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Disciplina Bioquímica (PPGBAA) 16º estudo dirigido: Biossíntese de proteínas 1) Como que a sequência de nucleotídeos presente no mRNA é traduzida em uma sequência de aminoácidos (proteína)? A tradução de uma sequencia de nucleotídeos presente no mRNA em uma sequencia de aminoácidos (proteína) ocorre em cinco estágios. No primeiro estágio ocorre a ativação de aminoácidos através da ligação a um RNAt. Cada um dos 20 aminoácidos é covalentemente ligado a um RNAt específico, às custas da energia do ATP, utilizando enzimas ativadoras, conhecidas como aminoacil-RNAt-sintetases. No segundo estágio chamado de iniciação o RNAm se liga à subunidade menor do ribossomo e ao aminoacil-RNAt iniciador. O aminoacil-RNAt iniciador estabelece um pareamento de bases com códon AUG do RNAm, que sinaliza o começo do polipeptídeo. No terceiro estágio chamado de alongamento o polipeptídeo nascente é alongado pela adição de unidades sucessivas de aminoácidos, as quais são ligados covalentemente após serem levadas até o ribossomo e posicionado corretamente pelo respectivo RNAt, o qual, por sua vez, realiza um pareamento de bases com o códon correspondente do RNAm. No quarto estágio que corresponde a terminação e reciclagem do ribossomo a conclusão da cadeia polipeptídica é sinalizada por um códon de terminação no RNAm. O novo polipeptídeo é liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas denominadas fatores de liberação, e o ribossomo é reciclado para um novo ciclo de síntese. No quinto e ultimo estágio ocorre o dobramento e processamento pós-traducional. Antes ou depois de dobrar-se, o novo polipeptídeo pode sofrer processamento enzimático, incluindo remoção de um ou mais aminoácidos (geralmente da extremidade aminoterminal); adição de grupamentos acetil, fosforil, metil, carboxila, ou outros grupos a certos resíduos de aminoácidos; clivagem proteolítica, e/ou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos. Logo, esse processamento enzimático e necessário para que o polipeptídeo possa atingir sua forma biologicamente ativa (proteína). 2) Onde ocorre a tradução da sequência do mRNA em uma sequência de aminoácidos? O processo de tradução da sequência do mRNA em uma sequência de aminoácidos ocorre no citoplasma (citosol) da célula, especificamente nos ribossomos acoplados ao retículo endoplasmático rugoso ou nos ribossomos livres no citisol. Os ribossomos são macromoléculas que reúnem os aminoácidos para formar a proteína cuja sequência é codificada em um mRNA específico; sendo também compostos de vários tipos de rRNA de proteínas diferentes. Como função geral, podem ser usados para traduzir os mRNA de qualquer gene codificante de proteínas. 3) Explique a hipótese do adaptador proposta por Crick. Crick começou a questionar a premissa básica que um modelo de ácido nucléico contivesse cavidades específicas e complementares, em forma e carga, às cadeias laterais dos aminoácidos. Ele argumentava que partes específicas das bases nitrogenadas precisariam realizar pontes de hidrogênio e nem todas seriam capazes de formar cavidades que pudessem atrair as cadeias hidrofóbicas de aminoácidos como valina, leucina ou isoleucina. Igualmente estranho era imaginar uma base estrutural para os códigos degenerados nos quais muitos grupos laterais de aminoácidos fossem especificados por mais de um grupo de tripletes. Em vista de tais obstáculos que Crick considerou insuperáveis, ele fez uma proposta radical sugerindo que, antes da ligação peptídica, os aminoácidos seriam enzimaticamente ligados a pequenas moléculas “adaptadoras” que teriam superfícies especificamente desenhadas para ligar tripletes de ácidos nucléicos. Crick sugeria neste trabalho que tais adaptadores poderiam ser pequenos polinucleotídeos que fariam pareamentos de base com os moldes de RNA. Essa hipótese de Crick foi então denominada de hipótese do adaptador. 