Determinação de Proteínas

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Apresentação Michele
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
Os procedimentos mais comuns para determinação de proteína é através da determinação de um elemento ou um grupo pertencente à proteína, sendo feita a conversão por meio de um fator. Os elementos geralmente analisados são o carbono ou nitrogênio, e os grupos são aminoácidos e ligações peptídicas.
A determinação de proteínas totais segundo, pode ser feitas por diferentes métodos.
Método de Biureto: se baseia na reação do reativo de biureto (mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante). O cobre em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Este método está sujeito à interferências de substâncias que possam reagir com os íons cobre.
Reação do Biureto
· Em um tubo de ensaio coloca-se 3mL de solução de clara de ovo e 1mL de NaOH 1M, agita-se bem;
· Adiciona-se algumas gotas de solução de sulfato de cobre ao tubo de ensaio;
· Observa-se uma coloração roxa indicando o teste positivo.
Método de Lowry: se baseia em uma mistura contendo molibdato, tungstato, e ácido fosfórico (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre redução quando reage com proteínas na presença do catalizador cobre (II) produzindo um composto com absorção máxima em 750 nm. Esse método apresenta grande sensibilidade para proteína, no entanto, está sujeito a muitos interferentes e possui absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas.
Método de Bradford: está baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteína que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante, desloca o equilíbrio do corante para a forma aniônica, que é absorvido fortemente na faixa de 595 nm. Suas desvantagens são: a variação da absortividade específica para diferentes proteínas e fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante que varia de acordo com a procedência.
O método oficial para determinação de proteína é o método de Kjeldahl. Este se baseia na determinação do nitrogênio total da amostra, isto é, o proteico e o não proteico orgânico, no entanto na maioria dos alimentos o nitrogênio não proteico representa muito pouco do total.
Na determinação por Kjeldahl ocorre a decomposição da matéria orgânica por meio de digestão a 400ºC com ácido sulfúrico concentrado na presença de sulfato de cobre como catalizador acelerando a oxidação da matéria orgânica. O nitrogênio da solução ácida resultante é determinado por destilação por arraste de vapor seguido por titulação com ácido diluído.
DIGESTÃO
O carbono presente na matéria orgânica é oxidado e o dióxido de carbono se desprende. Durante o processo de digestão ocorre mudança de coloração da solução (Figura 11). O nitrogênio da solução é transformado em amônia a qual reage com ácido sulfúrico formando o sulfato de amônia.
As transformações ocorridas na fase de digestão:
DESTILAÇÃO
 Pode ser feita por aquecimento direto ou por arraste de vapor.  O sulfato de amônio é tratado com hidróxido de sódio em excesso liberando a amônia que é coletada em um frasco com ácido bórico formando o dihidrogênio borato de amônio, e à medida que se desprende ocorre mudança de coloração da solução.
A Equação 2, mostra a reação que demonstra as transformações ocorridas na fase de destilação.
(NH4)2SO4 + 2NaOH   ->       2NH4OH + Na2SO4
 NH4OH ->      NH3 + H2O
H3BO3 + NH3  ->    NH4H2BO3
TITULAÇÃO
 O dihidrogênio borato de amônio é titulado com uma solução padrão de ácido clorídrico de título conhecido até a viragem do indicador (Figura 13). (GALLÃO; DAMASCENO; BRITO, 2008).
A Equação 3, mostra a reação que demostra as transformações ocorridas na fase de titulação. (GALLÃO; DAMASCENO; BRITO, 2008).
NH4H2BO3 + HCl             H3BO3 + NH4Cl
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
O método para determinação de proteína por Kjeldahl pode ser aplicado a qualquer alimento. Esse método determina a matéria nitrogenada total da amostra. O método se baseia no deslocamento do nitrogênio presente na amostra, o transformando em sal amoniacal. A partir do sal obtido ocorre o deslocamento do amônio, que recebe sobre ele uma solução ácida de volume e título conhecido.
Para converter o nitrogênio medido em proteína foi utilizado o fator geral 6,25, obtido com base no fato que na maioria das proteínas o teor de nitrogênio é em torno de 16%, como demonstra a Equação 4, a seguir.
16g N                            100g proteínas
1g  N                             Xg
Xg = 100/16 =    6,25
PROPRIEDADES GERAIS:
· Quebra-se um ovo de galinha e separa-se a clara e a gema, se faz uma solução adicionando 50mL de água com a clara, e a gema foi descartada;
· Coloca-se 10mL da solução de clara em um béquer e goteja-se três gotas de uma solução grosseira de sulfato de cobre;
· Homogeneíza-se bem e adiciona-se 2,5mL de solução de hidróxido de sódio;
· Observa-se uma coloração roxa.
REAÇÕES ESPECÍFICAS:
Reação Xantoprotéica
· Em um tubo de ensaio coloca-se 3mL de solução de clara de ovo e 1mL de HNO3 concentrado, forma-se um precipitado branco;
· Aquece-se com muito cuidado por aproximadamente um minuto;
· Esfria-se o tubo em água corrente;
· Adiciona-se lentamente ao tubo uma solução de hidróxido de sódio 1M;
· Observa-se duas cores no tubo, amarelo e laranja.
Reação do Grupo Sulfídrila (SH)
· Em um tubo de ensaio coloca-se 2mL de solução de clara de ovo e 1mL de NaOH 1M, agita-se bem;
· Ferve-se por aproximadamente 2 minutos;
· Adicionara-se algumas gotas de solução de acetato de chumbo ao tubo de ensaio;
· Observa-se uma coloração escura no tubo.
Abaixo apresenta-se os procedimentos mencionados em um quadro comparativo, o qual resume técnicas básicas para identificação proteica.
	IDENTIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS
	 
