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AULA7_Espermograma_Morfofisiologia e patologias espermáticas_Fertilização in vivo

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Métodos de colheita de semên
Métodos de colheita de sêmen
 Vagina artificial
*
Vagina artificial
Fêmea em Cio
Manequim
*
Colheitas por vagina artificial
*
Colheitas por vagina artificial
*
Colheitas por vagina artificial
*
Colheitas por vagina artificial
*
Eletroejaculador
*
Eletroejaculador
*
Massagem das ampolas (desuso)
*
Mão enluvada (masturbação)
*
Massagem abdominal
*
Preensão
Retirada do Espermatóforo;
Desencapsulação e inseminação no télico da fêmea.
*
Prof. Robespierre Araújo Silva
Fertilização in vivo
Fertilização ou Fecundação
 Processo pelo qual o gameta masculino, o espermatozoide, se une ao gameta feminino, o oócito, para formar uma célula diploide, o zigoto.
In vivo
In vitro
*
Ejaculação
Vagina
Útero
Cérvix
*
Transporte espermático no TRF
 Transporte rápido
 motilidade espermática e contratilidade uterina/mesossalpinge durante corte e coito; dura entre 2 e 10 minutos.
 Colonização dos reservatórios espermáticos
 criptas cervicais; glândulas endometriais; JUT.
 Liberação lenta e transporte
 liberação continuada de sptz para entrada no oviduto (barreiras*)
 motilidade espermática e contratilidade uterina/mesossalpinge
*
Transporte espermático no TRF
VAGINA
*
Cérvix
 Funções da cérvix
 receptiva à penetração espermática durante/próximo à ovulação e inibe migração espermática durante outras fases do ciclo;
 reservatório de espermatozoides;
 protege sptz do ambiente hostil da vagina e da fagocitose;
 supre necessidades energéticas dos sptz’s;
 filtra sptz’s defeituosos e imóveis;
 possível participação na capacitação espermática.
Ruminante
Equina
Suína
*
Migração cervical
*
Migração uterina
 Espermofagia
 infiltração de leucócitos no útero e fagocitose de sptz’s mortos e dos vivos excedentes
*
Migração tubárica
 movimentos peristálticos e antiperistálticos da m. tubárica
 contrações mucosa tubárica e da mesossalpinge
 correntes e contracorrentes de fluido por ação ciliar
*
Migração tubárica
 Junção uterotubárica → barreira de seleção
 ejaculação = bilhões de sptz’s
 istmo = 1 a 10.000 sptz’s
 ampola = 10 a 100 stpz’s (4-12 horas pós ejaculação)
 Istimo: quiescência espermática → modificações funcionais
*
Capacitação e hiperativação espermática
 Preparação para fertilização
 albumina, HDL, heparina, HCO3, Ca2+ (pH) 
 desestabilização da MP e acrossomal
 efluxo de colesterol e fosfolipídios
 início da motilidade hiperativada
 hiperpolarização da membrana
 fosforilação de proteínas do axonema
*
Capacitação e hiperativação espermática
*
Encontro espermatozoide-oócito
*
Fecundação e bloqueio à polispermia
Oócito
 Fase rápida
 potencial elétrico
 Fase lenta
 reação de zona
*
Desenvolvimento dos pronúcleos e Singamia
*
Obrigado!
“O que sabemos, uma gota.
O que ignoramos, um oceano”
Isaac Newton
*
Modelo questão prova
A função reprodutiva masculina é regulada por mecanismos de ordem neuroendócrina, através do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal (HHG). Acerca de tal regulação, fale sobre as relações endócrinas e funcionais do eixo HHG.
*
Espermograma
Espermograma
Última parte do exame andrológico
Análise do sêmen
*
Espermograma
*
Avaliação do sêmen
	Macroscópicas
	Volume, aspecto, cor e odor
	Microscópicas
	Turbilhonamento, motilidade, vigor, concentração e morfologia
*
Características Macroscópicas
Volume (mL)
Variações
Espécie;
Método de coleta;
Regime de serviço prévio à coleta;
Tempo de excitação.
