AMINOÁCIDOS; HEMOGLOBINA; PURIFICAÇAO

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· AULA 3: AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
 
DEFINIÇÃO
As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas. Todas as proteínas são construídas com o conjunto de 20 aminoácidos ligados covalentemente.
FUNÇÕES:
- enzimas: catalisadores biológicos 
-organização do material genético 
- transporte de nutrientes e gases: hemoglobina, lipoproteínas 
- hormônios 
- anticorpos 
- estrutura dos tecidos 
- movimentos celulares
ESTRUTURAS DOS AMINOÁCIDOS
-Aminoácidos são monômeros que se polimerizam formando as proteínas
 
ESTEREOISOMERISMO EM AMINOÁCIDOS
CLASSIFICAÇÃO DOS AMINOACIDOS:
 Os aminoácidos são classificados de acordo com a polaridade do grupo R: 
- Apolares (grupo R hidrofóbico): não interagem com a água 
- Polares (grupo R hidrofílico): interagem com a água
 Básicos: carga positiva na cadeia lateral ácidos: carga negativa na cadeia lateral neutros: não-carregados 
 Ácidos: carga negativa na cadeia lateral neutros: não-carregados
 Neutros: não-carregados
ESTRUTURA E CLASSIFICAÇÃO DOS AMINOACIDOS
AMINOACIDOS PODEM AGIR COMO ACIDOS E BASES
IONIZAÇÃO DOS AMINOACIDOS
 -A carga elétrica dos aminoácidos varia com o pH. 
(a) Em soluções muito ácidas os dois grupos ionizáveis apresentam-se protonados
(b) Em soluções próximas da neutralidade, o aa apresenta-se como íon dipolar
(c) Em pH muito alcalino, ambos apresentam-se desprotonados
 VALORES DE pKa DOS AMINOACIDOS
TITULAÇÃO DO AMINOACIDO
COMO CALCULAR O PL DE AA POLARES COM CARGA
POLÍMEROS DE AMINOACIDOS: PEPTÍDEOS E PROTEINAS
 
ESTRUTURA DAS PROTEINAS
 -Quatro níveis:
-Estrutura primária: sequência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica. 
-Estrutura secundária: estruturas regulares tridimensionais formadas por segmentos da cadeia polipeptídica. 
-Estrutura terciária: dobramento da cadeia polipeptídica assumindo uma forma espacial própria (define sua função biológica). 
-Estrutura quaternária: união de duas ou mais cadeias polipeptídicas, formando assim dímeros, trímeros, etc. 
Estrutura Primária
Estrutura Secundária α-hélice
-A a-hélice é mantida por pontes de hidrogênio entre uma unidade peptídica e a quarta unidade peptídica subsequente 
-Estas pontes de hidrogênio dispõem-se paralelamente ao eixo da hélice. 
-As cadeias laterais dos aminoácidos estão projetadas para fora da hélice. 
 Estrutura Secundária Folha β-pregueda
-A folha β-pregueada é mantida por pontes de hidrogênio entre cadeias peptídicas diferentes ou entre segmentos distantes de uma mesma cadeia. 
- Estas pontes de hidrogênio dispõem-se lado alado, perpendiculares ao eixo das cadeias. 
-As cadeias laterais dos aminoácidos estão projetadas para cima e para baixo do plano da folha pregueada. 
Príon
Estrutura Terciária
 Ponte Dissulfeto
 
 
Estrutura Quaternária
 
 
CLASSIFICAÇÃO DE PORTEINAS
-Globulares: cadeias polipeptídicas organizadas de forma esférica ou globular. São geralmente solúveis. 
-Fibrosas: cadeias polipeptídicas de forma alongada. São geralmente insolúveis. 
ALTERAÇOES ESTRUTURAIS DAS PROTEINAS
A desnaturação de proteínas (destruição da conformação nativa) acarreta a perda de sua estrutura original. Formas de desnaturar uma proteína: 
- Aquecimento da proteína 
- Tratamento com ácidos e álcalis fortes 
- Adição de solventes orgânicos polares 
- Adição de compostos com grande capacidade de formar pontes de H (uréia) 
- Adição de detergentes ou sabões
· AULA 4: Hemoglobina – Transporte de Oxigênio e Tamponamento do Plasma
MIOGLOBINA
-É uma hemeproteína que está presente nos músculos esqueléticos e coração 
-Contém 8 α-hélices (A-H)
-Funciona tanto como um reservatório, quanto carregador de oxigênio 
 
HEMOGLOBINA
-Proteína globular, de estrutura quaternária, encontrada nos eritrócitos, que contém 4 cadeias polipeptídicas (cadeias de globina) e um grupo heme ligado a cada uma das cadeias de globina.
FUNÇAO DA HEMOGLOBINA
- Transportar O2 dos pulmões para os tecidos
- Transportar CO2 dos tecidos para os pulmões
LIGAÇÃO DO OXIGENIO AO FERRO
ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DA DESOXI-Hb E OXI-Hb
CURVA DE SATURÇÃO COM OXIGENIO
Fatores que reduzem a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio:
-Aumento de temperatura (ex.: febre);
-Presença de 2,3-bisfosfoglicerato (BPG);
-Diminuição do pH (efeito Bohr);
-Aumento da pressão parcial de CO2 (p CO2).
 
