Citoesqueleto: Funções e Composição

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Citoesqueleto – Disparador 7
1- Citoesqueleto: definição, funções e composição.
DEFINIÇÃO 
· O citoesqueleto é uma complexa rede de proteínas que determina a forma da célula, se estende por todo o citoplasma, auxiliando na sustentação do grande volume citoplasmático das células. Está presente nas células eucariontes e nas células procariontes.
FUNÇÕES
· Ele é fundamental para a a divisão celular; o transporte intracelular de vesículas; o movimento flagelar ou ciliar; mobilidade celular, e a fagocitose. Sendo importante, ainda, para a determinação do formato celular e por conferir proteção contra estresses mecânicos. 
COMPOSIÇÃO:
É composto por proteínas filamentosas que formam 3 classes principais:
Todos os filamentos do citoesqueleto são formados através da polimerização (processo químico que resulta na formação de macromoléculas (moléculas grandes) denominadas de polímeros, mediante a combinação de moléculas menores) de proteínas. Todos podem polimerizar-se e despolimerizar-se rapidamente; entretanto, os filamentos intermediários podem suportar níveis de tensão e deformação que causariam a ruptura de microfilamentos e microtúbulos.
· MICROTÚBULOS: São estruturas bastante dinâmicas, com uma polaridade definida, capaz de crescer e diminuir, é o o mais espesso de todos os filamentos que compõem o citoesqueleto
· Partem sempre de uma região definida do citoplasma: o centrossomo ou centro organizador de microtúbulos
· São formados a partir da tubolina, - é um dímero (composta por duas unidades similares) seus dois componentes são α-tubulina e β-tubulina. Estes polimerizam para formar os microtúbulos, que consistem em treze protofilamentos organizados em paralelo na forma de um tubo oco. O cilindro oco é composto por treze cadeias desse dímero.
· O microtúbulo não é uma estrutura estática, os filamentos podem mudar de tamanho rapidamente, estas proteínas, denominadas tubulinas α e β, formam os heterodímero responsáveis pelo elongamento do filamento.
· Os microtúbulos, da mesma forma que a actina F, também apresentam uma estrutura polarizada, onde a adição das subunidades de tubulina ocorre na extremidade mais (+), e a dissociação destas subunidades, na extremidade menos (-). A adição do heterotrímero ao polímero é mediada pela ligação das subunidades de tubulina com o trifosfato de guanosina (GTP). Após a incorporação do heterotrímero no filamento, o GTP é hidrolisado em difosfato de guanosina (GDP), o que afeta a estabilidade do heterodímero no filamento e permite uma eventual separação do mesmo. Este processo é conhecido como instabilidade dinâmica e é fundamental para todos os processos biológicos regulados pelos microtúbulos
· Além da tubolina (85%), os microtúbulos são compostos por proteínas associadas – MAPS (tipo proteínas motoras).
· Função: constituem a formação dos centríolos, cílios e flagelos, raios astrais em células em divisão celular, transporte de fluxo axônico rápido, construção do fuso mitótico (as fbras do fusao são constituidas por microtubulos. A separação das cromatídes se da pela polimerização desses microtúbulos. 
· Na interfase: Ocorre a organização dos microtúbulos de modo organizado, as extremidades (+) apontam para a MP – periferia da célula, e as extremidades (-) partem de uma região que as estabiliza.
MICROFILAMENTOS OU FILAMENTOS DE ACTINA: são conhecidos por microfilamentos por apresentarem o menor diâmetro entre os componentes do citoesqueleto. É encontrada sob a forma de feixes de filamentos paralelos ou de redes de filamentos anastomosados (padrões alinhados que se dividem, se bifurcam de forma aleatória).
· Os microfilamentos são formados pela polimerização da proteína globular actina G. A associação dos monômeros de actina G formam dois protofilamentos polarizados dispostos de maneira paralela em uma dupla hélice e unidos por interações laterais não-covalentes, formando a actina F. Os filamentos de actina F crescem por adição de monómeros a uma das extremidades. 
· A adição das subunidades monoméricas de actina G ocorre na extremidade mais (+), e a despolimerização, na extremidade menos (-). A polimerização da actina G nos filamentos depende de sua ligação com a molécula de ATP, ao passo que o desligamento das subunidades de actina G depende da hidrólise do ATP, formando ADP e fosfato inorgânico.
· Os microfilamentos são nucleados na região adjacente à membrana plasmática.
