Material - Introdução a análise fitoquímica

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INTRODUÇÃO À ANÁLISE FITOQUÍMICA
- DA COLETA À ANÁLISE -
UNIVERSIDADE DE CRUZ ALTA - UNICRUZ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE E AGRÁRIAS
CURSO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA DE FARMACOGNOSIA
Prof. Regis A. N. Deuschle
OBJETIVO DE UMA PESQUISA FITOQUÍMICA
“Avaliar a presença de constituintes químicos de 
espécies vegetais e/ou determinar sua estrutura”
Identificar grupos de metabólitos 
secundários de uma planta, cuja 
composição ainda é desconhecida
Buscar um grupo específico de 
metabólitos numa planta cuja 
composição já é conhecida
Isolamento, 
caracterização 
estrutural
Investigação baseada em 
aspectos etnofarmacológicos e 
quimiotaxonômicos
UMA ANÁLISE FITOQUÍMICA APRESENTA AS
SEGUINTES ETAPAS
Obtenção do material vegetal
Preparação para a análise
Extração 
Análise fitoquímica
Fracionamento, isolamento e purificação
OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL
Interessei-me por estudar uma determinada 
planta... E agora?
*Atenção
ORIENTAÇÕES GERAIS PARA COLETA
Levar em conta os fatores que influenciam no conteúdo de 
metabólitos secundários:
• Datar a coleta (época do ano e clima)
• Local da coleta (latitude e longitude)
• Fase da vida da planta 
• Escolher horário de coleta adequado
• Evitar a coleta de partes afetadas por doenças, parasitas e materiais 
estranhos 
Reservar uma parte para o espécime-testemunha
Fresco Dessecado
Coletou? OK! Fez a exsicata? OK!, então é hora da...
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE!
• Criopreservação
• Termoestabilização: calor seco ou úmido
• Uperização - UHT
Métodos de estabilização
• Expor o material a temperaturas relativamente baixas, 
normalmente inferiores a 60 °C, com um longo tempo de contato 
(tempo depende do órgão da planta e sua consistência)
• a secagem pode ser realizada ao ar livre ou com a utilização de 
ar quente, em estufas
• Dispor o material em camadas finas
Métodos para secagem
•Ao ar livre
•Mais econômica (mas exige maior vigilância para garantir 
a uniformidade das condições durante a operação)
•Realizada de preferência à sombra (radiação solar pode 
alterar a constituição química do material)
•Local: deve ser convenientemente seco e protegido contra o 
ataque de insetos ou contaminantes ambientais e costuma-
se dispor o material sobre papel para absorção da umidade
Métodos para secagem - continuação
•Secagem por ar quente
•Em estufas com termostato
•Deixar escapar o ar da estufa
•Quando disponível, procurar utilizar estufa com circulação 
forçada de ar
Métodos para secagem - continuação
COMINUIÇÃO (OU MOAGEM)
• Reduzir o material a fragmentos menores para 
torná-lo mais adequada para a próxima etapa, a 
extração
Objetivo
•Seccionamento
•Impacto
•Rasuração
Divisão 
grosseira
•MoinhosPulverização
•Textura do material
•Estabilidade dos constituintes
•Escala industrial? Considerar dimensões de entrada e saída 
do equipamento
Qual método 
escolher?
• “... retirada, de forma mais seletiva e 
completa possível, das substâncias ou fração 
ativa contida na droga vegetal, utilizando um 
líquido ou mistura de líquidos tecnologicamente 
apropriados e toxicologicamente seguros.”
• Sonaglio et al, (2001)
Processo Extrativo
EXTRAÇÃO
Você que já coletou, conservou, preparou, é a hora da.... 
E ENTÃO VAMOS OBTER UM EXTRATO... 
MAS O QUÊ É UM EXTRATO?
“É a preparação de consistência líquida, sólida 
ou intermediária, obtida a partir de material 
animal ou vegetal. 
