Curso de HPLC

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Curso de Cromatografia Líquida e Validação de Métodos
Gianfranco Brendolan
SGB Consultoria Química Ltda
Curso de Cromatografia Líquida e Validação de Métodos
	1 – cromatografia Líquida e sua utilização
	2 – conceitos de separação cromatográfica
	3 – detecção, sensibilidade e seletividade
	4 – preparo de amostra
	5 – coluna
	6 – sistema cromatográfico
	7 – gradiente 
	8 – desenvolvimento de métodos
 
	1 – validação: uma visão geral
	2 – critérios de validação
	3 – estatística 
	4 – parâmetros da validação
	5 – preparando o estudo da validação
	6 – validação de métodos qualitativos
Primeira parte – HPLC
Capítulo 1º
	A HPLC é uma das mais modernas técnicas analíticas que temos.
	Tem seu aparecimento em meados 1970 e até hoje não para de crescer.
	Como toda técnica analítica tem suas vantagens e desvantagem.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 1º
	Vantagens da HPLC
	Menor tempo de análise. 
	Alta resolução 
	Resultados quantitativos. 
	Boa sensibilidade 
	Versatilidade 
	Automatização. 
	Desvantagens (limitações)
	Alto custo da instrumentação. 
	Alto custo de operação. 
	Difícil análise qualitativa. 
	Falta de detector universal sensível . 
	Necessidade de experiência no seu manuseio. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 1º
	Técnicas da HPLC
Há cinco tipos diferentes de fases estacionárias, que implicam em cinco mecanismos diferentes de realizar a HPLC. 
Cromatografia Líquido-Sólido ou por Adsorção 
Cromatografia Líquido-Líquido ou por Partição 
Cromatografia Líquida com Fase Ligada 
Cromatografia por Exclusão 
Cromatografia Líquida por Troca Iônica 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Conceito de separação
70% dos trabalhos em HPLC são de fácil resolução pois normalmente trabalhamos com uma única substância.
30% dos trabalhos são os mais difíceis e desafiadores que requerem experiência e conhecimento.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Resolução.
O quanto dois picos estão separados entre si.
Matematicamente a resolução é definida como:
t1 e t2 são os tempo dos picos
W1 e w2 são as larguras da base dos picos
		(eq. 2.1)
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	A medida completa da resolução não envolve somente a distância entre os dois picos, mas sim outros fatores como: seletividade, fator de capacidade e o número de pratos teóricos. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	 α é definido como a razão entre os fatores de capacidade dos picos.
	k' é definido como fator de retenção e está baseado no tempo morto da coluna.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Com base no exposto acima, podemos verificar que quando o valor temos o que podemos considerar uma situação de separação completa. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Os principais parâmetros que afetam a resolução são:
	Composição da fase móvel.
	Composição da fase estacionária.
	Temperatura.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Mudanças na fase móvel ou fase estacionária geralmente afetam K e α com menos efeito sobre N.
	O valor de N depende da qualidade da coluna e pode variar mudando-se 
	Taxa de fluxo
	Comprimento da coluna
	Tamanho da partícula
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Com base na eq. 2.2 a resolução aumenta sempre que o valor de K da amostra aumenta; se dois compostos eluirem próximo de t0 então K=0 e RS=0.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	É muito importante que durante o procedimento de pesquisa e desenvolvimento de métodos analíticos se tenha um conhecimento completo da coluna que estamos utilizando, para tanto o valor do t0 é muito importante.
	O valor do t0 pode ser deretminado de varias formas:
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeiro distúrbio significativo da linha de base.
Uso de uma fase móvel muito forte.
Cálculo com base nas dimensões da coluna.
Injetando amostra sem retenção.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Já se quisermos fazer a determinação do por cálculo podemos usar a seguinte equação:
	Onde: Vm = Volume morto e F=fluxo
	
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Assim temos
	 L = comprimento da coluna em centímetros.
	 d =diâmetro da coluna em centímetros.
 Assim : 
 
	para uma coluna de 0,46 cm de ID temos
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Para a determinação efetiva pode-se utilizar substância que não apresente retenção, e para coluna de fase reversa utiliza-se uma concentrada de nitrato de sódio detectando em 210nm.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Efeito da Seletividade 	
	Muitas substâncias são analisadas com uma ótima resolução, fazendo-se ajustes na força do solvente (%B), ajustando o tempo de retenção.
	De qualquer maneira, no desenvolvimento do método, depois de ajustar o valor de 0,5<K<20, vamos mexer no valor de α.
	O valor de α pode ser modificado mudando-se a fase móvel, mudando o tipo de coluna ou mudando a temperatura.
	Usualmente começamos pelas mudanças do solvente.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	HPLC Método	Qual força de solvente é usualmente variada.
	Fase Reversa	Água (A) mais solvente orgânico (B). (Ex. água - acetonitrila); aumento na %B diminuição de K.
	Fase Normal	Solvente orgânico não polar (A) mais solvente orgânico polar (B). (Ex. hexano - propanol); aumento na %B diminuição de K.
	Íon-Par	Mesmas condições da fase reversa.
	Troca Iônica	Solução aquosa, tampão mais adição de sal. (Ex. 5mM acetato de sódio mais 50 mM de NaCl); aumento da força iônica (NaCl concentração) diminuição de K.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Variável	Exemplo
	RUN 1	RUN 2
	Mudar %B	40% ACN	45% ACN
	Troca do solvente orgânico	40% ACN	50% MeOH
	Mistura de sol. Orgânicos	40% ACN	20% ACN + 25%MeOH
	Mudança pH (iônica)	ph = 2,5	pH = 3,5
	Mudança do íon-par	Não	25mM octano sulfonato
	Troca do tampão em conc. do tampão	25mM citrato	50 mM acetato
	Troca de aditivo	Não	10mM TEA
	Adição agente de complexação	Não 	10 mM nitrato de prata
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Mudança de Coluna.
		A natureza da coluna é sem dúvida um problema, assim a troca da marca da coluna pode trazer mudanças drásticas. 
	É importante ter sempre em mente que coluna estamos utilizando, pois C18 temos muitas por aí. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Assim:
	A natureza química ou a funcionalidade da fase ligada. (Ex. C18, fenil ou ciano).
	A quantidade de fase ligada por unidade de área das partículas de sílica. (Ex. 2 VS. 4mol/m2).
	A maneira com que a fase ligada é ligada com a sílica. (Ex. monofuncional VS. polifuncional reação com silanos)
	A natureza da superfície da sílica, entre vários fornecedores.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Devemos lembrar também que o método é, e sempre será validado para as condições do momento e em caso de mudança, estudos de equivalência de coluna deverão ser feitos. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Temperatura. 
	A temperatura, exceto para análises iônicas, não tem muito efeito na mudança de K e .
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Pratos Teóricos.
		Os pratos teóricos na coluna HPLC são um parâmetro que define a resolução. É um valor de grande importância na avaliação da performance do método. 
	Os números de pratos teóricos podem ser incrementados via uma série de fatores: 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
Colunas bem empacotadas.
Comprimento da coluna.
Baixos fluxos - mas não muito baixo.
Partículas pequenas - diminuição das partículas.
Baixa viscosidade da fase móvel a altas temperaturas.
Moléculas pequenas.
Efeitos extra coluna minimizados ao máximo.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	A performance da coluna pode ser definida em termos do valor de N (pratos teóricos), mas também de simetria de pico.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Porém normalmente utiliza-se a largura na meia altura.
				