· Área mais rica em filamentos de actina = córtex (zona estreita abaixo da membrana plasmática
· Os microfilamentos podem interagir com outras estruturas e adquirir diferentes propriedades através de várias moléculas genericamente denominadas de proteínas de ligação à actina (actin binding proteins) e promover: 
· Interferir com a dinâmica de polimerização e despolimerização;
· Promover ligações entre diferentes microfilamentos, influenciando a sua estabilidade estrutural (fimbrina, fodrina, filamina e actina a);
· Mediar a interação dos microfilamentos com membranas celulares - integrinas e caderinas;
· Funcionar como motores, família das miosinas.
· Há proteínas associadas que participam na regulação da dinâmica de polimerização dos microfilamentos, e estas atuam por vários mecanismos:
· Por sequestração dos monómeros de actina G, limitando a sua polimerização (ex. profilina);
· Por ligação a uma das extremidades dos filamentos de actina F, impedindo o seu crescimento ou dissociação (ex. capping proteins, gelsolina, vilina, actinina a);
· Por associação lateral a segmentos dos filamentos, impedindo a sua fragmentação (ex. tropomiosinas).
· Funções: Localização (suporte mecânico) de estruturas celulares, movimentação intracitoplasmática de organelos ou vesículas, fagocitose, citocinese – anel contráctil (A citocinese ocorre com a formação do anel contráctil de actina e miosina) e na contração muscular.
FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS: Os filamentos intermediários estão situados entre os filamentos de actina e os microtúbulos. Formam uma rede perinuclear que se estende até à membrana plasmática
· As proteínas que formam os filamentos intermediários não apresentam sítios de ligação a nucleotídeos, como as proteínas relacionadas aos microfilamentos ou aos microtúbulos
· São apolares: não possuem extremidades (+) e (-), a formação do polímero ocorre a partir de uma associação antiparalela retorcida do tipo cabeça-cauda, onde o domínio amino-terminal de uma cadeia polipeptídica encontra-se justaposto ao domínio caboxi-terminal da outra cadeia.
· Em geral, são mais estáveis que os outros tipos de filamentos
· Frequentemente modificados por fosforilação
· Tipos de proteínas constituintes dos filamentos intermédios:
· Citoqueratinas ácidas - Células epiteliais
· Citoqueratinas básicas-neutras - Células epiteliais
· Vimentina,- Fibroblastos e glóbulos brancos
· Desmina, - Células musculares
· Proteína ácida fibrilar glial - Células da glia
· Periferina - Neurônios periféricos
· As lâminas nucleares - Expressão ubíqua
· Funções: Estabilidade mecânica das células e tecidos no seu ambiente natural de organização multicelular tridimensional, estabilidade estrutural, ancoragem e posicionamento do núcleo (lâminas nucleares), associação entre filamentos intermédios e desmossomas contribui para a arquitectura e estabilidade estrutural das células e tecidos.
3. Qual a participação do citoesqueleto na mitose?
Os microtúbulos são componentes que fazem parte do citoesqueleto. Este por sua vez da a formação do fuso mitótico, formado por feixes de microtúbulos que se irradiam a partir de dois focos principais: os centros celulares (ou centrossomos), localizados em pólos opostos da célula, e os ásteres (nem sempre presentes), formados por microtúbulos curtos que se irradiam a partir dos centros celulares. O aparelho mitótico ou, mais especificamente, o fuso mitótico nada mais é que um rearranjo, durante a mitose, do sistema de microtúbulos que se espalha por todo o citoplasma da célula interfásica (que não está em divisão), que exerce suas funções esqueléticas e de movimento de organelas, comovimos acima. Através de um mecanismo que envolve o encurtamento dos microtúbulos ligados aos cromossomos e a atuação de proteínas motoras, o fuso mitótico responde pela tração dos cromossomos durante a divisão celular, principalmente ao longo da anáfase mitótica, onde os cromossomos são deslocados para polos opostos, na formação das duas células-filhas, processo que será detalhado em outra parte do curso.
4. Qual a mecanismo de ação das drogas (Taxol, Vincristina, Vimblastina e Colchicina) na formação dos microtúbulos?
As drogas que interferem na estrutura dos microtúbulos e impedem a sua função são divididas em dois grupos: “estabilizantes” ( taxanos ) e “desestabilizantes” ( vincas – câncer malignos ). Um outro local de ligação da droga à tubulina é o sítio de ligação a colchicina, que mesmo não sendo semelhante às vincas, a nível de estrutura molecular, possui também um fenótipo “desestabilizador”.
Os inibidores mitóticos são compostos derivados de produtos naturais, como plantas. Eles agem impedindo as células de se dividirem para formar novas células, mas podem danificar as células em todas as fases do ciclo, ao impedirem que as enzimas produzam as proteínas necessárias para a reprodução celular.