O material utilizado na preparação de extratos 
pode sofrer tratamento preliminar, tais como, 
inativação de enzimas, moagem ou 
desengorduramento. 
Abreviatura: ext.”
FB V (2010)
Grau de divisão da droga vegetal
Meio extrator
• Polaridade
Agitação
Temperatura
Tempo
• Dependente dos anteriores
Fatores de influência em qualquer método 
de extração
CONSIDERANDO O SLIDE ANTERIOR, QUANDO VAMOS
NOS PERGUNTAR “COMO” EXTRAIREMOS, PODEMOS
COMEÇAR A NOS GUIAR USANDO
Que tipo de molécula 
extrairemos?
• Polar ou apolar?
• Ácida ou básica?
• Termolábil?
Do quê extrairemos?
• Material vegetal ou 
forma farmacêutica?
• Se material vegetal: 
seco ou fresco? 
• Se material vegetal, 
como é 
histologicamente?
• Inteiro, rasurado ou 
moído? Se moído, 
qual granulometria?
Para qual finalidade?
• Obter extrato bruto
• Purificar extrato 
bruto
• Obter frações a 
partir do extrato 
bruto
• Obter frações já a 
partir do material 
vegetal
• Para forma 
farmacêutica
 Um clássico: série de 
eluentes com ponto de 
ebulição baixo, em 
ordem crescente de 
polaridade (“série 
eluotrópica”)
Ordenação dos 
solventes
Hexano
Éter de petróleo
Ciclohexano
Tolueno
Diclorometano
Clorofórmio
Éter etílico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
Etanol
Metanol
Ácido acético
Lipofílico
(apolar)
Hidrofílico
(polar)
CONSIDERAÇÕES GERAIS PARA A PRODUÇÃO DE
EXTRATOS PARA USO FARMACÊUTICO
Seletividade do meio extrator
Segurança/toxicidade
Facilidade de manipulação
Risco ambiental
Custo
Economia
Principais limitações
• Propriedades extrativas
• Adequação tecnológica
• Inocuidade fisiológica
Frequentemente usados 
(seguros)
• Água
• Etanol
• Glicerina
• Propilenoglicol
• Misturas (glicóis)Mais usados (pesquisa 
fitoquímica)
•Geralmente solventes orgânicos
• Menos seguros
MAS... E QUANDO NÃO SE CONHECEM OS
METABÓLITOS A SER EXTRAÍDOS?
• Pode-se usar várias abordagens. Uma delas é a 
triagem (screening) fitoquímica
• Nesse caso, costuma-se submeter o material vegetal a 
sucessivas extrações, com solventes de polaridade 
crescente (menos polar para mais polar)
– Consegue-se, assim, uma extração fracionada, em que as 
diferentes frações contêm compostos de polaridade também 
crescente
 Como a composição química das plantas é complexa, costuma 
ocorrer a extração concomitante de vários tipos de substâncias, 
farmacologicamente ativas ou não, desejadas ou não
E é por isso que, antes de estudar algum 
produto natural, você deve primeiramente 
definir o quê pretende extrair.
Essa definição é que determinará o(s) solvente(s) e o 
método de extração que você usará. 