	Se fizermos uma avaliação mais profunda a assimetria do pico tem influência, assim a fórmula fica:
Primeira parte– HPLC
Capítulo 2º
	Se fizermos uma avaliação mais profunda a assimetria do pico tem influência, assim a fórmula fica:
			
	Esta equação é conhecida como equação de Dorsey-Foley.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Figura 2.7 - Efeito de coluna na separação. Amostra pesticida. 
	Condição a) 25 x 0,46 cm ZorbaxSB C8 40% ACN-Água, 30C. 1,0 ml/min b) - e) na figura.1 - Atrazina Metabolito; 2 - Metribuzin Metabolito; 3 - Fenam Sulfoxido; 4 - Fenam Sulfona; 5 - Diuron; 6 - Propanil; 7 - Pronamide Metabolito; 8 - SWEP
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Figura 2.8 - Efeito do volume da amostra Vs, sobre a largura do pico e altura Vs/Vc = 0,3 (1); 3 (2); 5 (3); 15 (4). Simulação por computador. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 2º
	Um outro problema provocado pela quantidade grande de amostra na coluna é o fenômeno da triangulação dos picos, provocada pela excessiva retenção da amostra na coluna.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	DETECÇÃO, SENSITIVIDADE E SELETIVIDADE 
	A grande maioria dos métodos analíticos é levada a efeito utilizando-se como sistema de detecção o UV, que pode ser UV variável ou um foto diodo array (DAD ou PDA). 
		A utilização de detectores diferentes somente é procurada quando:
			