4) O que é o código genético? A sequencia específica de aminoácidos de uma proteína é construída ao longo ao longo da tradução da informação contida no RNAm. Esse processo é realizado ribossomos. Os aminoácidos são especificados pelos códons de RNAm, os quais consistem em tripletes (trincas) de nucleotídeos. A tradução requer moléculas adaptadoras, os RNAts, que reconhecem os códons e inserem os aminoácidos de maneira sequencial apropriada no polipeptídeo. As sequências das bases dos códons foram deduzidas a partir de experimentos empregando RNAms sintéticos de composição e sequências conhecidas. O códon AUG sinalizam o início da tradução. Os tripletes UAA, UAG e UGA sinalizam a terminação. O código genético padrão é universal e degenerado, onde possui múltiplos códons para a maioria dos aminoácidos e em todas as espécies existem pequenas alterações nas mitocôndrias e em alguns organismos unicelulares. 5) Diferencie e exemplifique código genético sobreposto e não sobreposto? Um códon é um triplete de nucleotídeo que codifica um aminoácido específico. O primeiro códon da sequência estabelece o quadro de leitura, onde cada três resíduos de nucleotídeos temos um novo códon e consequentemente temos um novo aminoácido específico. Em um código não sobreposto, os códons não compartilham nucleotídeos, o que possibilita uma maior flexibilidade para as sequências de códons consecutivos e conseqüentemente uma maior possibilidade de aminoácidos designados pelo código. Para um código sobreposto alguns nucleotídeos do mRNA ao compartilhados pelos diferentes códons, como conseqüência o códon sucessivo tem sua sequência limitada, devido um nucleotídeo do códon anterior ser compartilhado por três códons. Código A U A C G A G U C - - - - Não superposto 1 2 3 Código A U A C G A G U C Sobreposto 1 U A C 2 A C G 3 6) Apresente dez nucleotídeos e mostre as fases três de leitura do código genético. Quadro de leitura 1. G U A G C C U A C U Quadro de leitura 2. G U A G C C U A C U Quadro de leitura 3. G U A G C C U A C U 7) Quais são as propriedades do código genético? Explique detalhadamente cada uma. 1- A unidade do código genético é uma trinca: Formada por uma trinca de nucleotídeos no qual cada trinca forma um códon, que é a unidade básica do código genético. 2- O código genético tem códon de iniciação: O códon AUG sinaliza para o início da tradução; esta sequência identifica que a partir deste ponto começa a tradução de um aminoácido e tradução de uma cadeia polipeptídica, consequentemente origina uma proteína. A sequência AUG é o códon mais comum em todas as células. 3- O código genético não é sobreposto: Não há o compartilhamento das bases entre as trincas, sendo que cada trinca codifica um aminoácido, ou seja, nucleotídeos únicos ocupam posições em vários códons e uma proteína é traduzida lendo sequencialmente os nucleotídeos em grupos de três. 4- O código genético não tem vírgula: Não é necessária qualquer pontuação ou sinal para indicar o final de um códon e o começo do próximo. 5- O código genético é degenerado: Há múltiplos códons para a maioria dos aminoácidos, ou seja, um aminoácido pode ser codificado por vários códons, com exceção da metionina e do triptofano. Esta versatilidade de códons para formar um aminoácido ameniza o efeito das mutações caso haja alguma alteração em um nucleotídeo da trinca. 6- O código genético não é ambíguo: Um mesmo códon não pode codificar mais de um aminoácido. 7- O código genético é universal: São 64 códons que compõem o dicionário do código genético, ou seja, há um padrãopara todas as espécies e pequenas alterações nas mitocôndrias e alguns organismos unicelulares. 