E também define, por consequência, como você 
conservará e preparará o material antes da extração
Métodos 
“verdes”
Menor impacto 
ambiental
• Solventes menos 
agressivos ao 
ambiente
• Micro-ondas
• Ultra-som
Processos de 
extração a frio
Maceração
• Remaceração
• Digestão
• Maceração 
dinâmica
Percolação
•Simples
•fracionada
Turbolização
Processos de 
extração a quente 
em sistemas 
fechados
Extração sob 
refluxo
Em aparelho de 
Soxhlet
Arraste por 
vapor d’água
Processos de 
extração a quente 
em sistemas 
abertos
Infusão
Decocção
Métodos de extração 
Extração por fluido 
supercrítico
Prensagem
MÉTODOS BÁSICOS DE EXTRAÇÃO
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• Material vegetal rasurado ou moído imerso em 
solvente, em recipiente fechado por horas ou dias 
com agitação ocasional
• Não proporciona esgotamento, o que leva às suas 
variações para tentar aumentar o rendimento
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o • Para 
substâncias 
termossensíveis
ou em baixos 
teores
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•Extração e redução do 
tamanho das partículas 
simultaneamente
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• Com recuperação 
do solvente
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• Óleos essenciais
• Pequena escala-
aparelho de 
Clevenger
• Maior escala –
sistemas 
industriais
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Seccionamento
“Tampada”
Separação após 
resfriamento
D
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o
“Aberta”
Material mais rígido
Imersão do 
material vegetal, 
levado à ebulição 
junto com o solvente 
por determinado 
tempo
•Extração por fluido supercrítico
•Extração assistida por ultrassom
•Extração assistida por micro-ondas
•Prensagem
Outros métodos
REMOÇÃO DOS SOLVENTES
•Solventes voláteis
Rota-evaporação
•Congelamento
•Sublimação
•Dessorção
Liofilização - água
Outros métodos
Rota-evaporador
Liofilizador
TEMOS UMEXTRATO!!! E AGORA, O QUE
PODEMOS FAZER COM ELE?
A análise 
fitoquímica!
Conjunto de métodos analíticos 
empregados para conhecer o 
perfil fitoquímico do extrato 
que estamos analisando.
TABELA 1. PRINCIPAIS REAÇÕES QUÍMICAS DE CARACTERIZAÇÃO DE
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE ORIGEM VEGETAL
Classe de 
metabólito 
secundário
Reações químicas de caracterização
Alcaloides Reações de Dragendorff, de Mayer e de Bertrand
Antraquinonas Reação de Bornträger
Esteroides Reação de Liebermann-Burchard
Flavonoides Reação de Shinoda
Heterosídeos
cardioativos
Porção açúcar Reação de de Kellei-Kiliani
Porção aglicona Reação de Liebermann-Burchard
Anel lactônico Reação de Kedde ou de Baljet
Saponinas Ensaios de formação de espuma ou ação hemolítica
Taninos Solução de gelatina a 1%, reação com FeCl3 e reação de 
Stiasny
- Clássicas!
- Reações com 
formação de cor 
e/ou precipitado
- Desvantagem: 
Inespecíficas
Adaptação do roteiro clássico de 
Stas-Otto segundo Auterhoff e 
Kovar (1985) para amostras de 
100 a 300 mg
Partição em solventes –
método clássico da 
química orgânica que 
também pode ser usado 
na purificação ou 
obtenção de 
substâncias específicas
OUTROS MÉTODOS ANALÍTICOS
FREQUENTEMENTE (MAIS) UTILIZADOS EM
ANÁLISES FITOQUÍMICAS
Eletroforese capilar
Metabolômica
Histoquímicos
• Cromatografia em camada delgada (CCD)
• Cromatografia em Coluna (CC)
• Cromatografia gasosa (CG)
• Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Métodos cromatográficos (todos)
Adaptado de Sant'Anna-Santos, B.F. e cols. - Anatomia e histoquímica das estruturas secretoras do caule de Spondias 
dulcis Forst. F. (Anacardiaceae) - Rev. Árvore vol.30 no.3 Viçosa Maio/Junho 2006
Exemplo de histoquímica
Você sabia que 
todas estas técnicas 
cromatográficas 
também podem ser 
usadas na 
purificação, 
isolamento e 
identificação de 
produtos naturais?
Sabia. Menos para determinação da 
estrutura das moléculas. Nesse caso, 
são utilizados métodos 
espectroscópicos.
Estudou analítica, 
hein?
Cromatografia em coluna 
clássica
ESPECTRO DE UV
ESPECTROMETRIA NO INFRAVERMELHO
• Muito útil para compostos com carbonilas!
– 1650 – 1800 cm
Ácido hexanóico
Limoneno
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Exemplo de espectro de 1H
ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR - RMN
Exemplo de espectro de 13C
ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR - RMN