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Disciplina: Perícia Forense - Genética Forense Aula 7: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e eletroforese capilar – Parte I Apresentação Nesta aula, apresentaremos o histórico que permitiu o desenvolvimento da Técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e destacaremos os princípios gerais para o funcionamento adequado dessa técnica Para isso, apresentaremos o passo a passo que deve ser realizado durante os procedimentos de PCR, que incluí ciclagens de desnaturação, anelamento e extensão do DNA a fim de que ocorra amplificação de uma sequência gênica alvo, pela utilização de oligonucleotídeos sintéticos, denominados primers. Também serão apresentadas as diferentes modalidades dessa técnica que incluem, por exemplo, PCR-RFLP e PCR-nested. Objetivos Identificar os princípios gerais e o funcionamento da técnica de PCR; Demonstrar o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores para o uso em PCR; Listar alguns subtipos diferenciados de PCR. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) possibilita a multiplicação (amplificação) de pedaços (fragmentos) específicos DNA, usando uma enzima específica denominada DNA polimerase, a mesma que participa da duplicação do material genético (DNA) nas células. O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA, utilizando a PCR, trouxe enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas, detecção de agentes infecciosos e aplicações na criminalística. Saiba mais A técnica de Reação em cadeia da Polimerase (PCR) revolucionou a Biologia Molecular ao permitir que o DNA (ácido desoxirribonucleico), presente em pequenas quantidades nas amostras biológicas encontradas em locais de crime, fosse multiplicado (amplificado) em milhares de cópias, com a finalidade de realizar análises mais detalhadas nesse material. Para que isso fosse possível, algumas descobertas históricas foram importantes nesse processo. Vamos estudar isto a seguir. Fonte: Connect world / Shutterstock Histórico e Curiosidades da PCR Em 1960, Arthur Kornberg’s, um bioquímico americano, isolou e caracterizou uma enzima (proteína) denominada DNA polimerase, que é fundamental durante o processo de duplicação do DNA. O isolamento desta enzima possibilitou o desenvolvimento da síntese in vitro de cadeias de DNA, ou seja, tornou possível produzir uma molécula de DNA em laboratório (in vitro). Após alguns anos dessa descoberta, já era possível sintetizar artificialmente oligonucleotídeos, que são sequências curtas de nucleotídeos com as bases nitrogenadas adenina, timina, guanina, citocina (exemplo hipotético: ATTCTGAC). Esse tipo de síntese tornou-se rotina nos laboratórios de pesquisa. A partir desses conhecimentos prévios, Kary Banks Mullis (bioquímico americano), em 1983, criou a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e, em 1985, apresentou a mesma à comunidade científica com uma publicação na renomada revista Science. Essa técnica possibilitou a amplificação in vitro de DNA e foi tão revolucionária que acelerou os estudos de genomas de vários organismos, pois possibilitou a clonagem e o sequenciamento de DNA. Paralelamente à descoberta de Kary Mullis, outros passos históricos foram importantes para os avanços da PCR como uma importante técnica de biologia molecular. Exemplo Por exemplo, em 1986, foi descoberta a bactéria Termus aquaticus, que recebe esse nome por ser um organismo aquático extremófilos, ou seja, que sobrevive em temperaturas superiores a 100ºC. Essa descoberta tornou possível a extração e isolamento da enzima DNA polimerase desse organismo, que recebeu o nome de Taq (abreviatura do nome da espécie da bactéria) polimerase. Isso possibilitou o aperfeiçoamento da técnica, que não necessitava mais da adição da enzima DNA polimerase a cada ciclo da reação, pois a enzima obtida de Termus aquaticus suportava temperaturas muito altas, que rotineiramente são utilizadas na PCR. Atividade 1. Pesquise como foi a descoberta da enzima taq Polimerase de Termus aquaticus. Hoje é possível comprar na indústria, para o uso em laboratórios, diferentes tipos de taq polimerase. Por isso, apresente também alguns desses diferentes tipos de enzimas. Linha do tempo da PCR 1987 Em 1987, Karl Mullis e a empresa onde ele trabalhava, denominada Perkin-Elmer Cetus. Também no ano de 1987, a empresa Perkin- Elmer Cetus desenvolve a automação criando o equipamento chamado de Termociclador, que controla o aumento e redução da temperatura durante a execução da técnica. 