8- O código genético tem códons de terminação: Apresenta uma sequência de nucleotídeos de parada que indica o momento da terminação da tradução dos aminoácidos. Os códons de parada são: UAA, UAG e UGA. 8) Por que os aminoácidos metionina e triptofano apresentam cada um somente um códon? Metionina e triptofano apresentam cada um somente um códon, porque esses aminoácidos possuem códons que desempenha as funções de iniciação e terminação, respectivamente, na tradução. O códon AUG tem função dupla, pois codifica o aminoácido metionina (Met) nas posições internas dos polipeptídeos e também atua como o sinal mais comum para o início ou códon de iniciação de um polipeptídeos em todas as células tanto em procariotos como em eucariotos. Quanto ao triptofano (Trp) ele se associa ao códon de terminação (UGA) que especifica o Trp. O tRNATrp reconhece e insere um resíduo Trp tanto para o códon UGA como para o códon normal do Trp (UGG). Desse modo, entende-se que se estes códons AUG e UGG referentes aos aminoácidos Met e Trp, respectivamente, não fossem únicos para executarem a função de iniciação (Met) e finalização (Trp) quando associado ao códon sinalizador de terminação (UGA), ocorreria que a qualquer momento da tradução esta poderia se iniciar ou terminar de acordo com o aparecimento de códons sinônimos aos de Met e Trp, respectivamente na molécula de mRNA. Outro fato que justifica os aminoácidos Met e Trp apresenta cada um somente um códon está baseado nas hipóteses de oscilação proposta por Crik, a qual diz que aminoácidos codificados por apenas um códon deve-se ao fato de que a primeira base do anticódon (lido na direção 5’→3’; pareia com a terceira base do códon) determinar o número de códons reconhecidos pelo tRNA. Quando a primeira base do anticódon for C ou A, o pareamento de bases é específico e apenas um códon é reconhecido pelo tRNA como é o caso destes dois aminoácidos cuja primeira base do anticódon (5’→3’) é C a qual se pareia G na terceira base do códon (5’→3’). 9) Por que os aminoácidos arginina, leucina e serina apresentam cada um seis códons? A justificativa para que os aminoácidos arginina, leucina e serina apresentam cada um seis códons pode ser fundamentada no fato de que a degeneração possibilita a amenização dos efeitos das mutações, ou seja, caso haja uma alteração, não necessariamente ela resultará em alterações nos aminoácidos, mas sim apenas em suas sequências, já que versatilidade de códons: Arginina (Arg): CGU, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG; Leucina (Leu): UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e CUG; Serina (Ser): UCU, UCC, UCA, UCG, AGU e AGC. Outra justificativa para a degeneração dos aminoácidos Arg, Leu e Ser, baseia-se nas hipóteses de oscilação proposta por Crik, quando a base inosina (I) for o primeiro nucleotídeo (oscilante) de um anticódon (lido na direção 5’→3’) que vai se parear com a terceira posição do códon , três códons diferentes podem ser reconhecidos – o número máximo de qualquer tRNA. Para códons em que ocorre degeneração total na terceira posição, são necessários, pelo menos dois tRNA diferentes para cada aminoácido como é o caso da Arg, Leu e Ser. Tomando a Ser como exemplo, esta é codificada por seis códons, mas existe apenas três diferentes tRNA, ou seja, tRNASer1 (anticódon AGG), que se liga aos códons UCU e UCC; tRNASer2 (anticódon AGU), que se liga aos códons UCA e UCG; e tRNASer3 (anticódon UCG) que se liga aos códons AGU e AGC. Outra possibilidade para que, estes aminoácidos sejam codificados por um número máximo de códons pode estar relacionado à presença maciça desses aminoácidos na célula, portanto como são mais requeridos, é estratégico do ponto de vista biológico, apresentarem diferentes caminhos de codificação. 