*
Volume seminal para as diferentes espécies
Aspermia / Hipospermia / Normospermia / Hiperespermia
	Animal	CBRA
Volume médio (mL)	Miés Filho, 1987
Limites (mL)
	Touro	5,0	0,5 a 14,0
	Garanhão	60,0	40,0 a 320,0
	Bode	0,8	0,2 a 2,0
	Carneiro	1,0	0,5 a 3,0
	Varrão jovem (8 m)	190,0 a 225,0	125,0 a 500,0
	Varrão adulto (>12 m)	200,0 a 350,0
	Cão	10,0	2,0 a 40,0
*
Aspecto
*
Concentração (106/mL) vs. Aspecto
Zemjanis (1966)
	Touro	Aspecto
	≥ 1000	Cremoso
	500 a 1000	Leitoso
	200 a 500	Opalescente
	< 200	Aquoso
*
Concentração (106/mL) vs. Aspecto
Roberts (1971)
	Touro	Carneiro	Aspecto
	2500	Cremoso espesso
	2000	2000	Cremoso
	1000	1000	Cremoso fino
	100	100	Acinzentado
	< 50	< 50	Aquoso
*
Características Macroscópicas
	Cor
	Fisiológico
	Esbranquiçada/branca, marfim ou amarelada
	Não fisiológico
	Avermelhada, marrom, cinza escuro
*
Características Macroscópicas
Odor
Fisiológico
Sui generis
	fosfato de espermina
Não fisiológico
Urinífero, pútrido
*
Turbilhonamento
Variações
Método de coleta;
Condições de preservação e temperatura
*
Motilidade
Motilidade Total (MT) e Progressiva (MP
Variações
Circular, retrógrada e oscilatória
Necrospermia / Acinesia / Astenozoospermia 
*
Motilidade
Variações
Circular, retrógrada e oscilatória
*
Características Microscópicas
Total (MT) e Progressiva (MP)
0 a 100%; ≥ 70%
Concentração diluição
CASA
Variações
Circular, retrógrada e oscilatória
Vigor (0 a 5; ≥ 3)
*
Concentração espermática
Azoospermia / Normozoospermia / Oligozoospermia / Polizoospermia
*
Diluição
Formol salino ou formol citrato
	Animal	Diluição
	Touro	1:200
	Garanhão	1:10 a 1:100
	Bode/Carneiro	1:200 / 1:400
	Varrão	1:100 a 1:200
	Cão	1:100
*
Diferença ≤ 10%
*
Concentração espermática
	Animal	Sptz’s/ejac.	[106]/mL	Limites [106]/mL
	Touro	7 x 109	1400	300 a 2000
	Garanhão	9 x 109	150	30 a 800
	Bode	2 x 109	2500	1000 a 5000
	Carneiro	3 x 109	3000	2000 a 5000
	Varrão (8m)	35 a 45 x 109	180 a 200	25 a 300
	Varrão (> 12m)	30 a 60 x 109	200 a 400
	Cão	1,5 x 109	150	60 a 300
*
Anormalidades espermáticas alcançam 30% de herdabilidade tendo alta correlação com a taxa de fertilidade 			(EMBRAPA, 1993)
Morfologia espermática
*
Região anatômica
Cabeça (acrossoma), Cauda (peça intermediária/principal)
Origem 		(LARGELOF, 1934; BLOM, 1950)
Primária, Secundária e Terciária
Grau de importância para fertilidade 	(BLOM, 1973)
Maiores e Menores
Classificação dos defeitos espermáticos
	Durante muitos anos a classificação dos defeitos espermáticos deu-se de acordo com a região anatômica afetada – defeitos de cabeça, cauda, etc;
	Largelof (1934) classificou as anormalidades espermáticas de acordo com sua origem em: Primárias – defeitos que se originam no epitélio seminífero durante a espermatogênese; Secundárias – defeitos que se originam distalmente aos túbulos seminíferos, nas vias intra e extratesticulares durante o armazenamento e ejaculação; Terciárias – são aquelas originadas pela manipulação dos espermatozoides após a ejaculação.
	Blom (1973) associou a classificação ao grau de importância do defeito para fertilidade em defeitos maiores e menores, a depender da relevância para fertilidade;
*
Diferenças entre espécies
Garanhão
Caprino
Homem
Camundongo
Rato
	Durante muitos anos a classificação dos defeitos espermáticos deu-se de acordo com a região anatômica afetada – defeitos de cabeça, cauda, etc;
	Largelof (1934) classificou as anormalidades espermáticas de acordo com sua origem em: Primárias – defeitos que se originam no epitélio seminífero durante a espermatogênese; Secundárias – defeitos que se originam distalmente aos túbulos seminíferos, nas vias intra e extratesticulares durante o armazenamento e ejaculação; Terciárias – são aquelas originadas pela manipulação dos espermatozoides após a ejaculação.