	As substâncias absorvem pouco ou nada na região do UV.
	A concentração do analito é muito baixa para ser detectado.
	Amostras interferentes são importantes.
	Informações qualitativas estruturais são requeridas.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Separação da Riboflavina em ração de cachorro, por troca - catiônica.
	Condições: Coluna Zipax SCX com 1,0 ml/ml, água, temperatura ambiente.
	a) UV 365nm, b) detector de fluorescência.
	Excitação a 365 nm, emissão a 530 nm.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Detector UV 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Sistema de difração do DAD 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	As Amostras 
	sistema de detecção por UV, depende como da absorbância da amostra
	torna-se muito importante conhecer a curva de UV, do(s) composto (s) que estão sendo analisados pois se pode assim definir qual o comprimento de onda que deveremos trabalhar. 
	torna-se muito importante conhecer a curva de UV, do(s) composto (s) que estão sendo analisados pois se pode assim definir qual o comprimento de onda que deveremos trabalhar. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Espectro de UV com máximo e mínimo e a utilização na avaliação dos produtos
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	É sabido também que a resposta do composto é proporcional a sua absorbância molar , assim para análise de traços é importante que o composto tenha um  maior que 1000, pois valores menores que 100 não são possíveis pelo UV.
	Somente os hidrocarbonetos não poderão ser analisados, enquanto os hidrocarbonetos que possuem funções com (-0-) éter, (-OH) hidroxila, (-Cl) cloro, (-COOH) carboxila, ou (-COOR) éster que são grupos com absorbância marginal (<100) e requerem detecção em  185 a 200nm.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Tipo de composto	Cromóforo	Comprimento de onda	Absortividade 
molar
	Acetilidene	-CC-	175-180	6000
	Aldeído	-CHO	210
280-300	1500
11-18
	Amina	-NH2	195	-
	Ácido	C=N	190	5000
	Azo	-N=N	285-400	3-25
	Bissulfeto	-S-S	194
255	5500
400
	Brometo	-Br	280	300
	Carboxil	-COOH	200-210	50-70
	Éster	-COOR	205	50
	Éter	-O-	185	1000
	Iodeto	-I-	260	400
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Absorbância da Fase Móvel 
	A seletividade, a sensibilidade de um sistema de detecção de cromatografia líquida está diretamente ligada ao detector, ou não? 
	. É lógico que os avanços tecnológicos trouxeram melhoras com grades, com melhor precisão, fenda cada vez mais estreita, laser em sistemas de alinhamento e muitos mais avanços, porém de que adiantam todos estes avanços se ao desenvolvermos um método escolhemos uma fase móvel errada, não errada do ponto de vista de separação, mas do ponto de vista de detecção.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Toda vez que trabalhamos com um detector e fazemos o famoso "ZERO"- (Por favor, Zé, zera o detector) nós estamos roubando a sensibilidade do mesmo.
		É a mesma coisa que se pensar em uma pilha de sacos e que por motivos estratégicos, precisamos de um estoque de segurança, quanto maior o estoque de segurança, menor a quantidade disponibilizada sempre para um número fixo de sacos iniciais.
	Em função disto, ficou definido pela prática que a absorbância da fase móvel deverá ser menor que A<0,5 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Produto	Absorbância (AV) em comprimento de onda (nm) específico
	200	205	210	215	220	230	240	250	260	280
	Solventes
	Acetonitrila	0.05	0.03	0.02	0.01	0.01	<0.01
	Metanol	2.06	1.00	0.53	0.37	0.24	0.11	0.05	0.02	<0.01
	MeOH degaseificado	1.91	0.76	0.35	0.21	0.15	0.06	0.02	<0.01
	Ácido Acético	2,61	2,63	2,61	2,43	2,17	0,87	0,14	0,01	<0,01
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Mistura de Solventes com Absorbância (< 0,5 AU) em 200nm.
	Fase aquosa
	0-20% metanol - água
0-28% isopropanol - água
0-20% THF
0-100% Acetonitrila - água
	ACN - Água com aditivos
	0,2% Ácido acético
0,4% Ácido trifluoracético
250 mM NaCl
>25 mM potássio (ou sódio) fosfato pH = <5
25 mM sódio (ou potássio) fosfato pH = 6,8
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Absorbância em UV de Solventes em Fase Normal 
	Solvente	Absorbância no comprimento de onda
	200	210	220	230	240	250	260
	Acetato de etila	>1.0	>1.0	>1.0	>1.0	>1.0	>1.0	0.10
	Éter etílico	>1.0	>1.0	0.46	0.27	0.18	0.10	0.05
	Hexano	0.54	0.20	0.07	0.03	0.02	0.01	0.00
	Cloreto de metilene	>1.0	>1.0	>1.0	1.40	0.09	0.00	0.00
	Metil t-butil éter 	>1.0	0.69	0.54	0.45	0.26	0.11	0.05
	n-Propanol	>1.0	0.65	0.35	0.15	0.07	0.03	0.01
	i-Propanol	>1.0	0.44	0.20	0.11	0.05	0.03	0.02
	Tetrahidrofurano	>1.0	>1.0	0.70	0.50	0.30	0.16	0.09
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Sinal/Ruído 
	O valor do ruído pode ser dividido em dois termos que são:
	Ruído curto
	Ruído comprido ou longo
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	O ruído curto também denominado de ruído de alta freqüência é provocado principalmente por problemas eletrônicos que vão desde uma luz espúria até problemas de componentes eletrônicos da placa.
	O ruído longo é provocado principalmente por problema mecânico e de fase móvel que podem ser facilmente corrigidos como: flutuação da temperatura, ruído da bomba e/ou problemas na própria coluna.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Assim a precisão fica vinculada a estas flutuações de ruído que podem comprometer toda a análise e/ou desenvolvimento.
	O coeficiente de variação da relação sinal/ruído é definido como:
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Assim em função do sinal/ ruído temos como calcular a massa mínima. onde:
	M = Peso molecular do analito (Da)
	Vm = Volume morto da coluna (ml)
	R = Ruído da linha de base em A
 CV = A precisão desejada %
 N = Número de pratos teóricos
 Lfc = Percurso ótico da célula de fluxo (cm)
  = Absortividade molar do composto.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Com base na relação sinal/ruído podemos procurar uma melhora no S (sinal) provocando seu incremento com base em:
	C = Concentração do analito na célula de fluxo
	Co = Concentração do analito na amostra injetada
	Vs = Volume da amostra
	N = Número de pratos teóricos
	Vm = Volume morto da coluna
	K = Fator de retenção
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
		Assim com esta equação podemos definir os melhores parâmetros para a melhoria analítica, como o aumento de S
Aumento da concentração do analito
Aumento do volume da amostra injetada
Aumento na eficiência da coluna pelo aumento do número de pratos teóricos.
Diminuição do volume morto da coluna
Diminuição do fator de retenção da coluna. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
		Sempre e em qualquer situação devemos nos lembrar que todos os fatores estão interligados entre si.
		Em resumo osfatores para maximização do detector de UV com relação a sensibilidade (S/R)
	Selecionar o comprimento de onda com o máximo .
	Injetar o maior volume possível.
	Concentrar a amostra para aumentar a massa injetada.
	Reduzir o valor de K para o mínimo possível (sem interferência entre picos).
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Considerar sempre detectores alternativos se a eq. 3.4 mostrar uma quantidade não aceitável.
	Aumentar a constante do detector
	Trabalhar sempre com lâmpadas em ótimas condições de uso.
	Use pulse damper para eliminar ruídos de bomba se necessário.
	Verificar a absorbância dos solventes A e B se a mistura for feita em linha.
	10. Minimizar eluentes via uso do clean-up, gradiente ou column switching.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
	Outros Detectores.
Diode-Array UV Detector
Detector Universal 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Detectores por Absorbância no Infravermelho
 Detectores por Fluorescência 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 3º
Detectores Eletroquímicos
Detectores de Radioatividade 
Detector de Massa 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
		Quando pensamos no preparo da alíquota da amostra devemos direcionar o nosso pensamento em três principais itens:
A alíquota deverá estar relativamente livre de interferentes.
A alíquota não deverá danificar a coluna analítica.
A alíquota deverá ser compatível com o método de HPLC desenvolvido.
		Assim a amostra será mais bem preparada se a última diluição for feita na fase móvel.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Tipos de Amostras
		As matrizes de amostras podem ser classificadas em orgânica (inclui as biológicas) e inorgânicas, podendo ser subdivididos em sólido, semi-sólido (inclui pastas, cremes, gel, colóides e suspensões), líquidas e gases.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
		As substâncias gasosas são normalmente analisadas por GC, somente uns poucos métodos para substâncias gasosas existem para HPLC. Como exemplo tem o método EPA TO-11 que analisa aldeídos e cetonas voláteis via derivatização com 2.4 dinitrofenilhidrazina.
		Sem qualquer dúvida, amostras líquidas são mais facilmente preparadas em cromatografia líquida, pois uma simples diluição é quase que a única preparação necessária.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Opção	Comentário
	1- Coleta da amostra	Obter uma amostra representativa usando processo estatístico validado
	2- Estocagem e preservação da amostra	Utilizar recipientes inertes apropriados e firmementes fechados. Especial atenção deverá ser dada a produtos voláteis instáveis ou materiais reativos. Estabilizar a amostra se necessário. Amostras biológicas devem ser congeladas. 
	3- Processamento preliminar da amostra	As amostras devem estar na melhor forma para o pré-tratamento (ex.: secagem, peneiramento, moagem, etc.). Amostras finamente dispersas são facilmente extraídas ou dissolvidas.
	4-Diluição ou pesagem volumétrica	Tome as necessárias precauções para reativos instáveis ou materiais biológicos, para diluições utilize sempre material volumétrico.
	5-Métodos de processamento alternativo da amostra.	Substituição de solvente, desalting, evaporação, liofilização, etc.
	6 -Remoção de partículas	Filtração, extração em fase sólida, centrifugação.
	7-Extração da amostra	Métodos para líquidos (tab. 4.5) e método para sólidos (tab. 4.2 e 4.3).
	8-Derivatização	Usado principalmente para aumentar a detecção do analito, pode ser para melhorar a separação.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Método de
Pré-tratamento	Técnica Principal	Comentário