10) Desenhe um mRNA (5’-3’) e um tRNA (3’-5’) e mostre como ocorre o pareamento códon-anticódon. Os RNAs transportadores pareiam com códons do mRNA em uma sequência de três nucleotídeos denominada de anticódon. A primeira base do códon se no mRNA, que é lido na direção 5’ para 3’, pareia com a terceira base do anticódon. Ou seja, o alinhamento entre os dois RNAs é antiparalelo, onde o tRNA é apresenta a configuração tradicional de folha-de-trevo. No entanto, três pareamentos diferentes são possíveis quando o anticódon do tRNA contém inosinato. 11) Quais são as características dos tRNAs? Os tRNAs são moléculas responsáveis por levar o aminoácido correto para o mRNA no processo de tradução. São os adaptadores de códon de três nucleotídeos no mRNA ao aminoácido correspondente, que é levado pelo tRNA ao robossomo no processo de tradução. Os tRNA são componentes gerais da maquinaria de tradução; uma molécula de tRNA pode levar um aminoácido ao ribossomo para a finalidade de traduzir qualquer mRNA. A molécula unifilamentar de tRNA tem uma forma de trevo consistindo em quatro hastes de dupla hélice e três alças unifilamentares. A alça do meio de cada tRNA é chamada de alça anticódon porque leva uma trinca de nucleotídeos chamada de anticódon. 12) Quais são as fases envolvidas na síntese de proteínas? Comente detalhadamente sobre cada uma. As fases envolvidas na síntese de proteínas consistem em: 1. Ativação dos aminoácidos: para que um polipeptídeo seja sintetizado é necessário que o grupo carboxila de cada aminoácido seja ativado para facilitar a formação de uma ligação peptídica, e um elo deve ser estabelecido entre cada novo aminoácido e a informação no mRNA que o codifica. Ambos os requerimentos são alcançados pela ligação do aminoácido a um tRNA na primeira etapa da síntese de proteínas; 2. Iniciação: o mRNA que possui o código para o polipeptídio a ser sintetizado se liga a menor das duas subunidades ribossômicas e ao aminoacil-tRNA de iniciação. Logo após se liga a subunidade ribossômica maior para formar um complexo de iniciação. O aminoacil-RNAt de iniciação pareia com o códon AUG do RNAm que sinaliza o inicio da síntese. Esse processo é promovido por proteínas chamadas de fatores de iniciação; 3. Alongamento: o polipeptídio nascente é aumentado por ligações covalentes de unidades sucessivas de aminoácidos, cada uma levada ao ribossomo e corretamente posicionada pelo seu tRNA (anti-códons), que pareia com seu códon correspondente no mRNA. O alongamento requer proteínas chamadas de fatores de alongamento; 4. Terminação e reciclagem dos ribossomos: o término da cadeia de polipeptídios é sinalizado por um códon de terminação no mRNA. O novo peptídeo é liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas chamadas de fatores de liberação. Esses ribossomos são novamente utilizados pelo processo de síntese; 5. Dobramento e processamento pós traducional: com a finalidade de alcançar sua forma biologicamente ativa, o novo polipeptídeo se enovela em sua conformação tridimensional apropriada, para a especificação da proteína formada ao final do processo síntese. 13) Por que é importante a ativação dos aminoácidos? A ativação dos aminoácidos é suam importância para que ocorram todas as etapas de tradução, em que as proteínas são formadas através de ligações peptídicas, ou seja, ligação do grupo carbonil de um aminoácido com o grupo amina de outro, através da condensação com a perda de uma molécula de água), de modo que a ativação do aminoácido o aminoácido se dá através da ligação ao tRNA pela enzima aminoacil- tRNA-sintase formando um complexo aminoacil-tRNA. 14) Faça um resumo explicando como ocorre a tradução da molécula de mRNA. A tradução da molécula de mRNA tem início após a formação do aminoacil-tRNA iniciante, ou seja, um tRNA específico covalentemente ligado a um aminoácido que foi ativado no citosolpela enzima aminoacil-RNAt-sintetase especifica para catalise. Em seguida tem-se o estágio de início o qual se caracteriza por aproximar as moléculas de mRNA e tRNA carregando