Taxol: O paclitaxel (Taxol® ) é um alcaloide diterpénico isolado da casca do Taxus brevifolia que apresenta uma potente ação antineoplásica, resultante do seu efeito anti-mitótico. Este fármaco, a par com alguns dos seus derivados (nomeadamente o docetaxel), é atualmente um citostático de eleição no tratamento de vários tumores, tais como o cancro do ovário, da mama, do pulmão de não-pequenas células, da cabeça e pescoço e sarcoma de Kaposi’s.
· Assim, o paclitaxel não interage diretamente com os componentes nucleares (DNA e RNA), nem interfere com a sua síntese, atuando ao nível dos microtúbulos, na fase mitótica do ciclo celular.
· Uma característica essencial dos microtúbulos é o fato de possuírem uma elevada ‘instabilidade dinâmica’- tem a capacidade de encurtar e alongar de forma alternada, através da adição ou perda de heterodímeros de tubulina α /β nas suas extremidades. 
· A instabilidade dinâmica é mediada pela troca guanosina trifosfato (GTP)/ guanosina difosfato (GDP), portanto a subunidade α da tubulina liga-se de forma irreversível ao GTP, alcançando a configuração adequada para a polimerização do microtúbulo, enquanto a subunidade β da tubulina estabelece uma ligação reversível, com o GTP ou GDP, conduzindo respetivamente a polimerização ou despolimerização do microtúbulo.
· As duas extremidades de cada microtúbulo têm características dinâmicas muito diferentes. A extremidade (+) apresenta maior dinamismo que a extremidade (-). Devido a estas diferenças, os microtúbulos do fuso mitótico estão constantemente a polimerizar nas extremidades (+) e a despolimerizar nas extremidades (-). A regulação dinâmica dos microtúbulos efetuada pelas células envolve várias proteínas celulares endógenas e é um requisito fundamental para que ocorram as várias atividades celulares. A dinâmica dos microtúbulos encontra-se mais elevada na fase mitótica e é nesta fase que a tensão e a formação do cinétocoro são substanciais para uma correta fixação, separação e segregação dos cromatídeos com atividade antineoplásica – paclitaxel e seus derivados. 
· A capacidade dinâmica dos microtúbulos depende entre outros, dos diferentes isótipos de α e β tubulina e da interação com proteínas que interagem com os microtúbulos, as MAP’s (proteínas associadas a microtúbulos, do inglês, Microtubule Associated Proteins). Existem MAP’s com capacidade de estabilizar os microtúbulos (caso da MAP4 e da Tau), e MAP´s com ação desestabilizadora dos microtúbulos (caso das proteínas da família da estatmina). 
· Os taxanos e outros MSA’s, possuem a capacidade de se ligarem à subunidade β da tubulina no lúmen dos microtúbulos polimerizados, provocando a supressão dinâmica microtubular e a estabilização dos mesmos. Dessa forma, a mitose acaba por ser interrompida, por acumulação das células na fase G2/M do ciclo celular, o que, por sua vez, impede a divisão celular e a consequente proliferação das células neoplásicas. O efeito dos MSA´s sobre os microtúbulos, não só afeta a progressão do ciclo celular, como também provoca alterações nas vias de sinalização, como a apoptose. 
· Embora estejam entre os agentes quimioterápicos mais eficazes, os taxanos são suscetíveis a vários mecanismos de resistência, incluindo a redução da afinidade por mutações na estrutura da β-tubulina, a expressão aumentada de subtipos dos monômeros de β-tubulina para os quais a afinidade desses compostos é menor e a sua expulsão da célula pela glicoproteína-P
RESUMO: fármaco obtido por meio de processo de fermentação biossintética natural, ou seja, fermentação de células vegetais. O paclitaxel promove a agregação dos microtúbulos a partir dos dímeros de tubulina. Ele estabiliza os microtúbulos prevenindo a despolimerização, resultando na inibição da dinâmica normal de reorganização da rede de microtúbulos essencial para as funções celulares. O paclitaxel também induz a formação anormal ou feixe de microtúbulos durante o ciclo celular e múltiplos ásteres de microtúbulos durante a mitose. Atua, provavelmente, como agente específico de fase do ciclo celular (fases G-2 e M).
