Métodos cromatográficos

Prévia do material em texto

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOSMÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Profa. Lucia Regina R. Martins
� O que é Cromatografia??
� O que é Cromatografia??
A cromatografia é um método físico-químico de
separação dos componentes de uma mistura.separação dos componentes de uma mistura.
Está fundamentada na migração diferencial dos
componentes de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interações, entre duas fases imiscíveis:
a fase móvel (FM) e a fase estacionária (FE).
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) - “Técnica
usada para a separação dos componentes de uma amostra, os quais
se distribuem entre duas fases, uma estacionária e a outra móvel”.
Cromatografia: definição
FASE MÓVEL FASE MÓVEL � Líquida, gasosa, fluido supercrítico
FASEFASE ESTACIONÁRIAESTACIONÁRIA � Sólido ou líquido
Passagem da fase móvel � componentes distribuídos e retidos 
seletivamente pela fase estacionária seletivamente pela fase estacionária 
MIGRAÇÕES DIFERENCIAISMIGRAÇÕES DIFERENCIAIS
Separação de misturas por interação diferencial:
• maior interação com a FE = maior retenção
• menor interação com a FE = eluição mais rápida
CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA � Princípio básico
Separação de misturas por interação diferencial:
• maior interação com a FE = maior retenção
• menor interação com a FE = eluição mais rápida
CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA � Princípio básico
FASE MÓVELFASE MÓVEL
FASE ESTACIONÁRIAFASE ESTACIONÁRIA
�os componentes da mistura são separados em bandas.
� AFINIDADE ⇒⇒⇒⇒ SEPARAÇÃO (migração diferencial)
Por que a Cromatografia é importante?
� Permite: SEPARAR
IDENTIFICAR
� Permite: 
IDENTIFICAR
QUANTIFICAR
... diversas espécies químicas...
� associada a outras técnicas instrumentais de análise:� associada a outras técnicas instrumentais de análise:
Ex.: espectrofotometria, espectrometria de massas,...
PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
Separação de pigmentos; 
proposição do termo 
Primeira publicação 
em fase gasosa
Martin e Synge
1952 (Prêmio Nobel)
1897-1903
David T. Day
Separação de 
proposição do termo 
cromatografia
MikhaelTswett
1903-1906
1930
Kuhn e Lederer
Cromatografia 
Cromatografia em papel
Izmailov e Shraiber
1938
1941
Martin e Synge
Particição em 
1952 (Prêmio Nobel)
1958
Golay: colunas 
capilares em CG
Equipamentos CG 
comerciais
1955
Separação de 
HC do 
petróleo
Cromatografia 
em coluna:
Xantofilas de gema 
de ovo
Particição em 
cromatografia 
líquida; Princípios 
de fase gasosa
capilares em CG
Mikhael SemenovichTswett
nascido em Asti (Itália) a 14 de Maio de 1872, sendo a família 
PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
nascido em Asti (Itália) a 14 de Maio de 1872, sendo a família 
originária da Rússia.
É considerado o pai da
cromatografia moderna,
através dos vários trabalhos
experimentais que efetuou.experimentais que efetuou.
M. TSWEET (1906): Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorvente sólido (F.E.) e solvente (F.M.).
éter deéter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever] (Grego)
CLASSIFICAÇÃO DAS CLASSIFICAÇÃO DAS 
TÉCNICAS 
CROMATOGRÁFICAS
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Cromatografia
Critérios: suporte físico, estado físico das fases móveis e estacionárias
Planar Em Coluna
Cromatografia
Suporte
Gás LíquidoLíquido Fluido
Supercrítico*
Fase móvel
*Fluido Supercrítico: vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Líquido
PlanarTécnica
Fase móvel LíquidoFase móvel
(FM)
Fase estacionária
(FE)
Líquido Fase 
ligada
Fase 
ligada
Sólido
Tipo de 
Cromatografia
CP CCDCCD
CP = cromatografia em papel
CCD = cromatografia em camada delgada
Cromatografia em papel
Cromatografia em camada delgada
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Cromatografia
Critérios: suporte físico, estado físico das fases móveis e estacionárias
Planar Em Coluna
Cromatografia
Suporte
Gás LíquidoLíquido Fluido
Supercrítico*
Fase móvel
*Fluido Supercrítico: vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Gás Fluido Líquido
Técnica
FM
Em Coluna
CGL
Líquido
CGS
Sólido
CGFL
Fase
Ligada
Gás
CSS
Sólido
CSFL
Fase
Ligada
Fluido
Supercrítico
CLL
Líquido
CLS CE
Sólido FaseLigada
LíquidoFM
FE
TC
CLFL CTI CB
CLL = cromatografia líquido-líquido
CLS = cromatografia líquido-sólido
CE = cromatografia por exclusão
CLFL = cromatografia líquida com fase quimicamente ligada
CTI = cromatografia por troca iônica
CB = cromatografia por bioafinidade
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Cromatografia em coluna:
• de acordo com o diâmetro interno e objetivo da separação:
- preparativa (6-50 mm)- preparativa (6-50 mm)
- analítica (2-6 mm)
- microdiâmetro (1-2 mm)
- capilar (<1 mm)
• Pressão:
- clássica (sob pressão atmosférica, colunas de vidro)- clássica (sob pressão atmosférica, colunas de vidro)
- média pressão
- alta pressão
... há outros critérios
Cromatografia em coluna - CL
Coluna aberta CLAE - HPLC
Cromatografia em coluna - CG
- Colunas empacotadas ou “recheadas”: preenchida com partículas de 
suporte que contém a FE 
- Colunas tubulares abertas (típicas de CGAR): FE é colocada 
diretamente sobre a parede interior da coluna. 