PROCEDIMENTOS
 
	RESULTADOS
	
	Reação Xantoprotéica
- colocar HNO3 concentrado
- aquecer
- colocar NaOH(aq) lentamente
	Resultado positivo:
duas fases, amarelo e laranja
	
	Reação Do Biureto
- colocar NaOH
- agitar
- colocar CuSO4(aq), agitar
	Resultado positivo:
roxo ou lilás
	
	Reação do Grupo Sulfídrila
- colocar NaOH
- aquecer
- colocar acetato de chumbo
	Resultado positivo:
cor escura
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Para se estudar uma proteína detalhadamente deve-se separá-la de outras proteínas em sua forma pura. Proteínas devem ser purificadas para serem caracterizadas quanto as suas propriedades e atividades.
· É necessário uma fonte de proteínas (tecido ou células);
· Romper estas células, liberando suas proteínas em uma solução (extrato bruto);
· Centrifugar se necessário para preparar frações subcelulares
· Uma vez que o extrato pronto, diversos métodos estão disponíveis para a purificação. Exemplos: Diálise, Fracionamento (cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de afinidade e cromatografia líquida de alta eficiência – HPLC).
Método de Diálise
· É um processo que separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas;
· O extrato parcialmente purificado é colocado em um saco ou tubo feito de uma membrana semi-permeável;
· Ele é suspenso em um volume muito maior de solução tampão de força iônica apropriada, a membrana permite a troca de sal e tampão, mas não de proteínas;
Método de Fracionamento
· É utilizado diferenças na solubilidade protéica, onde a mesma é reduzida em elevadas concentrações salinas, um efeito denominado salting out de proteínas;
· As proteínas que então precipitam são removidas daquelas que permanecem em solução por centrifugação em baixa velocidade.
Cromatografia em coluna:
· Tem como base diferenças no tamanho, carga, afinidade de ligação e outras propriedades;
· Um material sólido poroso com propriedades químicas apropriadas é mantido em uma coluna, pela qual é percolada uma solução tampão;
· A solução contendo a proteína depositada no topo da coluna percola o material sólidoporoso dentro da solução tampão.
FOTO
Cromatografia de troca iônica:
· Explora as diferenças no sinal e na magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH;
· A matriz da coluna é polímero sintético (resina) contendo grupos carregados ligados (trocadores de cátions ou trocadoras de ânions);
· A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na coluna é afetada pelo pH e pela concentração de íons de sais livres;
· Enquanto a solução contendo proteínas permanece na coluna, frações deste efluente são coletadas em tubos teste (cada fração pode ser testada para a presença de proteína de interesse);
Cromatografia de afinidade:
· Tem como base a afinidade de ligação;
· Os grânulos da coluna possuem um grupo químico covalentemente ligado (ligante);
· Quando uma mistura de proteína é adicionada a coluna, qualquer proteína com afinidade por este ligante se liga aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada;
· As proteínas que não se ligam são lavadas na coluna, e a proteína ligada é eluida com a solução contendo uma concentração elevada de sal quanto do ligante livre;
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC):
· Utiliza bombas de alta pressão que aceleram o movimento das moléculas de proteína através da coluna;
· Ao reduzir o tempo de trânsito na coluna, a HPLC pode limitar o espalhamento difusional das bandas de proteína e assim aumentar significativamente a resolução
Caracterização por eletroforese:
· Baseado em migração de proteínas carregadas em um campo Elétrico;
· A eletroforese permite a determinação de propriedades críticas (ponto isoelétrico e massa molecular estimada);
· Para a eletroforese de proteínas é utilizado géis de poliacrilamida, retardando a migração de proteínas na proporção de sua relação carga-massa.
· Um método eletroforético utilizado faz o uso do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS)
· OSDS se liga a grande maioria das proteínas onde contribui com uma grande carga negativa e conferindo para cada proteína uma carga-massa semelhante;
· Na eletroforese o SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na massa molecular.
· As proteínas são visualizadas pela adição de corantes que liga-se as proteínas e não ao gel.
· Na maioria dos casos vários métodos precisam ser utilizados sequencialmente para purificar uma proteína por completo, pois cada método separa as proteínas com base em diferentes propriedades;
· Diversas estratégias podem ser tentadas até que seja encontrada a mais eficiente;
· Protocolos de purificação publicados estão disponíveis para muitos milhares de proteínas;
· Métodos de baixo custo devem ser utilizados primeiro (volume e número de contaminantes e maior);
· Métodos cromatográficos são impraticáveis nos estágios iniciais já que a quantidade de meio cromatográfico cresce com o tamanho da amostra;