1990 Em 1990, o primeiro kit de PCR forense, desenvolvido pela Cetus, foi utilizado para a identificação humana individual. Isso permitiu que o DNA fosse usado como evidência poderosa e aliado do sistema judiciário em diversos casos criminais, trazendo importantes impactos na ciência forense. 1991 A Perkin-Elmer Cetus em 1991, vende a patente para a empresa Hoffmann-La Roche. 1993 Somente em 1993, Karry Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química pela importante e impactante descoberta científica. 2003 Ao longo dos anos, vários subtipos de PCR foram sendo desenvolvidos e mais recentemente, em 2003, houve o desenvolvimento da PCR em Tempo Real, também chamada de qPCR, que permite o acompanhamento em tempo real, pelo computador, da multiplicação do DNA. Princípio Gerais da PCR A Reação em Cadeia da Polimerase permite que a partir de uma única cópia de DNA, sejam obtidos milhões de cópias de DNA amplificadas (multiplicadas) artificialmente. Essa técnica recria em laboratório, o processo natural de replicação (duplicação) da molécula de DNA. Porém, no caso da técnica, a amplificação ocorre apenas em um fragmento específico do DNA e não na molécula toda. Para que seja possível amplificar o DNA, alguns elementos são importantes. O primeiro deles é a presença do DNA de interesse, que deve ter sido previamente extraído, com boa qualidade, a partir de um dos tipos de amostras biológicas presente em cenários de análises forenses. Também se torna necessária a presença da Enzima DNA polimerase, que recebe o nome específico de Taq DNA polimerase, devido ao organismo de origem da mesma. Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, ou seja, ela adiciona nucleotídeos (Adenina, Timina, Guanina e Citocina), desde que exista uma fita molde, como modelo. Recordando que existe complementariedade das bases nitrogenadas entre Timina e Adenina; Guanina e Citocina. Porém, é importante ressaltar que a Taq DNA polimerase só iniciará a ação efetora de inserir nucleotídeos, quando um pequeno fragmento (sequência com poucos nucleotídeos) já estiver ligado a uma das cadeias do DNA, no ponto escolhido para o início da síntese. Esse pequeno fragmento é chamado de iniciador ou primer, em inglês, e é específico para o gene de interesse que se deseja amplificar. Exemplo Em uma situação hipotética, um pesquisador deseja amplificar o gene humano que produz a proteína hemoglobina. Este deverá usar uma sequência de iniciadores (primers) que seja específica para esse gene. É por isso que a PCR passa a ser uma técnica tão específica, pois só existe amplificação na região do gene no qual o primer se liga. Um fator importante é que, normalmente, são utilizados dois primers, aos pares, por reação, chamados de primers sense (forward) e antisense (reserve). De modo que, um primer se liga a uma das fitas moldes e o outro primer se liga a outra fita original. Assim, quando é preparada uma reação de PCR, é necessário misturar todos esses elementos. Este passo inicial é conhecido no jargão laboratorial como “preparação do Mix” de PCR, conforme ilustrado na imagem abaixo. Durante a preparação do Mix de PCR é importante adicionar o DNA de interesse; a enzima Taq polimerase e, junto com ela, o Cloreto de Magnésio (MgCl2) — que é um cofator dessa enzima, ou seja, somente com a presenta desse composto químico a enzima terá funcionamento adequado —, os primers ou iniciadores, os nucleotídeos livres — conhecidos pela sigladATP (nucleotídeo de Adenina), dTTP (nucleotídeo de Timina), dCTP (nucleotídeo de Citocina) e dGTP (nucleotídeo de Guanina) — e um tampão específico para garantir que a reação ocorrerá em meio aquoso e com condições ideais, por exemplo de pH. Passo a passo Após a união de todos os elementos necessários para que a PCR ocorra, é necessário utilizar diferenças de temperatura para garantir que o DNA irá “abrir” sua fita dupla com o aumento da temperatura e também permitir que os primers se liguem em uma das fitas moldes. É importante relembrar que esse processo ocorre naturalmente nas células. Porém, para