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Resumão das técnicas Southern Blot, Northern Blot, Western Blot, FISH, RFLP, Microarranjo - Tecnologia Genética - Biologia Molecular

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Carolina Martins Temporal
Atividade 2 - Resumo sobre Seminários
TECNOLOGIA GENÉTICA
Southern Bolt
A técnica de Southern Blot, também conhecida como Southern Blotting foi desenvolvida para identificar sequências específicas de DNA. O termo “blotting” faz referência à transferência de amostras biológicas de um gel para uma membrana e sua subsequente detecção.
 
A metodologia consiste na fragmentação do DNA em pedaços menores através de eletroforese, seguido da transferência para uma membrana e a detecção do fragmento de DNA de interesse por hibridação com uma sonda específica.
Etapas:
1. Fragmentação do DNA: A primeira etapa consiste na fragmentação ou digestão do DNA, onde as longas sequências de nucleotídeos devem ser divididas em fragmentos menores através de enzimas de restrição. 
2. Eletroforese em gel de agarose: O DNA fragmentado é submetido a eletroforese em gel de agarose para separar os fragmentos de acordo com peso molecular à medida que passam por uma corrente elétrica.
3. Desnaturação: O gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda.
4. Transferência do DNA para uma membrana: Uma membrana de nitrocelulose (ou de nylon) é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel, fazendo com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere. A membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose) ou exposta a radiação ultravioleta (no caso do nylon) para permanentemente ligar o DNA à membrana.
5. Tratamento com a sonda: A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora (molécula de DNA isolada cuja sequência é conhecida e complementar à sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra). A sonda irá parear com qualquer sequência de DNA complementar. O excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não hibridizada (não pareada) será removida. Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está presente) é revelada por uma autoradiografia em um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.
6. Revelação: As manchas no Southern Blot mostram onde a sonda se hibridizou com a amostra. Conhecendo os pontos onde a amostra de DNA foi clivada, é possível dizer em quais trechos a sequência procurada está ou não presente.
Aplicabilidade:
A técnica de Southern Blot pode ser utilizada para detectar a identidade, o tamanho e a abrangência do DNA em uma amostra. Testes de paternidade, identificação criminal, identificação de vítimas. Isolar e identificar um gene de interesse, identificar mutação ou rearranjo gênico na sequência do DNA, diagnóstico de doenças causadas por defeitos genéticos, identificação de agentes infecciosos, e etc.
Vantagens:
· Permite o reconhecimento de genes em longas moléculas de DNA.
· É uma técnica mais barata que o sequenciamento do DNA.
· Utilização para detecção de mutações genômicas.
· Pode ser usado para quantificar o DNA.
RFLP 
O RFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição) é uma técnica da biologia molecular que analisa pedaços de DNA que foram cortados por enzimas de restrição (esses pedaços são os chamados de fragmentos de restrição). Foi o primeiro marcador genético baseado em DNA desenvolvido. O polimorfismo deste marcador é baseado nos diferentes tamanhos de fragmentos gerados por enzimas de restrição. 
As endonucleases (enzimas de restrição) são enzima originada de procariotos, que possuem a capacidade de clivar a molécula de DNA em pontos específicos, reconhecendo determinadas sequências de nucleotídeos. Na técnica de RFLP utilizamos a endonuclease tipo II. Ela localiza sequência palindrômica e realiza um recorte coesivo.
Etapas:
1. Extração do DNA: O DNA é extraído do sangue, saliva ou de outras amostras biológicas.
2. Adição das enzimas de restrição: O DNA contendo o gene de interesse é clivado em fragmentos por enzima de restrição. A endonuclease (enzima de restrição) irá reconhecer sítios específicos do DNA e cortá-los em fragmentos. 
3. Eletroforese: Esses fragmentos de DNA são analisados usando a eletroforese em gel de agarose.
4. Desnaturação: O DNA é desnaturado através a uma solução alcalina.
5. Transferência dos fragmentos para uma membrana de nitrocelulose: Os fragmentos de DNA são transferidos do gel para uma membrana de nitrocelulose por capilaridade. 
6. Hibidização: O filtro é então retirado e o DNA é hibridizado com uma sonda radioativa.
7. Revelação: A exposição da membrana a filme de raio-x após a hibridização com sondas marcadas leva à sensibilização do filme no ponto em que a sonda hibridiza com fragmento homólogo, formando uma banda na autoradiografia. Possibilitando a visualização dos polimorfismos em um filme de raio-x.
Aplicabilidade: Mapeamento do genoma, determinação de doenças genéticas, testes de paternidade, ciência forense.
Vantagens: 
· Pode ser aplicado para identificação em diversas áreas de atuação.
· Resultados estáveis e reprodutíveis. 
· Ampla cobertura do genoma.
· Possibilidade de utilização de sondas heterólogas. 
Desvantagens:
· Técnica de alto custo, demorada e obsoleta quando comparada com outras técnicas atuais. 
· Uso de sondas radioativas (tóxicas). 
· Não permite automatização em suas etapas.
· Necessita de grandes quantidades de DNA (5-20 microgramas).
 
Northern Blot 
Northern blot é uma técnica de biologia molecular em que é possível detectar e quantificar o RNAm e assim entender melhor sobre a expressão gênica.
Fazendo um trocadilho com o nome de Edwin Southern, a técnica foi batizada de Northern blot devido à similaridade de seu procedimento com o Southern blot. Com a diferença de que, em vez de DNA, a substância analisada por eletroforese com uma sonda hibridizadora no Northern blot é o RNA. 
Etapas:
· Corrida de RNA totais ou RNA mensageiros em gel de agarose: O RNA extraído, seja o total ou o RNAm + poli-A selecionado, são separados de acordo com o seu tamanho molecular por eletroforese em gel de agarose. Em razão dos grupamentos fosfatos, o DNA quando em meio neutro ou básico possui carga negativa. Para o DNA adquirir essa carga, adiciona-se uma solução alcalina junto do gel de agarose, e em seguida, ocorre a indução de um campo elétrico com dois pólos: um negativo e um positivo. A macromolécula migrará para o polo positivo (ânodo). A velocidade de migração e o poder de resolução do gel dependem do tamanho e forma da molécula. As maiores migram lentamente, enquanto as menores migram rapidamente.
· RNA são desnaturados pelo formaldeído: Utilização de agentes desnaturantes no gel, como o formaldeído, que reage covalentemente com os grupos amina de adenina, guanina e citosina, fazendo com que não ocorra o pareamento entre as bases. 
· Transferência para membrana por ação capilar: As membranas de nylon são são carregadas positivamente, aumentando a capacidade de ligação aos ácidos nucleicos e da sua maior robustez no manuseamento. A transferência ocorre por ação capilar (sem o uso de nenhum equipamento especial). Pelo arrasto que as macromoléculas fazem ao serem atraídas para o polo positivo, cria-se o borrão do blotting e assim, fornece uma reflexão precisa na membrana com os RNAs separados no gel de agarose. Entretanto, como o gel é muito frágil para ser sondado diretamente e as sondas de hibridização não penetram diretamente nos géis, é necessário imobilizar o RNA. Ele é então imobilizado na membrana, seja assando no forno a temperaturas elevadas (95°C por minuto) ou por exposição UV leve. Essa imobilização irá resultar na ligação covalente do RNA para a membrana, a qual impedirá que o ácido nucléico seja lavado durante o processamento.
· Sondas de DNA ou RNA para hibridar: A sonda de hibridização deve ser preparada. A hibridização de

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