uma faixa determinada e que o MNP obtido é estatisticamente o número mais provável.
→ Contagem microscópica direta: um determinado volume de uma suspensão bacteriana é colocado dentro de uma área definida em uma lâmina microscópica. Uma amostra de 0,01 mL é espalhada em uma superfície de um centímetro quadrado da lâmina, um corante é adicionado para visualizar a bactéria, e a amostra é observada com lentes objetivas de imersão. Deve ser determinada a área de observação de cada região da lâmina. Após a contagem de diferentes regiões da lâmina, a média do número de bactérias por campo observado pode ser calculada. A partir desses resultados, o número de bactérias no centímetro quadrado contendo a amostra também pode ser calculado. Como essa área da lâmina continha 0,01 mL, o número de bactérias em cada mililitro da suspensão é o número de bactérias na amostra multiplicado por 100. Uma lâmina especialmente projetada, chamada de conta- dor de células de Petroff-Hausser, é utilizada nas contagens microscópicas diretas.
- DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS POR MÉTODOS INDIRETOS
Turbidimetria: À medida que as bactérias se multiplicam em um meio líquido, o meio se torna turvo ou opaco com as células. Portanto, a turbidimetria não é uma medida útil de contaminação de líquidos por um número relativamente pequeno de bactérias.
Atividade metabólica: Esse método assume que a quantidade de um produto metabólico determinado, como um ácido ou CO2, é diretamente proporcional ao número de bactérias presentes.
Peso seco: Neste procedimento, os fungos são removidos do meio de crescimento, filtrados para a remoção de outros materiais e secos em um dessecador, sendo, então, pesados. Para bactérias, o mesmo procedimento básico é seguido.