	Blom (1973) associou a classificação ao grau de importância do defeito para fertilidade em defeitos maiores e menores, a depender da relevância para fertilidade;
*
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
	Durante muitos anos a classificação dos defeitos espermáticos deu-se de acordo com a região anatômica afetada – defeitos de cabeça, cauda, etc;
	Largelof (1934) classificou as anormalidades espermáticas de acordo com sua origem em:Primárias – defeitos que se originam no epitélio seminífero durante a espermatogênese; Secundárias – defeitos que se originam distalmente aos túbulos seminíferos, nas vias intra e extratesticulares durante o armazenamento e ejaculação; Terciárias – são aquelas originadas pela manipulação dos espermatozoides após a ejaculação.
	Blom (1973) associou a classificação ao grau de importância do defeito para fertilidade em defeitos maiores e menores, a depender da relevância para fertilidade;
*
Avaliação da morfologia espermática
*
Câmara úmida
Estiraços corados
Método de avaliação
	A preparação da câmara úmida é feita com a mesma suspensão celular preparada para avaliação da concentração espermática. Coloca-se 10 microlitros da amostra, devidamente homogeneizada, em uma lâmina, cobre-se com lamínula, remove o excesso de líquido (contato com papel, sem pressionar) e sela as laterais da lamínula com esmalte. A leitura é feita em microscopia de contraste de fase, com aumento de 100X em imersão;
	Os esfregaços corados são feitos com uma gota de sêmen puro, ou diluído. Coloca-se uma gota de sêmen numa lâmina e a estira, com auxílio de outra lâmina, deixando-a secar. A coloração pode ser feita posteriormente ou antes de estirar, fazendo-se, neste caso, uma homogeinização da amostra com o corante. O corante mais utilizado é a eosina-nigrosina, mas também podem ser utilizados outros corantes como o Vermelho-Congo, Azul de bromofenol e Blue Sperm.
	São contadas 200 células.
*
Total de alterações morfológicas aceitáveis
CBRA, 2013
	Animal	Defeitos Totais (% máx.)
	Touro (bov/bub)	30
	Garanhão	30
	Bode/Carneiro	20
	Cão	30
	Varrão	30
	Aves	10
*
Quanto à origem
Quanto à localização anatômica
Quanto à importância para fertilidade
Classificação das anormalidades espermáticas
	Durante muitos anos a classificação dos defeitos espermáticos deu-se de acordo com a região anatômica afetada – defeitos de cabeça, cauda, etc;
	Largelof (1934) classificou as anormalidades espermáticas de acordo com sua origem em: Primárias – defeitos que se originam no epitélio seminífero durante a espermatogênese; Secundárias – defeitos que se originam distalmente aos túbulos seminíferos, nas vias intra e extratesticulares durante o armazenamento e ejaculação; Terciárias – são aquelas originadas pela manipulação dos espermatozoides após a ejaculação.
	Blom (1973) associou a classificação ao grau de importância do defeito para fertilidade em defeitos maiores e menores, a depender da relevância para fertilidade;
*
Sptz’s anormais podem reduzir a fertilidade
Prejuízo à motilidade → local de fertilização
Defeitos sutis no formato da cabeça, cauda, gota
↑ nº sptz’s funcionalmente competentes
Incapacidade de fertilizar, manter o desenvolvimento embrionário inicial
Fortes alterações no formato da cabeça, defeitos na cromatina
Defeitos compensáveis¹ e não compensáveis²
(SAACKE et al., 2008)
	Durante muitos anos a classificação dos defeitos espermáticos deu-se de acordo com a região anatômica afetada – defeitos de cabeça, cauda, etc;
	Largelof (1934) classificou as anormalidades espermáticas de acordo com sua origem em: Primárias – defeitos que se originam no epitélio seminífero durante a espermatogênese; Secundárias – defeitos que se originam distalmente aos túbulos seminíferos, nas vias intra e extratesticulares durante o armazenamento e ejaculação; Terciárias – são aquelas originadas pela manipulação dos espermatozoides após a ejaculação.