isso, existem várias enzimas (proteínas), que auxiliam na duplicação do DNA. Como em laboratório não é possível utilizar todas essas enzimas, com exceção da DNA polimerase, essas moléculas foram substituídas por variações de temperatura. Nesse sentido, a reação ocorre em um equipamento denominado de termociclador. Como o próprio nome diz, este equipamento permite que ocorra inúmeros ciclos com diferentes temperaturas, que ora aumentam e ora diminuem. A imagem apresenta um dos modelos de termociclador. Nesse equipamento é possível programar as temperaturas que serão utilizadas durante a reação de PCR, bem como o tempo de cada uma delas e a quantidade de vezes (ciclos) que o processo ocorrerá. Fonte: Cbbiotech <https://portuguese.alibaba.com/product- detail/clinical-chemistry-analyzer-dna-real- time-pcr-machine-thermal-cycler- 60270074047.html> Esse processo de mudanças de temperatura ocorre basicamente em três passos sequenciais: Desnaturação Quando a temperatura atinge em média 95ºC. Nesse momento, no DNA, que é fita dupla, há o rompimento das pontes de hidrogênio, separando as duas fitas que servirão como molde para a produção de uma nova molécula de DNA. Anelamento Quando a temperatura diminui, podendo normalmente variar entre 60ºC e 65ºC. Nessa etapa, o primer (iniciador) consegue se anelar, ou seja, se ligar à fita de DNA molde, baseado no princípio da complementariedade de bases. https://portuguese.alibaba.com/product-detail/clinical-chemistry-analyzer-dna-real-time-pcr-machine-thermal-cycler-60270074047.html Extensão A temperatura volta a aumentar para em torno de 70ºC. Nessa temperatura, a enzima Taq DNA polimerase começa a adicionar nucleotídeos para formar a nova vida de DNA a partir da fita molde original. Esquema dos passos realizados de maneira sequencial em uma reação de PCR. Após a desnaturação das fitas-molde representadas em vermelho, ocorre o pareamento dos primers (fragmentos representados em verde e azul). A enzima, representada em verde, adiciona os nucleotídeos (A; T; C; G) complementarmente às fitas originais. Fonte: Apostila Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível neste link <http://www.imt.usp.br/wp- content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf> . Após a finalização de uma reação de PCR, onde a figura mostra as duas fitas originais (em vermelho) pareadas com as suas fitas-filha complementares, sintetizadas a partir da adição dos nucleotídeos pela Taq DNA polimerase. http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf Fonte: Apostila Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível neste link <http://www.imt.usp.br/wp- content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf> . É importante ressaltar que a amplificação do DNA é exponencial, daí a necessidade de se realizar vários ciclos de: DESNATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO Dessa forma, a partir de uma única molécula de DNA são produzidas duas novas moléculas filhas; das duas moléculas filhas são produzidas quatro novas moléculas e assim por diante. Isso justifica o fato de, no final da reação, serem obtidas milhões de cópias do DNA a partir de uma única molécula inicial. http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf Esquema representativo para demonstrar a amplificação exponencial do DNA em uma PCR. 1 origina 2 moléculas; 2 origina 4 moléculas; 4 origina 8 moléculas e assim por diante. Tipos de PCR: PCR-RFLP e PCR nested Com a evolução da técnica de PCR e com o crescimento contínuo das aplicações que essa técnica permite, surgiram uma infinidade de métodos complementares a partir do entendido básico de PCR. Assim, foram criados novos tipos de PCR, como, por exemplo, PCR-RFLP e PCR nested. PCR-RFLP A ciência forense, por muito tempo, utilizou a técnica de RFLP (Polimorfismo no Tamanho do Fragmento de Restrição) para montar os códigos de barras individuais do DNA de interesse, também chamado de DNA fingerprint. Porém, o processo de obter os resultados utilizando apenas RFLP é bastante laborioso e utiliza componentes radioativos. Com o advento da PCR, foi possível unir as duas técnicas, nascendo, assim, a chamada PCR-RFLP. Assim é possível amplificar um gene específico por PCR e, posteriormente, colocar o produto obtido da PCR em contato com enzimas de restrição para