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Prévia do material em texto

Avaliação	da	sensibilidade	de	
Leishmania	a	fármacos	
Caroline	Ricce	Espada	
caroline.respada@gmail.com	
Aula	prá7ca	13/06/2017	
Onde	vive	o	parasita	Leishmania?	
Hospedeiro		
Invertebrado	
Hospedeiro		
Vertebrado	
Teste	de	fármacos	em	Leishmania	
Promas7gotas	 Amas7gotas	
Qual	modelo	vocês	escolheriam	para	testar	seu	fármaco?	
Qual	a	relevância	do	teste	em	promas7gotas?	
Como	avaliar	sensibilidade	das	
promas7gotas?	
•  Aplicações	
•  Citotoxicidade	(perda	de	células	viáveis)	
•  Diferentes	7pos	celulares	(eucariotas)	
–  Promas7gotas	de	Leishmania	spp.	
–  Epimas7gotas	de	Trypanosoma	cruzi	
–  Macrófagos	e	linhagens	tumorais,	dentre	outras	
•  Ensaio	colorimétrico	
–  Sensível,	quan7ta7vo,	reproduYvel	
–  Baixo	custo	
Viabilidade	celular	
Ensaio	de	MTT	
•  Princípio	
– MTT	(3-[4,5-dime7l7azol-2il]-2,5-difeniltetrazolium)	
•  Sal	solúvel	amarelo	
•  Reduzido	a	formazan	(púrpura)	por	desidrogenases	
mitocondriais	
MTT	 Formazan	
Desidrogenases	
mitocondriais	
Ensaio	de	MTT	
•  A	quan7dade	de	formazan	produzida	é	diretamente	
proporcional	ao	número	de	células	viáveis	na	
amostra.	
Leish	A	 Leish	B	 Leish	C	 Leish	D	
0	µM	
	
	
	
12,5	µM	
25,0	µM	
50,0	µM	
		
70,0	µM	
100,0	µM	
140,0	µM	
200,0	µM	
Fármaco	X	
B	
Fármaco	A	 Fármaco	B	 Fármaco	C	 Fármaco	D	
0	µM	
	
	
	
12,5	µM	
25,0	µM	
50,0	µM	
		
70,0	µM	
100,0	µM	
140,0	µM	
200,0	µM	
Leishmania	sp	
B	
Procedimento	
Plaqueamento	
L.	amazonensis	
(promas7gotas)	
Cul7vo	em	meio	M-199	
Plaqueamento		
de	fármacos	em	diferentes	
concentrações	
Incubação		
24	h	à	25	°C	
Adição	de	MTT	
Incubação	por	4	horas	
Adição	de	SDS	
Incubação	por	18	horas	
Medição	da	absorbância	
595	nm	e	690	nm	
Resultado	
Células	mortas	Células	vivas	
0	µM	
	
	
	
Maior	
dose	
	
	
	
Resultado	
Branco	Controle	 Tratamento	
0%	100%	
0
50
100
150
M ilte fo s in e (u M )
V
ia
b
il
id
a
d
e
 c
e
lu
la
r 
(%
)
Resultado	
Branco	 Controle	Tratamento	
0 1 2 3
0
5 0
1 0 0
L o g M ilte fo s in e (mM )
V
ia
b
il
id
a
d
e
 c
e
lu
la
r 
(%
)
EC50* 
*	Concentração	Efe7va	50%	(CE50)	
EC90* 
*	Concentração	Efe7va	90%	(CE90)	
0	µM	
	
	
	
12,5	µM	
25,0	µM	
50,0	µM	
		 70,0	µM	
100,0	µM	
140,0	µM	 200,0	µM	
A7vidade	prá7ca	
•  Cada	grupo	(5	alunos)	receberá	uma	folha	contendo	as	DOs	
referentes	a	dois	ensaios	de	MTT	com	isolados	de	L.	braziliensis	
tratados	com	miltefosina	e/ou	anfotericina	B	
•  Cada	grupo	deverá:	
–  Construir	um	gráfico	de	histograma	(média	e	desvio	padrão)	
mostrando	a	%	de	viabilidade	em	cada	concentração	de	
fármaco.		
–  Construir	as	curvas	de	CE50	e	CE90	no	programa	Graph	Prism	7.0.	
–  Calcular	o	valor	de	CE50	e	CE90	dos	seus	experimentos.	
–  Comparar	os	resultados.	
Download	Prisma	7.0	
•  Versão	Trial	(30	dias):	
hpps://www.graphpad.com/demos	
	
	
Download	Prisma	7.0	
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
Construção	de	Curva	de	CE50		
0,01	µM	 1,60	µM	
	 3,00	µM	
	 6,30	µM	
	 13,00µM	
	
25,00µM	
	 50,00µM	
	
100,00µM	
	
Construção	de	Curva	de	outras	CEx		
Construção	de	Curva	de	outras	CEx		
Construção	de	Curva	de	outras	CEx		
Construção	de	Curva	de	outras	CE90		
Ele	entende	F	como	
“porcentagem	de	
sobrevivência”	por	isso	
usamos	10	ao	invés	de	90	
Construção	de	Curva	de	outras	CE90		
Construção	de	Curva	de	outras	CE90		
0,01	µM	 1,60	µM	
	 3,00	µM	
	 6,30	µM	
	 13,00µM	
	
25,00µM	
	 50,00µM	
	
100,00µM	
	
Observando	os	resultados	de	outras	formas:	
Observando	os	resultados	de	outras	formas:	
Observando	os	resultados	de	outras	formas:	
Observando	os	resultados	de	outras	formas:	
A7vidade	prá7ca	
•  Cada	grupo	(5	alunos)	receberá	uma	folha	contendo	as	DOs	
referentes	a	um	ensaio	de	MTT	com	isolados	de	L.	braziliensis	
tratados	com	miltefosina	ou	anfotericina	B	
•  Cada	grupo	deverá:	
–  Construir	um	gráfico	de	histograma	(média	e	desvio	padrão)	
mostrando	a	%	de	viabilidade	em	cada	concentração	de	
fármaco.		
–  Construir	as	curvas	de	CE50	e	CE90	no	programa	Graph	Prism	7.0.	
–  Calcular	o	valor	de	CE50	e	CE90	dos	seus	experimentos.	
–  Comparar	os	resultados.

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