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Avaliação da sensibilidade de Leishmania a fármacos Caroline Ricce Espada caroline.respada@gmail.com Aula prá7ca 13/06/2017 Onde vive o parasita Leishmania? Hospedeiro Invertebrado Hospedeiro Vertebrado Teste de fármacos em Leishmania Promas7gotas Amas7gotas Qual modelo vocês escolheriam para testar seu fármaco? Qual a relevância do teste em promas7gotas? Como avaliar sensibilidade das promas7gotas? • Aplicações • Citotoxicidade (perda de células viáveis) • Diferentes 7pos celulares (eucariotas) – Promas7gotas de Leishmania spp. – Epimas7gotas de Trypanosoma cruzi – Macrófagos e linhagens tumorais, dentre outras • Ensaio colorimétrico – Sensível, quan7ta7vo, reproduYvel – Baixo custo Viabilidade celular Ensaio de MTT • Princípio – MTT (3-[4,5-dime7l7azol-2il]-2,5-difeniltetrazolium) • Sal solúvel amarelo • Reduzido a formazan (púrpura) por desidrogenases mitocondriais MTT Formazan Desidrogenases mitocondriais Ensaio de MTT • A quan7dade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de células viáveis na amostra. Leish A Leish B Leish C Leish D 0 µM 12,5 µM 25,0 µM 50,0 µM 70,0 µM 100,0 µM 140,0 µM 200,0 µM Fármaco X B Fármaco A Fármaco B Fármaco C Fármaco D 0 µM 12,5 µM 25,0 µM 50,0 µM 70,0 µM 100,0 µM 140,0 µM 200,0 µM Leishmania sp B Procedimento Plaqueamento L. amazonensis (promas7gotas) Cul7vo em meio M-199 Plaqueamento de fármacos em diferentes concentrações Incubação 24 h à 25 °C Adição de MTT Incubação por 4 horas Adição de SDS Incubação por 18 horas Medição da absorbância 595 nm e 690 nm Resultado Células mortas Células vivas 0 µM Maior dose Resultado Branco Controle Tratamento 0% 100% 0 50 100 150 M ilte fo s in e (u M ) V ia b il id a d e c e lu la r (% ) Resultado Branco Controle Tratamento 0 1 2 3 0 5 0 1 0 0 L o g M ilte fo s in e (mM ) V ia b il id a d e c e lu la r (% ) EC50* * Concentração Efe7va 50% (CE50) EC90* * Concentração Efe7va 90% (CE90) 0 µM 12,5 µM 25,0 µM 50,0 µM 70,0 µM 100,0 µM 140,0 µM 200,0 µM A7vidade prá7ca • Cada grupo (5 alunos) receberá uma folha contendo as DOs referentes a dois ensaios de MTT com isolados de L. braziliensis tratados com miltefosina e/ou anfotericina B • Cada grupo deverá: – Construir um gráfico de histograma (média e desvio padrão) mostrando a % de viabilidade em cada concentração de fármaco. – Construir as curvas de CE50 e CE90 no programa Graph Prism 7.0. – Calcular o valor de CE50 e CE90 dos seus experimentos. – Comparar os resultados. Download Prisma 7.0 • Versão Trial (30 dias): hpps://www.graphpad.com/demos Download Prisma 7.0 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 Construção de Curva de CE50 0,01 µM 1,60 µM 3,00 µM 6,30 µM 13,00µM 25,00µM 50,00µM 100,00µM Construção de Curva de outras CEx Construção de Curva de outras CEx Construção de Curva de outras CEx Construção de Curva de outras CE90 Ele entende F como “porcentagem de sobrevivência” por isso usamos 10 ao invés de 90 Construção de Curva de outras CE90 Construção de Curva de outras CE90 0,01 µM 1,60 µM 3,00 µM 6,30 µM 13,00µM 25,00µM 50,00µM 100,00µM Observando os resultados de outras formas: Observando os resultados de outras formas: Observando os resultados de outras formas: Observando os resultados de outras formas: A7vidade prá7ca • Cada grupo (5 alunos) receberá uma folha contendo as DOs referentes a um ensaio de MTT com isolados de L. braziliensis tratados com miltefosina ou anfotericina B • Cada grupo deverá: – Construir um gráfico de histograma (média e desvio padrão) mostrando a % de viabilidade em cada concentração de fármaco. – Construir as curvas de CE50 e CE90 no programa Graph Prism 7.0. – Calcular o valor de CE50 e CE90 dos seus experimentos. – Comparar os resultados.