verificar se estas cortam ou não aquela região específica. Por fim, para visualizar essas diferenças, é necessário fazer uma eletroforese em gel de agarose para confirmar presença e ausência de bandas de DNA, bem como a quantidade dessas bandas. Inicialmente, é amplificado um fragmento de 400 pares de bases por PCR. Logo após o corte pela enzima de restrição, que só reconhece como local de corte, nesse caso, a sequência GAATTC, podem haver diferentes possibilidades apresentadas no gel de agarose: 1. O indivíduo AA é homozigoto, ou seja, os seus dois alelos do gene possuem o local de corte da enzima de restrição e, por isso, apresenta duas bandas, sendo uma de 300pb e outra de 100pb; 2. O indivíduo AB é heterozigoto, ou seja, possuí dois alelos diferentes, em um deles tem o sítio para o corte com a enzima de restrição e no outro não. Por isso, aparecem três bandas, duas delas de 300pb e 100pb correspondentes ao alelo onde houve o corte com a enzima de restrição e uma banda de 400pb referente ao alelo que não possuí o sítio de restrição; 3. O indivíduo BB é homozigoto e possuí dois alelos que não apresentam local de corte para enzima de restrição. Por isso que, nesse caso, há a formação de uma única banda com o tamanho de 400pb. PCR Nested Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o fragmento daquela região específica do DNA é amplificado inicialmente utilizando um primer que reconhece uma região mais abrangente do gene, copiando até mesmo sequências localizadas fora dessa região. Com o produto amplificado dessa primeira reação de PCR, é realizada uma nova amplificação agora utilizando primers específicos para sequência-alvo. Por isso, a técnica é chamada de PCR nested, ou seja, fazer uma nova amplificação a partir de um produto que já foi amplificado anteriormente. Este tipo de reação tem como vantagem o ganho em especificidade e eficiência, uma vez que o DNA-molde da segunda amplificação está em concentrações altíssimas, e os primers da segunda etapa têm menos chances de anelamento em sequências inespecíficas. Fonte: Apostila Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Esquema de uma reação de PCR nested. O produto da amplificação do 1º Round (etapa) é utilizado como molde no 2º round (etapa). No final das duas etapas, obtém-se um produto menor daquele obtido na primeira amplificação. Atividade 2. Pesquise quais outros tipos de PCR podem ser utilizados na genética forense. 3. Durante a reação de amplificação (multiplicação) do DNA por PCR existem três passos que ocorrem em sequência devido às mudanças de temperatura no equipamento conhecido como termociclador. Quais são esses três passos em sequência? a) Desnaturação, Anelamento e Extensão b) Extensão, Desnaturação e Anelamento c) Desnaturação, Anelamento e Expansão d) Desnaturação, Amplificação e Extensão 4. Só é possível amplificar o DNA em laboratório pela obtenção de uma enzima específica e pela utilização de oligonucleotídeos iniciadores sintéticos. Como é chamada a enzima e os iniciadores? a) Helicase e primers b) DNA polimerasee sonda c) DNA polimerase e primers d) RNA polimerase e primers 5. Existem diversos subtipos de PCR. Uma dessas versões é aplicada nas análises forenses e utiliza enzimas de restrição, após a amplificação, para detectar variações entre os indivíduos. Qual é esse subtipo de PCR? a) PCR-RAPD b) PCR-RFLP c) PCR-Nested d) PCR em tempo real Referências FARAH, S. B. DNA segredos e mistérios. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2007. GARRIDO, R. G. & RODRIGUES, E. L Ciência forense: da cena do crime ao laboratório de DNA. 1. ed. Projeto Cultural, 2014. Próximos Passos Outros tipos de PCR: multiplex, PCR em tempo real, hot start; Sequenciamento de DNA; Eletroforese capilar. Explore mais Assista aos seguintes vídeos para complementar os assuntos estudados nesta aula: PCR Reação em cadeia da POLIMERASE <https://www.youtube.com/watch?v=T2XGEE0wHRA> ; Extração de DNA, PCR, Eletroforese - Genotipagem ACTN3 (alelos R e X); <https://www.youtube.com/watch?v=I3BIMKNbZL0> Como solucionar crimes usando DNA <https://www.youtube.com/watch?v=rdoFwlPepdk> . https://www.youtube.com/watch?v=T2XGEE0wHRA https://www.youtube.com/watch?v=I3BIMKNbZL0 https://www.youtube.com/watch?v=rdoFwlPepdk
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