Tipos básicos de colunas:
diretamente sobre a parede interior da coluna. 
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
� Critério: polaridade relativa das fases
- em gasosa: fase móvel é inerte (“gás de arraste”)
- em líquida: Fase Normal (FE > FM)- em líquida: Fase Normal (FE > FM)
Fase Reversa (FM > FE)
� Critério: mecanismo de separação
processos: - químicos (troca iônica, quiral, afinidade),
- físicos (sorção – adsorção ou - físicos (sorção – adsorção ou 
absorção/partição) ou
- mecânicos (exclusão por tamanho 
molecular)
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO
Mecanismos de separação
1. Processos físicos: forças de atrações dipolares, formação de 
ligação de H.
- adsorção: FE sólida com grupos ativos na superfície (ex.: sílica,- adsorção: FE sólida com grupos ativos na superfície (ex.: sílica,
alumina); ocorre na interface com FM; dessorção por volatilidade
(CG) ou solubilidade na FM (CL e CFS); é o processo mais
comum em CCD, CGS, CLS, CSS
CCD (camada delgada), CGS (gás-sólido), CLS (líquido-sólido), CSS (supercrítica com FE sólida)
Mecanismos de separação
- absorção (partição): FE líquida e espalhada na
superfície de um suporte sólido e inerte (ou paredes do
1. Processos físicos: 
superfície de um suporte sólido e inerte (ou paredes do
tubo cromatográfico); processo intrafacial; baseia-se na
solubilidade dos compostos da amostra na FE; o retorno à
FM depende da volatilidade (CG) ou solubilidade na FM;
ocorre na CP, CGL, CLL.
CP = cromatografia em papel; CGL = cromatografia gás-líquido
CLL = cromatografia líquido-líquido
Mecanismos de separação
Com fases estacionárias quimicamente ligadas:
�mistura de partição e adsorção
Mecanismos de separação
2. Processos químicos: 
- troca iônica: FE contém grupos funcionais ionizáveis- troca iônica: FE contém grupos funcionais ionizáveis
(trocadores de íons – catiônico ou aniônico), FM consiste em
solução iônica compatível (propriedades tamponantes) que
promove a eluição dos compostos da amostra por substituição
ou deslocamento.
Mecanismos de separação
2. Processos químicos: 
- afinidade (bioafinidade): FE contém grupos químicos com- afinidade (bioafinidade): FE contém grupos químicos com
especificidade biológica quimicamente ligados ao suporte (ex.:
antígenos, enzimas), retiram da FM somentes as substâncias
complementares da amostra; a eluição ocorre por modificação
de propriedades da fase móvel ou por deslocamento.
3. Processo mecânico: 
- exclusão por tamanho molecular: FE tem composição
inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade
Mecanismos de separação
inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade
uniformes; moléculas grandes são excluídas dos poros e eluem
com a FM intersticial,moléculas menores penetram facilmente
nos poros e eluem com velocidades variáveis.
Acompanhamento da separação cromatográficaAcompanhamento da separação cromatográfica
Exemplo de cromatografia em camada delgada: 
análise visual, luz UV, reveladores
�Visualização ou detecção de bandas: manchas na superfície
Acompanhamento da separação cromatográfica
Cromatografia em coluna: coleta de frações 
Cromatografia em coluna: coleta de frações 
Cromatografia em coluna: coleta de frações 
Cromatografia em coluna: uso de detectores
Cromatografia líquida em coluna: uso de detectores ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
� Separação em coluna
� A resposta do detector é 
traduzida em um gráfico, ou traduzida em um gráfico, ou 
CROMATOGRAMA, que 
relaciona o seu sinal com o 
tempo necessário para a eluição
de cada componente.
� Eluição típica em cromatografia líquida