	Blom (1973) associou a classificação ao grau de importância do defeito para fertilidade em defeitos maiores e menores, a depender da relevância para fertilidade;
*
Alterações do Acrossoma
Enrugado, contorno defeituoso ou destacado
Patologias espermáticas
Distúrbios no epidídimo, envelhecimento no epidídimo ou manipulação indevida no processamento (choque térmico).
	A preparação da câmara úmida é feita com a mesma suspensão celular preparada para avaliação da concentração espermática. Coloca-se 10 microlitros da amostra, devidamente homogeneizada, em uma lâmina, cobre-se com lamínula, remove o excesso de líquido (contato com papel, sem pressionar) e sela as laterais da lamínula com esmalte. A leitura é feita em microscopia de contraste de fase, com aumento de 100X em imersão;
	Os esfregaços corados são feitos com uma gota de sêmen puro, ou diluído. Coloca-se uma gota de sêmen numa lâmina e a estira, com auxílio de outra lâmina, deixando-a secar. A coloração pode ser feita posteriormente ou antes de estirar, fazendo-se, neste caso, uma homogeinização da amostra com o corante. O corante mais utilizado é a eosina-nigrosina, mas também podem ser utilizados outros corantes como o Vermelho-Congo, Azul de bromofenol e Blue Sperm.
	São contadas 200 células.
*
Alterações de Acrossoma
PURSEL et al., 1972
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
	Grânulo persistente, defeito hereditário que pode conduzir à esterilidade. É detectado como um ponto refringente na margem anterior da cabeça do espermatozoide. Esta anormalidade foi detectada em bovinos, ovinos, caprinos e suínos. O defeito ocorre durante a espermatogênese e consiste de uma projeção do tecido acrossômico, que se dobra, fazendo uma protusão.
*
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
Degeneração e Hipoplasia testicular
Alterações de Cabeça
	Alterações no formato da cabeça (piriforme, contorno anormal, estreito na base...) estão relacionados à infertilidade. Em elevado número, estão relacionadas à degeneração e hipoplasia testicuar. Podem apresentar boa motilidade e iAC e ainda ser capazes de fertilizar. Porém, em elevado número, tem baixa fertilidade (incapacidade de fertilizar ou desenvolvimento embrionário anormal).
*
Espermatozóide bovino com cabeça dupla
(eosina-nigrosina) 
Alterações de Cabeça
	A preparação da câmara úmida é feita com a mesma suspensão celular preparada para avaliação da concentração espermática. Coloca-se 10 microlitros da amostra, devidamente homogeneizada, em uma lâmina, cobre-se com lamínula, remove o excesso de líquido (contato com papel, sem pressionar) e sela as laterais da lamínula com esmalte. A leitura é feita em microscopia de contraste de fase, com aumento de 100X em imersão;
	Os esfregaços corados são feitos com uma gota de sêmen puro, ou diluído. Coloca-se uma gota de sêmen numa lâmina e a estira, com auxílio de outra lâmina, deixando-a secar. A coloração pode ser feita posteriormente ou antes de estirar, fazendo-se, neste caso, uma homogeinização da amostra com o corante. O corante mais utilizado é a eosina-nigrosina, mas também podem ser utilizados outros corantes como o Vermelho-Congo, Azul de bromofenol e Blue Sperm.
	São contadas 200 células.
*
Má-formação da cabeça (Bovino, Azul de Toluidina)
Alterações de Cabeça
	A preparação da câmara úmida é feita com a mesma suspensão celular preparada para avaliação da concentração espermática. Coloca-se 10 microlitros da amostra, devidamente homogeneizada, em uma lâmina, cobre-se com lamínula, remove o excesso de líquido (contato com papel, sem pressionar) e sela as laterais da lamínula com esmalte. A leitura é feita em microscopia de contraste de fase, com aumento de 100X em imersão;
	Os esfregaços corados são feitos com uma gota de sêmen puro, ou diluído. Coloca-se uma gota de sêmen numa lâmina e a estira, com auxílio de outra lâmina, deixando-a secar. A coloração pode ser feita posteriormente ou antes de estirar, fazendo-se, neste caso, uma homogeinização da amostra com o corante. O corante mais utilizado é a eosina-nigrosina, mas também podem ser utilizados outros corantes como o Vermelho-Congo, Azul de bromofenol e Blue Sperm.