o primeiro aminoácido (metionina -Met) do polipeptídeo que será sintetizado, bem como as duas subunidades do ribossomo. A subunidade ribossômica menor reconhece uma sequência específica de nucleotídeos, chamada de sítio de ligação, e liga-se a ele o qual está localizado upstream do códon de iniciação da molécula de mRNA. O tRNA iniciador, com o anticódon UAC, pareia com o códon de iniciação, AUG, logo o tRNA transporta a Met como primeiro aminoácido da cadeia polipeptídica. A ligação da subunidade maior completa o complexo de iniciação e proteínas chamadas de fatores de iniciação são necessárias para a união de todos os componentes de tradução. GTP fornece a energia para formação do complexo através. Com o complexo todo formado o alongamento da cadeia polipeptídica nascente ocorre pela adição de unidades sucessivas de aminoácidos que são ligados covalentemente ao tRNA especifico realizando um pareamento de bases com o códon correspondente no mRNA. O alongamento requer proteínas citosólicas chamadas de fatores de alongamento. A ligação de cada aminoacil-tRNA que entra e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA são facilitados pela hidrólise de GTP. A conclusão da cadeia de polipeptídios é sinalizado por um códon de terminação no mRNA. O novo polipeptídeo é liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas denominadas fatores de liberação, e o ribossomo é reciclado para um novo ciclo de síntese. Para que o novo polipeptídeo possa atingir sua forma biologicamente ativa, ele precisa dobrar-se em sua conformação tridimensional apropriada. Antes ou depois de seu dobramento, o polipeptídeo pode sofrer processamento enzimático, incluindo a remoção de um ou mais aminoácidos; adição de grupamentos acetil, fosforil, metil, carboxil, ou outros grupos a certos resíduos de aminoácidos; clivagem proteolítica, e/ou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos. 15) Por que em procariotos ocorre o acoplamento da transcrição e da tradução? O acoplamento da transcrição e da tradução ocorre, porque o RNAm não precisa ser transportado de um núcleo para o citoplasma antes de encontrar os ribossomos. Os procariotos não possuem núcleo, portanto o seu DNA encontra-se no mesmo ambiente citosólico dos ribossomos e de outras estruturas envolvidas na síntese de proteínas. Desse modo, a ausência de segregação do núcleo para o citoplasma, como ocorre com eucariotos, permite que a tradução do mRNA comece enquanto a transcrição ainda está em progresso, e a proteína recém-sintetizada pode difundir-se rapidamente até o local de funcionamento. Outra justificativa que reforça o acoplamento da transcrição e da tradução em organismos procariotos se da ao fato que neste não ocorre o processamento do mRNA, uma vez que possuem uma estrutura gênica mais simples sendo este constituído, basicamente, de uma região codificadora e por uma região reguladora. Seu genoma mínimo e ausente de membrana nuclear, proporciona a produção do mRNA procarioto relativamente direta com a transcrição, tradução e degradação dos transcritos de mRNA codificantes de proteínas frequentemente ocorrendo de forma simultânea. Estes organismos não apresentam os íntrons (regiões não codificadas) em sua estrutura gênica. O gene de um procarioto apresenta em sua região transcrita apenas os éxons que são as regiões codificadas. Desse modo, não há a transcrição primeiramente de um pré-RNA como transcrito primário para que depois seja processado à mRNA través de splicing. Sendo assim, o que ocorre é logo a transcrição do mRNA destes organismos o qual encontra-se pronto para ser traduzido. 