	Extração sólido-líquido	A amostra é colocada em um recipiente e o solvente é adicionado para dissolver o analito de interesse; a solução é separada do sólido por filtração (conhecida como agitação/filtração)	Solvente pode ser aquecido ou refluxado para melhorar a extração; amostra finamente dividida melhora o processo. A amostra pode ser agitada manualmente ou mecanicamente e o líquido separado por filtração, decantação ou centrifugação.
	Extração por Soxhlet	Amostra colocada em um dispositivo poroso; um solvente em refluxo constante passa pela amostra e dissolve os analitos que são coletados continuamente no balão de refluxo.	Extração ocorre com solvente puro. A amostra deverá ser estável ao solvente em ebulição lenta mas permite uma extração completa do analito; barata e eficiente com amostras finamente divididas; excelentes recuperações (usado como referência)
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Lixiviação de fluxo forçado	A amostra é submetida em um tubo a um sistema de fluxo forçado onde o tubo pode ser aquecido próximo ao ponto de ebulição do solvente.	Avaliável para amostras particulares, o solvente pode ser bombeado ou forçado via pressão de N2 a passar pela amostra. Volumes menores que o Soxhlet são usados. Resultados similares e mais rápidos. 
	Homogeneização	A amostra é colocada em um misturador, tipo liqüidificador, adicionado solvente e todo homogeneizado a um estado finamente dividido. O solvente é então removido.	Usado para análise de tecidos de plantas e animais, alimentos, amostras ambientais, e pode-se utilizar solventes orgânicos ou inorgânicos, gelo seco ou terras diatonáceas podem ser adicionadas para tornar a amostra mais fluída, melhor dispersão da amostra, melhor extração.
	Sonicação	Amostras finamente divididas são colocadas com o solvente em banho ultra-sônico que pode ser aquecido. 	A dissolução é favorecida pelo uso do ultra-som, o aquecimento melhora a extração e é rápido e seguro. 
	Dissolução	Amostra é colocada diretamente com solvente.	Amostras inorgânicas podem precisar de ataque químico.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Método de
Pré-tratamento	Técnica Principal	Comentário
	Extração acelerada com solvente (ASE)	Amostra é colocada em um recipiente fechado e aquecida acima do ponto de ebulição do solvente, tem um aumento de pressão no vaso, a amostra é transferida para o vial automaticamente para futuro tratamento. 	Grande aumento na velocidade da extração líquido-líquido automático, a amostra sai dissolvida sendo necessário concentração. Segurança é necessário.
	Extração com Soxhlet automático	Combinação em lixiviação a quente e Soxhlet. Amostra colocada no recipiente é inicialmente imersa no solvente à refluxo. Depois é lavada pelo sistema Soxhlet com solvente a refluxo e concentração final. 	Manual ou automático, usa menos solvente que o Soxhlet e permite sua reutilização. Diminui o tempo de extração.
	Extração com fluído super crítico	A amostra é colocada em um recipiente e via fluxo contínuo é extraído com um fluído super crítico CO2. Após a despressurização o analito extraído é coletado em um solvente ou trapeado sobre algum inerte. 	Versão automática ou manual. A extração pode ser feita com modificações no fluído super crítico. É considerado um método muito bom.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Extração com microonda	A amostra é colocada em sistema aberto ou fechado e aquecido com microonda, que provoca a extração com solvente.	Extração em sistema de absorção de microonda (MA) que é feita em vaso fechado com aumento de pressão; e a extração não absorção de microonda (NMA) em que não temos aumento de pressão.
	Extração térmica	Extração com sistema de headspace dinâmico, a amostra é aquecida a altas temperaturas (controlada) pode ser até 350C. 	Sistema todo construído de quartzo em sílica fundida, evitar contato da amostra com metais. Utilizado para composto de baixa pressão. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Meio
de Filtração	Produto Típico	Recomendação	Comentários
	Papel de filtro	Células	Para remoção de partículas grandes > 40µm	Cuidado para não introduzir fibras na amostra.
	Membrana filtrante	Náilon, PTFE,
polipropileno, poliester, polieter, sulfone policarbonato, polivinilpirrolidona 	Para remoção de partículas pequenas < 10µm.	Fácil de utilizar, necessidade de pré-filtragem, pode ser necessários filtros com 0,25 a 2µm, os mais comuns.Avaliar compatibilidade membrana/solvente. 
	Membrana funcionalizada	Membrana de afinidadee membrana de troca iônica.	Pode remover ambas partículas e interferentes da matriz.	Pode ser utilizado em amostras sujas, pode ser necessário pré-filtração.
	SPE cartucho	Sílica e fase-ligada	Pode remover partículas e interferentes da matriz.	Partículas de sílica - fase ligada pode passar; plastificantes podem ser extraídos da coluna. Problema de reprodutibilidade.
	SPE disco	PTFE e fibra de vidro como base.	Pode remover partículas e interferentes da matriz.	Pode precisar de filtro de holder; membrana de PTFE é sensível, pode-se passar grandes volumes com elevado fluxo. Problemas de reprodutibilidade de lote a lote.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Tipo de amostra	Método	Princípio Técnico	Comentários
	Orgânico, voláteis, gasosos	Trapping de fase sólida	Substâncias gasosas passam através de um tubo e são trapeados (sílica, carvão ativado) o trap. é então eluido com solvente forte.	Fluxo do gás é crítico para a eficiência, cuidados com os aerossóis, e a saturação, problemas de adsorsão irreversível também precisa ser avaliada.
	Trapping líquido	Amostra gasosa é passada através do líquido e o analito fica dissolvido, sendo que outros gases são eliminados.	Fluxo crítico para não formar bolhas ou aerossóis. Agentes complexantes podem ser utilizados e a temperatura pode ser utilizada.
	Líquido	Extração fase sólida	Líquido passa através da fase sólida que seletivamente retém o analito (ou as interferências). Os analitos são deslocados com solventes fortes. Em situações em que o analito passa e as interferências ficam retidas. 	Temos uma grande variedade de fases sólidas atendendo uma vasta gama de produtos.
	Extração líquido-líquido	Amostra particionada em dois líquidos imiscíveis, com a maximização da diferença de solubilidade.	Cuidados com a formação de emulsões, adição de sal para sua quebra. Muitos métodos publicados.
	Diluição	Amostra diluída com solvente compatível com a fase móvel do HPLC. Ajuste para linearidade.	O solvente a ser utilizado não pode ser mais forte que a fase móvel e ser miscível com ela. Método típico de produto farmacêutico dilui e injeta. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Evaporação	Líquido removido por fluxo de ar, vácuo, ou gás inerte. 	Não evaporar rapidamente, respingos provocam perda de amostra, cuidado com analito aderido à parede, melhor usar N2.
	Destilação	Amostra é aquecida até o ponto de ebulição do solvente, e o analito evapora.	Válido para substâncias que podem ser volatilizadas. Temperatura máxima 100C.
	Microdiálise	Uma membrana semi permeável é colocada entre duas fases aquosas e o soluto da amostra é transferido de um líquido para outro com base na concentração diferencial.	É uma técnica de enriquecimento, muito utilizada para amostras biológicas.
	Liofilização	Amostra aquosa é congelada e a água removida por sublimação sob vácuo.	Muito bom para ácidos orgânicos, possível perda de analitos voláteis.
	Suspensão	Filtração	Remoção das partículas por filtração.	Muito recomendado para evitar problema de pressão, usando filtro (< 0,2µm).
	Centrifugação	Utilização de sobrenadante.	Remoção de sólido quantitativo.
	Sedimentação	Amostra deixada em repouso, só que depende do raio de Stokes.	Processo muito lento e manual.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 4º
	Derivatização
		A derivatização envolve uma reação química entre o analito e um reagente, sendo que isto é feito com o objetivo de melhorar a detectabilidade do analito ou até torná-lo detectável.
		Em resumo, em HPLC temos 4 motivos básicos.
	Melhorar a detecção.
	Mudar a característica molecular para melhorar o cromatograma.
	Mudança com relação a matriz para melhorar a separação.
	Estabilizar um analito.
		A derivatização ideal é aquela em que a reação é rápida, quantitativa e temos um mínimo de subprodutos.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	- COLUNA
	A coluna na análise cromatográfica é o coração do sistema. A estabilidade e a alta-performance da coluna é importante na confirmação da estabilidade e reprodutibilidade do método 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	Características das Fases Estacionárias usadas em HPLC
	Alumina, celulose, sílica gel e zeolita, que são os materiais usados tradicionalmente na cromatografia líquida clássica, são muito pouco usadas na HPLC porque as suas partículas têm forma irregular, são muito grandes e dificilmente se consegue reproduzir os resultados da análise devido à facilidade que estes materiais apresentam em mudar as suas propriedades.
	Na HPLC os materiais ideais são aqueles que, em menor tempo possível, têm a máxima capacidade de amostra, dão a melhor resolução na separação da mistura, são de fácil introdução na coluna, produzem pequena queda de pressão e que sejam de baixo custo. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para a HPLC podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos:
Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos.
Partículas porosas ou peliculares.
Partículas esféricas ou irregulares.
Partículas com diferentes diâmetros.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	Propriedades	Recheios
porosos	Recheios 
peliculares
	Irregulares (>30 m)	Esféricos (>30 m)	Esféricos ou irregulares (5 ou 10 m)	Esféricos (> 30 m)
	Eficiência	Baixa a moderada	Baixa a moderada	Alta	Moderada a alta
	Velocidade da análise	Moderada	Moderada	Rápida	Rápida
	Facilidade de enchimento	Razoável	Boa	Razoável	Excelente
	Quantidade da amostra	Grande	Grande	Grande	Pequena
	Permeabilidade da coluna	Alta	Alta	Baixa	Muito alta
	Capacidade	Alta	Alta	Alta	Baixa
	Custo	Baixo	Moderado	Alto	Moderado a alto
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	2	Fases Estacionárias para HPLC com Fase Ligada
	A superfície de sílica, que é o suporte mais popular, pode ser modificada por um destes caminhos, entre outros:
	Formação do éster silicato (Si-O-R) por reação do grupo silanol com um álcool:
	