Vincristina e Vinblastina: Usado mais para tratamento de tumores malignos
· Os alcalóides da vinca, vincristina e vimblastina (Figura 1.3), diferentemente dos taxanos, atuam como inibidores da polimerização da tubulina (ou como desestabilizadores de microtúbulos). Esses produtos naturais também interagem com a β-tubulina, mas em uma cavidade distinta do sítio de interação dos taxanos, localizada na interface entre dois diferentes αβ-heterodímeros no protofilamento. Na presença desses compostos, o fuso mitótico não se forma e não há divisão celular, desencadeando o processo de morte celular. Os alcalóides da vinca também são sensíveis à ação da glicoproteína-P e possuem baixo índice terapêutico, razão pela qual é importante a pesquisa de novos fármacos na terapia do câncer, capazes de inibir a polimerização dos microtúbulos.
Colchicina: Remédio natural usado para gota
· A colchicina se liga à tubulina, uma proteína microtubular, causando despolimerização. Isso desorganiza as funções celulares, como a mobilidade dos granulócitos, reduzindo, assim, sua migração para a área afetada. Além disso, a colchicina bloqueia a divisão celular ligando-se aos fusos mitóticos. A colchicina também inibe a síntese e a liberação de leucotrienos
· Apesar de sua importância histórica e de apresentar significativa propriedade citostática, a colchicina e a podofilotoxina não estão incluídas entre os fármacos comercialmente disponíveis em razão da sua elevada neurotoxicidade.
6. Como ocorre a obtenção do cariótipo e qual o papel da colchicina nesse processo? (cariotipagem)
Cariótipo é o nome dado ao conjunto de cromossomos de uma dada espécie e apresenta forma, tamanho e número característicos. A morfologia desses cromossomos é constante para a espécie, entretanto o número pode variar em casos de alterações cromossômicas.
→ Preparando o cariótipo
Ao preparar o cariótipo, os cromossomos condensados são arranjados em pares. Essa organização permite avaliar todos essas estruturas de uma determinada espécie. Em humanos, existem 46 cromossomos, que são organizados em 23 pares. Os cromossomos que constituem um par possuem mesmo tamanho e mesma posição de centrômeros.
Para preparar o cariótipo, é necessário utilizar células somáticas, uma vez que elas são diploides. Em seguida, é feito um tratamento para estimular a mitose e, então, essas células são cultivadas. Posteriormente, a divisão celular é interrompida na metáfase, fase em que se observa a maior condensação dos cromossomos.
As células são coradas e analisadas com auxílio de um microscópio com câmera acoplada. Por meio de fotografia, a imagem dos cromossomos é arranjada de modo a organizar cada par cromossômico. Temos assim o cariótipo.
→ Fórmula cromossômicaA fórmula cromossômica é uma forma de descrever o cariótipo de um organismo. O cariótipo normal da espécie humana pode ser descrito como 46, XX ou 46, XY, em que o primeiro número de cromossomos é representado seguido de vírgula e da indicação dos cromossomos sexuais. Dessa forma, 46, XX corresponde ao cariótipo de uma mulher; e 46, XY representa o cariótipo de um homem.
As alterações cromossômicas numéricas devem ser indicadas após os cromossomos sexuais, seguidos de um sinal (+ ou -) e do cromossomo afetado. No caso da síndrome de Down, como há o aumento do cromossomo 21, a fórmula é 47, XX, +21 ou 47, XY, +21. Observe que são representados 47 cromossomos em substituição ao número 46 da fórmula do cariótipo normal da espécie humana. No caso da monossomia 7, o cariótipo deve ser 45, XX, -7 ou 45, XY, -7. Quando as alterações cromossômicas afetam os cromossomos sexuais, também podemos identificá-las na escrita de suas fórmulas. Um exemplo é a síndrome de Turner que é representada por 45, X.
→ Importância da cariotipagem
A cariotipagem é importante, pois permite analisar os cariótipos de indivíduos e perceber algumas alterações genéticas, como as estruturais e numéricas. Um exemplo é a detecção da síndrome de Down, alteração genética que apresenta três cromossomos 21
O exame de cariótipo tem como objetivo a identificação e análise dos cromossomos e suas regiões. O teste é realizado a partir de uma cultura de células que possibilita a obtenção de metáfases (células em divisão) e posterior coloração dos cromossomos com bandamento. Através das bandas cromossômicas é possível a identificação de aberrações cromossômicas numéricas e/ou estruturais, equilibradas ou desequilibradas, totais ou parciais. O cariótipo é recomendado para casais que procuram aconselhamento genético. A colchicina é uma substância que inibe a polimerização das proteínas do fuso mitótico, parando a divisão celular na metáfase. Ela é usada principalmente para se fazer o cariótipo da célula que se quer estudar, pois na metáfase os cromossomas se encontram no maior grau de condensação, facilitando a observação ao microscópio.