16) Quais são os agentes químicos que inibem a síntese protéica? Entre os agentes químicos que inibem a síntese protéica, estão a puromicina que tem como céluas-alvo tanto eucariotos como procariotos e provoca a interrupção de ligações peptídicas (produzida pelo fungo Streptomyces alboniger), acarretando no dobramento incorreto da proteína afetando diretamente a realização de sua função; as tetraciclinas inibem a ligação do aminoacil-tRNA ao sítio A do ribossomo; o clorafenicol e a cicloeximida que inibem a atividade da peptidil transferase; e a estreptomicina inibe a iniciação da síntese proteica e provoca erro na leitura do mRNA. 17) O que é um polissomo? Qual é a vantagem conferida pelos polissomos durante a síntese protéica? O polissomo é um conjunto de ribossomos que se ligam simultaneamente a mesma fita de mRNA. Eles são grandes conjuntos de 10 a 100 ribossomos muito ativos na síntese proteica, podem ser isolados de células eucarióticas e bacterianas. Micrografias eletrônicas mostram a presença de uma fibra entre ribossomos adjacentes em um conjunto (polissomo). Sua vantagem está relacionada com o gasto energético e o tempo de síntese de proteínas, pois como vários ribossomos são acoplados em um mesmo momento o tempo dessa síntese é menor acarretando eficiência a certos estímulos internos e externos a célula. Além disso a célula não gastaria muita energia para a síntese de proteínas. 18) Compare a tradução em procariotos e em eucariotos e comente sobre as semelhanças e diferenças. Os procariotos não possuem membrana nuclear individualizando o núcleo, portanto o seu DNA encontra-se no mesmo ambiente citosólico dos ribossomos e de outras estruturas envolvidas na síntese de proteínas. Desse modo, a ausência de segregação do núcleo para o citoplasma, como ocorre com eucariotos, permite que a tradução do mRNA comece enquanto a transcrição ainda está em progresso, e a proteína recém- sintetizada pode difundir-se rapidamente até o local de funcionamento. Em eucariontes, a tradução ocorre separadamente da transcrição, pois uma fita de pré-mRNA (RNA nuclear heterogênio ou hnRNA) é sintetizada no núcleo. Este hnRNA passará primeiramente por um processamento no qual será adicionado em sua extremidade 5’ um quepe e em sua outra extremidade 3’ uma cauda poliadenilada (cauda poli A), em seguida são removidas as sequências não codificadas, os íntrons, que são sequências intevenientes entre as sequências codificadas, os éxons. Só então o mRNA está maduro para sair do núcleo através de poros da membrana nuclear. As semelhanças ocorrem a partir deste momento, quando o mRNA em eucariontes encontra-se no citoplasma, uma vez que o transcrito de mRNA em procariotos já encontrava-se neste ambiente citosólico. No citoplasma, a subunidade menor de um ribossomo (ou vários ribossomos caracterizando um polissomo) chamada de 30S se encaixa nessa fita, e percorre até encontrar o códon de iniciação (AUG), onde então é fixado o primeiro aminoácido, a metionina, (trazido pelo tRNA), a subunidade maior se encaixa à subunidade menor do ribossomo e o complexo está formado. Em seguida, o ribossomo percorre a fita de mRNA fixando os aminoácidos correspondentes aos respectivos códons (trinca de bases nitrogenadas do RNA), e são formadas ligações peptídicas entre os aminoácidos fixados formando assim a cadeia polipeptídica. Quando o ribossomo encontra o códon de parada do mRNA (UAG, UAA e UGA) haverá a sinalização para que o polipeptídeo se desprenda do ribossomo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 4a ed. Porto Alegre, Editora Artes Médicas, 2004. GRIFFITHS, A.J.F.; MILLER, J.H.; SUZUKI, D.T.; LEWONTIN, R.C.; GELBART, W.M.; WESSLER, S.R. Introdução à Genética. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 9ª ed., 2010. LEHNINGER, A. L.. Princípios de Bioquímica. 5. ed. Porto Alegre: Savier, 1273 p. 2011. GEOFFREY M. COOPER, ROBERT E. HAUSMAN. A Célula: uma abordagem molecular. 2ª ed. Artmed, 2005. JUNQUEIRA,L.C.U.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan, 2005.
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