	São contadas 200 células.
*
Cabeça estreita (Bovino, Eosina-Nigrosina) 
Alterações de Cabeça
Cabeça destacada (Bovino, Eosina-Nigrosina) 
Alterações do colo
Pouch, Diadema, Cratera
Bov / Sui / Coe / Eq / Hum
Doenças virais, produtos tóxicos, estresse, condições climáticas adversas; Dexametasona; Degeneração testicular
Alterações no Núcleo
	A preparação dacâmara úmida é feita com a mesma suspensão celular preparada para avaliação da concentração espermática. Coloca-se 10 microlitros da amostra, devidamente homogeneizada, em uma lâmina, cobre-se com lamínula, remove o excesso de líquido (contato com papel, sem pressionar) e sela as laterais da lamínula com esmalte. A leitura é feita em microscopia de contraste de fase, com aumento de 100X em imersão;
	Os esfregaços corados são feitos com uma gota de sêmen puro, ou diluído. Coloca-se uma gota de sêmen numa lâmina e a estira, com auxílio de outra lâmina, deixando-a secar. A coloração pode ser feita posteriormente ou antes de estirar, fazendo-se, neste caso, uma homogeinização da amostra com o corante. O corante mais utilizado é a eosina-nigrosina, mas também podem ser utilizados outros corantes como o Vermelho-Congo, Azul de bromofenol e Blue Sperm.
	São contadas 200 células.
*
Gota Citoplasmática Proximal
Deficiente maturação epididimária, imaturidade sexual; Degeneração e Hipoplasia testicular
Defeitos de Inserção
Fossa de implantação rasa, estreita e assimétrica 
Degeneração e Hipoplasia testicular
Alterações do colo
	GCP: Imaturidade sexual (transitória, desaparecem quando os animais atingem a maturidade sexual); Em casos de degeneração, ocorre pico de GCP no início e final da fase degenerativa; Em casos de hipoplasia testicular, ocorre de modo persistente, sem haver flutuações.
*
Gota Citoplasmática Proximal
(Bovino, Azul de Toluidina) 
Alterações do colo
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
Alterações do colo
Saca-rolhas (Cork Screw)
Degeneração testicular em reprodutores velhos (GCP)
Pseudogota; Stump; Ausência de bainha mitocondrial; PI dupla ou tripla
Degeneração e Hipoplasia testicular
Alterações de Peça intermediária
*
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
Alterações de Peça intermediária
	A preparação da câmara úmida é feita com a mesma suspensão celular preparada para avaliação da concentração espermática. Coloca-se 10 microlitros da amostra, devidamente homogeneizada, em uma lâmina, cobre-se com lamínula, remove o excesso de líquido (contato com papel, sem pressionar) e sela as laterais da lamínula com esmalte. A leitura é feita em microscopia de contraste de fase, com aumento de 100X em imersão;
	Os esfregaços corados são feitos com uma gota de sêmen puro, ou diluído. Coloca-se uma gota de sêmen numa lâmina e a estira, com auxílio de outra lâmina, deixando-a secar. A coloração pode ser feita posteriormente ou antes de estirar, fazendo-se, neste caso, uma homogeinização da amostra com o corante. O corante mais utilizado é a eosina-nigrosina, mas também podem ser utilizados outros corantes como o Vermelho-Congo, Azul de bromofenol e Blue Sperm.
	São contadas 200 células.
*
Dobrada, Enrolada, Enrolada na extremidade
Problemas no epidídimo ou manipulação do sêmen
Dag defeito: peça intermediária ou cauda fortemente enrolada ou dobrada com ruptura das fibras
Bloom: caráter hereditário
Alterações de Cauda
*
Alterações de Cauda
Gota Citoplasmática Distal (Bovino, Azul de Toluidina) 
Alterações de Cauda
GCP (Peça Intermediária)
GCD (Peça Principal)
Alterações de Cauda
Cauda/PI enrolada e GCP (Bovino, Azul de Toluidina) 
Alterações de Cauda
Dag defect
Cauda dobrada com GCD (Suíno)
Alterações de Cauda
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
http://penta3.ufrgs.br/veterinaria/celula/
*
*
Obrigado!
“Somos todos iguais
Na chegada e na partida,
No encontro e despedida,
Na jornada pela vida, sem saber
Que a verdade está dentro de nós.”
Catedral
*

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