		 Si-OH + ROH	 Si-O-R + H2O
	Formação da ligação siloxano (Si-O-SiR) por reação do grupo silanol com um organoclorossilano:
	
		Si-OH + R3 SiCI Si-O-SiR3 + HCI
	Formação da ligação silício-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila, para produzir o cloreto, que, em seguida, reage com um composto organometálico para produzir um grupo orgânico ligado diretamente a superfície da sílica:
	
		Si-OH + SOCI2 Si-CI + IICI + SO2
	
		 Si-CI + RLi Si-R + LiCI
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
		Fases Estacionárias para HPLC por Troca Iônica 
		Os grupos quimicamente ligados, presentes em todo tipo de material de troca iônica, são:
-SO-3	- trocadores fortes de cátions.
-CO-2	- trocadores fracos de cátions.
-NR+3	- trocadores fortes de ânions.
-NH2 R+- trocadores fracos de ânions.
		As catiônicas são adquiridas comercialmente na forma de sais de sódio (Na+) ou de íon hidrônio (H+) e as aniônicas na forma de cloreto (Cl-).
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
		Em termos de funcionamento de uma coluna, este está totalmente ligado ao tipo de partícula envolvida.
		Quando enchimentos totalmente porosos de partículas grandes são usados para HPLC analítica as bandas são relativamente largas dando separações demoradas e/ou de baixa resolução. O alargamento da banda se atribui a várias causas, a maior das quais pode ser visualizado através de um simples modelo.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	Particula porosa
Figura 5.3 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
		Partícula pelicular. Embora o alargamento por penetração esteja minizado, podemos visualizar na figura 5.4. pelo menos uma outra causa de alargamento não eliminado com o uso de tais enchimentos. Duas moléculas que passam por uma partícula "pelicular"(durante adsorsão - desorção) podem tomar vários caminhos dependendo de onde estão localizadas na fase móvel. Embora as moléculas agora não penetrem profundamente na partícula elas têm que migrar ao redorda esfera sólida de vidro.
		Este efeito é aumentado quando lembramos que o fluxo perto da superfície de uma partícula é normalmente mais lento que o fluxo dentro da fase móvel livre
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	A eficiência também depende de uma certa maneira do diâmetro da coluna, isto devido ao "efeito parede". Este efeito se deve a um fluxo irregular ao longo da parede interna da coluna alargando a banda. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	Um passo adicional na avaliação de uma coluna consiste na medida da eficiência dela em termos da altura de um prato (H) como função da velocidade linear média do solvente () que passa pela coluna. O gráfico de H versus , chamado de curva de Van Deemter, foi desenvolvido para avaliar e otimizar as condições de análise por cromatografia de gás. Ignorando fatores de alargamento causados pelo injetor e tubulações do sistema sem considerar a coluna, pode-se descrever o alargamento da banda como soma de quatro fatores:
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	1) Percurso - Moléculas diferentes podem tomar percursos de comprimentos diferentes através do leito. Este efeito é relacionado com o diâmetro médio da partícula e o tipo de enchimento.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	2) Difusão Longitudinal - Durante um tempo dentro da coluna as moléculas da banda vão difundir-se em todas as direções inclusive na direção longitudinal da coluna causando assim alargamento. Isto naturalmente depende da velocidade da fase móvel e a difusividade da amostra na fase móvel.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	3) Transferência de Massa na Fase Móvel - As moléculas perto da superfície do enchimento sempre migrarão mais lentamente comparado com as moléculas no meio da fase móvel (figura 5.8.). Este efeito é proporcional ao coeficiente de distribuição K definido como: 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	onde Ss é a "concentração"da amostra na fase estacionária e Sm na fase móvel. O fator de capacidade k' é definido como: 
	onde Ss á a quantidade da amostra na fase estacionária e Sm na fase móvel. Os dois termos são relacionados pela razão de fase 	( a ) 
	onde :
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
		
	4) Transferência de Massa na Fase Estacionária - A fase estacionária possui um volume finito e significativo tornando necessário um tempo para as moléculas da amostra difundir da superfície para dentro da fase e voltar novamente para a superfície (figura 5.9.). O alargamento aqui é relacionado com a profundidade da fase e a difusividade da amostra nela.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
	O efeito de percurso é independente da velocidade linear, a difusão longitudinal é inversamente proporcional à  e os dois efeitos de transferência de massa são diretamente proporcional à . Por isso podemos formular uma relação como segue: 
	onde A, B e C são constantes do sistema. Uma curva típica de Van Deemter é mostrada na figura 5.10 e pode ser explicada nos termos desta expressão.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 5º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	- SISTEMA CROMATOGRÁFICO
		As substâncias químicas são divididas basicamente em dois grandes grupos que são:
			a) Substâncias não iônicas
			b) Substâncias iônicas
		Principalmente do ponto de vista da cromatografia líquida esta divisão tem uma grande importância, pois cria uma linha divisória entre duas técnicas bastante distintas, porém iguais, que são a cromatografia líquida de fase reversa e normal e a cromatografia líquida de troca iônica.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Vamos em vista disto, dividir este nosso capítulo em duas partes:
		6.1 - Compostos não Iônicos.
			6.1.1 - Cromatografia Fase Reversa.
			6.1.2 - Cromatografia Fase Normal.
		6.2 - Compostos Iônicos.
			6.2.1 - Generalidades.
			6.2.2 - Cromatografia de Íon-Par
			6.2.3 - Cromatografia de Troca Iônica
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	O esquema de retenção em fase reversa (RPC) está esquematizada na figura 6.1. O sistema de separação segue o mesmo raciocínio que a extração de diferentes compostos da água com solvente orgânico, exemplo o octanol, onde os compostos hidrofóbicos (não-polares) terão preferência de ficar.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Técnicas para Modificar o Tempo de Retenção em RPC.
	Diminuição do Tempo de Retenção	Aumento do Tempo de Retenção
	Coluna mais polar (ciano, C4)	Menor polaridade de coluna (C8, C18)
	Fase móvel menos polar (alta %B - mais orgânico) (solvente orgânico menos polar)	Fase móvel mais polar (diminuição %B - mais água) (solvente orgânico mais polar)
	Aumento da temperatura	Diminuição da temperatura
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Efeito da Fase Móvel 
- Efeito da troca de %B em separação RPC, situação hipotética. Condição : coluna 15 x 0,46 cm C18, 1,5 ml/min., fluxo (to = 1,0 min). 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Gráfico de retenção do composto log. K x força da fase móvel %B, com base nos cromatogramas da figura 6.2. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Seletividade em Fase Reversa.
		Observando os cromatogramas na figura 6.5, podemos verificar como um conjunto de substâncias podem ser separadas, avaliando-se somente a substituição da fase móvel, podemos verificar também que utilizando-se o conceito de K (fator de capacidade ou poderíamos chamar fator de retenção) é possível encontrarmos a composição ideal para o sistema.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
A seletividade na força do solvente. Coluna 15 x 0,46 cm C18, fluxo 1,5 ml/min.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Otimização na Separação.
		A maneira mais fácil para se desenvolver um bom método por fase reversa é seguindo os pontos abaixo:
	Ajustar %B para 0,5 < K < 20 (preferível 1 < K < 10).
	Avaliar o tailing peak ou número de pratos teóricos.
	Ajustar a seletividade se necessário
Refinar %B
Trocar o solvente orgânico [ (fraco) < metanol < acetonitrila < etanol < tetrahidrofurano < propanol < (cloreto de metileno) (forte) ]
Trabalhar com mix de solventes orgânicos.
Mudar o tipo de coluna.
Variar a temperatura.
	Otimizar as condições de coluna (comprimento, partículas, fluxo).
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Sete cromatogramas mostrando a experiência com a seletividade de solventes em naftalenos substituídos. Coluna 15 x 0,46 cm Zorbax C8, fluxo 2 ml/min., 40C. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Cromatografia de Fase Normal.
		Na coluna de fase normal (NPC), a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, i.é, exatamente o oposto que na RPC.
		Na NPC os compostos menos polares (hidrofóbicos) eluem primeiro, que os mais polares (hidrofílicos) que eluem depois - o oposto que a RPC.
		Algumas razões realmente fazem com que se utilize uma coluna de fase normal, porém a de fase reversa é sempre preferida:
A amostra não tem retenção em RPC.
A amostra tem uma retenção excessiva em RPC.
A separação por RPC não é adequada.
A amostra contém isômeros.
Trabalhar com sistema preparativo.
A amostra está solubilizada em solvente não polar. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Retenção em Fase Normal.
		Na figura 6.10, podemos ver uma representação hipotética de como ocorre a separação das substâncias em uma coluna NPC. Como podemos verificar na realidade, existe uma competição entre o solvente e a molécula pelo sítio ativo.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Efeito da força do solvente em NPC. Separação de anilina (1) e fenol (2). Coluna: 25 x 0,46 ciano, 1,0 ml/min., MTBE-hexano. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Otimização de Separação em NPC.
		Em geral como já mencionado o modo de avaliar o problema e sua solução em NPC é o mesmo que em RPC, assim temos:
	Ajustar %B para 0.5 < K < 20 (coluna ciano, hexano-propanol como fase móvel)
	Checar o tailing peak
	Ajustar a seletividade se for necessário
Refinar %B
Mudar osolvente orgânico (MC, MTBC, ACN), refinar %B
Testar mistura de solventes orgânicos
Trocar o tipo de coluna (diol, amino, sílica) e ajustar %B
	Otimizar condição da coluna (comprimento, partículas, fluxo)
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Parâmetro	Comentário
	Tamanho da coluna e fluxo	25x0.46 cm 5 µm fluxo 2 a 4 ml/min
	Coluna tipo ciano	Melhor coluna para método analítico. Coluna estável, operação conveniente
	Sílica	Ótima para processo preparativo, problemática para analises, sofre influência da água
	Diol	Alternativo para ciano
	Amino	Outra alternativa para ciano, pouco estável
	Alumina	Pouco utilizada em HPLC, potencialmente problemática
	A - Solvente
	Hexano	Preferível para baixas detecções para UV (>200 nm) e amostras apolares; para uso com ACN e MeOH requer adição de co-eluentes (ex. cloreto de metileno) 
	FC113	Usado em detecção UV acima de 239 nm, excelentes características de solubilidade (separação preparativa) miscível com todos os solventes B não inflamável - restrito ataca a camada de ozônio
	Cloreto de metileno	Pode ser utilizado em amostras mais polares acima de 235 nm
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	B - Solventes
	1 ou 2 propanol	Detecção >215 nm e separação de amostras mais polares, uma boa escolha para inicio de gradiente
	Cloreto de metileno	Uma boa escolha para a detecção acima de 235 nm pode não ser forte mas elue bem polares em sílica
	MTBE	Boa alternativa para trocar , acima de 225 nm
	Acetato de etila	Boa alternativa para trocar , acima de 225 nm
	Acetonitrila	Boa alternativa para trocar , acima de 225 nm. Precisa de co-eluentes para ser misturado ao hexano
	Aditivo de fase móvel	Trietilamina para substancias básicas ácido acético para substâncias ácidas (se tiver tailing peak) 
	Temperatura	Ambiente, 35 ou 40C
	Amostra	50µL, 50µg para colunas de 0.46 cm de ID.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Composto Iônicos
		Substâncias iônicas são aqueles compostos orgânicos que contém um ou mais grupos ionizáveis. Em HPLC a separação de compostos iônicos é muito mais difícil de ser efetuada e entendida , além do que temos uma série de problemas que não são encontrados em amostras neutras.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Produtos Iônicos Analisados em Fase-Reversa
	Em RPC a retenção aumenta com o aumento da hidrofobicidade da amostra . Quando temos um ácido ou uma base em estado ionizado estes adquirem um caráter hidrofílico e assim o valor de K diminui.
			HÁ 		 A- + H+
			B + H+ 		 BH+
			 Hidrofóbico		 Hidrofilico		
		Maior retenção em RPC		 Menor retenção em RPC
		Ácidos perdem prótons e o pH aumenta, bases recebem prótons e o pH diminui. Assim podemos ter uma relação pois com o aumento do pH o tempo de retenção do ácido diminui e o da base aumenta como pode ser visto na figura 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Efeito do pH da fase móvel na retenção de substâncias ácidas, básicas e neutras. Coluna µBondapack C18 30x0.4 cm fase móvel fosfato 25mM, 40% metanol.
	- ácido salicílico
	- phenobarbitone
	- phenacetin	
(4) - nicotine
(5) - methilamphetamine.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Retenção e capacidade de tamponamento em função do pH e do pKa.
 
	Dependência da retenção com pH- para um composto básico com pKa=4.0. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Deterioração dos picos em função do pH, pela diminuição do efeito tamponante.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Separação de ácidos benzóicos substituídos em função do pH. Coluna Zorbax C8 25 cm, 35% metanol tampão (25mM de acetato de sódio) 35C; fluxo 1.0 ml/min. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Influência da temperatura na separação de ácidos benzóicos substituídos a pH=3.2 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Separação de anilinas substituídas em função da percentagem de Metanol (%B). 
Condição Zorbax SB-C8 25 cm, metanol - tampão (25 mM citrato de sódio, 
pH = 3,5 35C, 10 ml/min. (a) 20% metanol
(b) 40% metanol. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
33.bin
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Com base no diagrama acima vamos avaliar cada uma das etapas.
ETAPA 1 Fazer uma corrida de avaliação com um gradiente 5-100% metanol em 60 min., com tampão fosfato de potássio pH 2,5 - 25 mM em coluna C8 ou C18 com 2 ml fluxo.
Como alternativa sistema isocrático com 60% metanol. 
ETAPA 2 Use o gradiente inicial para definir a %B e avaliar o sistema de modo isocrático - FUJA DO GRADIENTE.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Se não for possível  ETAPA 2a
Como alternativa faça uma corrida para K  10 e assuma uma redução de 10%.
ETAPA 2a Se realmente o sistema isocrático não for possível por não se obter todos os picos com 0,5 < K < 20 então:
Ajuste pH e %B para melhorar a retenção 0,5 < K < 20.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Desenvolver gradiente conforme capítulo 7.
Use sistema íon-par para obter bons tempos de retenção, item 6.2.2.
A probabilidade de que a mudança no pH ou a introdução do íon-par possa melhorar a retenção dos compostos, vale a pena ser avaliado, principalmente para fugir do gradiente.
ETAPA 3 Sobre o valor da %B sugerida faça as mudanças para conseguir um valor de K 0,5 a 20.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
É interessante fazer variações de 5 a 10 %B para definir a melhor concentração.
ETAPA 4-5 Se o uso do MeOH não for adequado, faça a substituição por ACN e recomece. Use a figura 6.4 para fazer a substituição. Em seguida faça os ajustes finais.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
ETAPA 5a Se o pKa dos ácidos for < 2 e das substâncias básicas for > 8, será inevitável o uso do íon-par.
ETAPA 6-7 Uma melhora e pequenas mudanças podem ser conseguidas com mudanças no tipo da coluna, na temperatura ou na concentração do tampão.
ETAPA 8 Quando estiver tudo resolvido, considere as mudanças no comprimento da coluna, no fluxo ou no tamanho da partícula para uma melhora definitiva.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Cromatografia de Íon-Par.
		A cromatografia de íon-par e a de fase reversa são bastante semelhantes, pois a fase móvel, e as colunas são iguais, sendo a única diferença a adição de um reagente à fase móvel, o reagente íon-par e assim temos a IPC cromatografia de íon-par.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Figura 6.18 - Esta figura nos mostra que as vezes so podemos utilizar um sistema de solventes isocrátrico com introdução de agentes de modificação como o ion-par.
Assim na figura 6.18 podemos observar uma série de cromatogramas que a primeira avaliação no cromatograma 6.18a não sugere qualquer relação com a possibilidade de termos um desenvolvimento isocrático.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Mas como o íon-par funciona ? Na figura 6.19 vemos um esquema básico de seu funcionamento na superfície da coluna C8 e C18. Seu funcionamento consiste basicamente em transformar a coluna C8 ou C18 em uma coluna de troca iônica conforme descrição abaixo: 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Figura 6.19 - Representação de uma retenção cromatográfica de íon-par.
	a) Retenção da base protonada (BH+) junto com IPC; Na+ é o cátion da fase móvel; íon-par reagente hexano sulfonato;
	b) Retenção em fase reversa do ácido carboxílico da amostra RCOOH sobre C8 funcionando em função do pH.
	c) Sorção do íon-par reagente (TBA+) sobre a fase estacionária e retenção da amostra , ácido carboxílico (RCOO-) em função do pH.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
- Efeito da concentração do íon-par na separação.
a) Sorção do íon-par reagente é função da concentração e da hidrofobicidade (C6 e C8 sulfonatos).
b) Retenção é função da concentração do reagente. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Efeito da concentração do íon-par e seu tipo na separação de substâncias iônicas.
Adr+ = adrenalina		
BzOH = álcool benzílico
NpS- = naftaleno sulfônico.
Condições: Coluna C18, 20% metanol - tampão (20mM fosfato, pH = 6) 25C.
	a) Sem adição de ion-par
	b) Com adição de 14 mM de octano sulfonato [ 1,6µmol/m2 em (c) ]
	c) Gráfico de soluto retido vs. reagente retido nacoluna (µmol/m2)
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
Seleção de íon-par e concentrações em função da quantidade de MeOH na fase móvel. 
a) Isoterma da C8 	
b) Íon-par de uso com substância básica	
c) Íon-par de uso com substância ácida.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 6º
	Cromatografia de Troca Iônica
		Seria perda de tempo começarmos a falar de cromatografia de troca iônica agora, depois de tudo o que falamos sobre compostos iônicos em fase-revesa e íon-par.
		A cromatografia de troca-iônica hoje fica restrita a algumas situações muito específicas de compostos biológicos, aminoácidos, sais inorgânicos e alguns organometálicos.
 		Devido sua similaridade com a IPC a cromatografia de troca foi perdendo terreno, principalmente pelo fato de trabalhar sempre com soluções aquosas. 
		Se for estritamente necessário o uso da troca iônica utilize o sumário da parte 6.2.1.3 para o desenvolvimento do método.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	GRADIENTE
		A separação cromatográfica pode ser feita de duas maneiras distintas:
				Sistema Isocrático
			Sistema Gradiente
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
		Algumas das razões que dão preferência ao sistema isocrático são:
	Os equipamentos com gradiente não estão disponíveis em todos os laboratórios.
	A eluição por gradiente é complicada e tem dificuldade de aplicação na rotina prática.
	A eluição por gradiente não pode ser utilizada com qualquer detector.
	As corridas com gradiente são geralmente longas devido à necessidade do reequilíbrio da coluna.
	Métodos de gradiente não são sempre transferidos com facilidade devido a diferenças com equipamentos, que provocam mudanças na separação.
	Problemas com linha de base são muito comuns com gradiente e os solventes devem ter um elevado grau de pureza.
	O uso de certas combinações coluna/fase móvel não são recomendadas para uso de gradiente.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
Separação de misturas de ácidos carboxílicos aromáticos por cromatografia de troca iônica.
(a) Separação isocrática com 0,055M nitrato de sódio em água
(b) Gradiente de eluição com nitrato de sódio variando de 0,01 a 0,10M.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
		Quando iniciamos o desenvolvimento de um método com uma amostra de composição desconhecida, temos grandes vantagens começando pelo gradiente, independente se o método final for isocrático, isto porque:
	A separação inicial por gradiente de eluição fornece uma estimativa do range de retenção da amostra; isto permite uma escolha entre isocrático e gradiente.
	Se o sistema isocrático é a melhor escolha, o gradiente inicial permitirá uma melhor estimativa de B% para o próximo experimento. Se o gradiente for escolhido também aqui será o caminho para o ajuste de B%.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	O gradiente inicial indicará de forma melhor, o caminho para uma separação mais rápida.
	Com o gradiente inicial fica mais fácil para encontrar os componentes de baixa concentração.
		As melhores condições para se iniciar um gradiente em condições exploratórias são: coluna de 15 x 0,46 cm e um gradiente de 5% a 100% de acetonitrila com um tempo total de tG = 60 min, 2 ml/min.
		Entretanto outras condições iniciais podem ser escolhidas sem problema. 
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Uma vez feito este screening podemos definir se o sistema irá para o gradiente ou isocrático através da seguinte avaliação:
				Isocrático
		
				Gradiente
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
Uso de gradiente inicial no desenvolvimento de método HPLC. Substitutos de anilina: condições 15 x 0,46 cm coluna, 2 ml/min, 35C
(a) 5 a 100% gradiente acetonitrila - água em 60 min.
(b) Isocrático com 37% de acetonitrila - água.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Desenvolvendo o Gradiente de Separação.
		O desenvolvimento do método para gradiente usa a mesma sistemática que a separação isocrática.
		Assim o desenvolvimento de um método de gradiente pode ser assim sumarizado:
	A primeira corrida de um desenvolvimento de gradiente é aconselhável seguir um range de 5 a 100%B, otimizando o valor de K* (K* > 2).
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Ajustar o gradiente para minimizar o tempo de análise total.
	Ajustar a seletividade do sistema se tiver sobreposição de bandas.
	Considere o uso de um gradiente não linear.
	Quando a separação estiver otimizada, faça variações na condição de coluna para melhorar a resolução e/ou tempo de análise.
	Determine o melhor protocolo para o reequilíbrio da coluna.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
Efeito do solvente na separação de fenóis, coluna 30 x 0,42 cm C18, gradiente na figura.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS
	1. Usar solventes que dissolvem a amostra e que são compatíveis com a coluna e o detector;
	2. Se as substâncias a serem separadas tiverem diferenças na parte polar de suas estruturas usar coluna de fase normal. 
	Se as diferenças forem na parte apolar usar coluna de fase reversa - começar com C18.
	Se houver diferenças dos dois tipos usar fase reversa.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Se os componentes tiverem peso moleculares maior que 2000 usar co­luna de GPC apropriada.
	Estrutura desconhecida - seguir esquema de solubilidade;
	3. Usar uma coluna eficiente;
	4. Inicialmente usar fluxo alto
			coluna de aço: 2-3ml/min.
			coluna radial-pak:	3-6ml/min.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	5. Filtrar amostra e fase móvel - 0,5µ ou 0,22µ;
	6. Começar com uma fase móvel de alto poder de eluição:
	Para fase reversa - 50-100% de CH3OH ou CH3CN ou THF.
	Para fase normal - 100% de clorofórmio ou DCM.
	Todos os componentes devem eluir no volume morto -Vo;
	7. Aumentar retenção - k':
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Fase reversa - aumentar porcentagem de solvente mais fraco (H20).
	Fase normal - adicionar hexano, heptano, iso-octano.
	Adição de iso-propanol diminui k'.
	Usar padrões para checar posição e movimento dos picos durante o desenvolvimento;
	8. Eliminar caudas e melhorar k'
	Fase reversa:
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	A.1. Ácidos - supressão por adição de ácido acético (1-2%) ou adição de buffer (só quando fase móvel é > 50% água) para baixar pH. Adicionar reagente de íon-par tipo "A";
	A.2. Bases - Supressão da ionização por adição de NH4OH ou por 0,01 M (NH4)2HPO4 quando a fase tiver mais de 50% água.
	Adicionar reagente de íon-par tipo "B".
	Acima de pH 8, quanto maior o pH mais curta será a vida da coluna.
	9. Ajustar seletividade  mantendo constante a retenção k'.
	Fase normal - trocar componente mais polar.
	Fase reversa - trocar componente menos polar.
	Trocar sempre para um grupo químico bem diferente. 
	Trocar coluna.
	10. Melhorar eficiência - N
	Baixar fluxo;
	2. Trocar coluna:
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Irregular  esférico
			10µ  5µ
	Coluna curta  coluna comprida
	Uma coluna  duas colunas
	3. Reduzir concentração da amostra e/ou volume de injeção;
	4. Regular temperatura;
	5. Usar reciclagem:
	Uma coluna - k'  7
	Duas colunas - k'  3
	11. Se  for grande demais:
	 		1. Usar gradiente;
	2. Fazer pré-separação com extração, sep-pak, GPC.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	12. Amostras muito complexas (alimentos, produtos naturais, petróleo):
	1. Realizar pré-separação por extração, sep-pak;
	2. Fazer análise seqüencial.
		13 - 
	ÁcidosBasesR-COOHR-NH2-PO4 FosfatosR-NHR-O-SO3 SulfatosR-NR2-SO3 Sulfonados (Corantes)R-NR+3
	14. Troca iônica - para separação de ácidos - coluna catiônica.
	Usar buffer aquoso de fosfato pH 2-6.
	Controlar k':
	A. Baixar pH diminui k';
	B. Aumentar pH aumenta k';
	C. Aumentar concentração de buffer diminui k';
	D. Aumentar temperatura diminui k';
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	E. Adicionar 5% metanol para eliminar cauda (adsorção);
	 Troca iônica - para separação de bases - coluna aniônica.
	 Usar buffer aquoso de fosfato  pH 7.
	A. Elevar pH diminui k';
	B. Elevar concentraçãode buffer diminui k';
	C. Elevar temperatura diminui k';
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	D. Acionar 5% metanol para eliminar cauda.
	15. Compostos anfotéricos:
	A. Coluna C18 com pic tipo "A" ou "B";
	B. Supressão por adição de 1% ácido acético ou fosfato de amônio.
	16. Se a amostra contiver componentes neutros e ácidos - 
	Usar C18, metanol-água + 1% ácido acético.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	17. Amostra contendo componentes neutros e básicos - 
	Usar C18, metanol-água + pic B 6-8.
	18. Amostra contendo componentes neutros, ácidos e básicos - 
	Usar C18, metanol-água + pic B 6-8.
	19. Separação por GPC:
	Se os componentes tiverem diferença de peso molecular  10% há boa possibilidade de separação por GPC.
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Para compostos de peso < 1000 deve usar uma ou duas colunas de Ultrastyragel 500 A. ou 100 A. 
	100 A.	- P.M.	50	- 300
	500 A.	- P.M.	500	- 1000
	Esta técnica é especialmente útil para a separação de um ou dois componentes ativos dos outros excipientes de peso mais alto, por exemplo: pomadas, xaropes, cremes, loções, extratos de plantas e tecidos.
	20. Sistemas de solventes:
	A. Fase normal - sílica
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	Normalmente começa o desenvolvimento da separação usando 
	100% de clorofórmio. Também pode usar DCM, acetato de etila, tolueno ou benzeno.
	Para aumentar k' adicionar:
	Hexano, heptano, iso-octano, cjclohexano;
	Para diminuir k' adicionar:
	Isopropanol (1-3%) , dioxano (3-6%) , THF (5-20%), etanol (1-3%)
Primeira parte – HPLC
Capítulo 7º
	B. Fase reversa - C18, CN, fenil, NH2
	Começar a separação usando 50-95% solventes abaixo, com água:
	1. Metanol - mais barato, boa transmitância até 210 nm;
	2. Acetonitrila - dá menos pressão de trabalho e mais eficiência (N), seletividade diferente ,mais caro
	3. Tetrahidrofurano (THF) - instável formando no ar peróxidos que absorvem luz ultra-violeta, usá­vel até aprox. 235 nm. Boa seletividade, poder de eluição alto.
	C. GPC - O solvente normalmente usado é THF. Pode usar também clorofórmio, tolueno, DCM, DMF, dependendo da solubilidade da amostra. Deve ser evitada a freqüente troca de solvente nas colunas de Styragel.
(
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2
1
1
2
2
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7
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R
K
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2
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1
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(
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(
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K
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N
V
C
C
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+
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4
.
0
5
.
0
 
Figura 5.3 
 
(
)
(
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m
s
S
S
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m
s
S
S
k
=
'
a
K
k
=
'
m
m
C
B
A
H
+
+
=
FASE REVERSA
(Etapa 8)
Otimizar condições
(Etapa 7) Mudar o tipo de
coluna para ciano ou fenil
(Etapa 6) Variar a
temperatura
(Etapa 5) Variar o pH
para melhora espaçamento
e/ou controlar valor de K
(Etapa 5a) Variar pH e concentração
reagente íon-par para
0,5<K<20
(Etapa 4) Trocar solvente
orgânico para acetonitrila
(Etapa 3) Ajustar %B
para K ideal
(Etapa 2a) Use
gradiente de eluição
(Etapa 2a) Variar pH para
0,5<K<20
(Etapa 2) Isocrático é possível ?
Estimar %B para próxima corrida
(Etapa 2a) Adicionar íon-par
para obter 0,5<K<20
(Etapa 1) Gradiente Inicial
5 - 100% MeOH
pH 2,5 C8 ou C18
40
,
0
ñ
D
G
R
t
t
40
,
0
á
D
G
R
t
t