Estrutura e ligação do 2,3-bisfosfoglicerato (BPG)
Efeito do BPG sobre a afinidade da hemoglobina por oxigênio 
Efeito Bohr – Efeito do pH sobre a saturação da hemoglobina com oxigênio) 
MANUTENÇÃO DO Ph PLASMATICO
Nos tecidos, o CO2 produzido pelo metabolismo celular difunde-se até as hemácias, onde é hidratado rapidamente em uma reação catalisada pela anidrase carbônica, formando H2CO3 . No pH do sangue (7,4), o H2CO3 dissocia-se em HCO3- e H+.
Nos pulmões a alta pO2 leva à oxigenação da hemoglobina e à dissociação de H+ . O HCO3- desloca-se do plasma para o interior das hemácias e combina-se com H+ , formando H2CO3, que é convertido em CO2 e H2O pela anidrase carbônica. O CO2 difunde-se das hemácias para o plasma, depois para os alvéolos pulmonares e é expirado.
HEMOGLOBINA FETAL Hb F
-O feto humano e de outros mamíferos, produz uma hemoglobina diferente da HbA. Ao invés da cadeia beta, o feto produz a cadeia gama, que se associa a cadeia alfa formando a hemoglobina fetal.
-A HbF tem maior afinidade por oxigênio do que a HbA da mãe, permitindo assim que o oxigênio seja transferida de mãe para filho.
-As cadeias beta e gama da hemoglobina têm o mesmo número de aminoácidos, porém a cadeia gama tem uma serina ao invés de uma histidina na posição 143. Esta histidina é importante para ligação ao BPG.
-Assim, a HbF não liga a BPG com a mesma afinidade, aumentando a ligação de oxigênio.
ANEMIA FALCIFORME
 
 
PURIFICAÇAO DE PROTEINAS
 ESTRATEGIA GERAL
1- Seleção da fonte de onde pretende-se extrair a proteína (tecido, órgão ou células isoladas como hemácias, bactérias e leveduras) 
2- Solubilização da proteína 
3- Estabilização da proteína 
4- Detecção da proteína
COMO OBTEMOS PROTEINAS DAS CELULAS?
Propriedades usadas na purificação de proteínas através de cromatografia líquida
Propriedades exploradas:
-Tamanho 
-Carga iônica 
-Afinidade química (especificidade)
CROMATOFRAGIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHO OU FILTRAÇÃO EM GEL
DIÁLISE
O saco de diálise contendo a mistura de proteína (azul) e moléculas pequenas (vermelhas) é imerso em um volume grande de solução tampão (a). Como a membrana semipermeável permite a passagem apenas das moléculas pequenas, sua concentração dentro e fora do saco tende a se igualar (b). Após várias trocas de tampão (c), restam apenas as moléculas de proteína dentro do saco de diálise.
CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
Carga líquida: 
-Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis; 
-Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis. 
 pI (ponto isolétrico)= pH no qual o número total de cargas positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a proteína não tem carga líquida. 
Se o pH>pI, a carga líquida da proteína é negativa 
Se o pH<pI, a carga líquida da proteína é positiva 
EFICIÊNCIA DA PURIFICAÇAO
Atividade específica = Atividade total/Proteína total
ELETROFORESE EM PAPEL
 Uma mistura de três proteínas- A,B e C – é aplicada sobre uma tira de papel ou acetato de celulose, umedecida com rampão. A tira é colocada em um aparato apropriado e um campo elétrico é aplicado ao sistema (a). As proteínas migram de sua posição inicial (b) para os polos, de acordo com a carga que apresentam no pH do tampão utilizado. Depois de algum tempo, a eletroforese é interrompida e a posição das proteínas é revelada (c).
ELETROFORESE EM GEL
 
ELETROFORESE BIDIMENCIONAL
ESTUDO DIRIGIDO
1- Um bioquímicodescobre e purifica uma nova enzima, gerando a tabela de purificação a seguir: 
a) A partir da informação contida na tabela, calcule a atividade específica da enzima após cada procedimento de purificação. 
b) Qual dos procedimentos de purificação utilizados para essa enzima é mais eficaz? 
c) Qual dos procedimentos de purificação utilizados para essa enzima é menos efetivo? 
d) Há alguma indicação, com base nos resultados apresentados na tabela, de que a enzima está pura após a última etapa? O que mais poderia ser feito para estimar a pureza da preparação da enzima? 
2- Qual é a base para a separação de proteínas para as técnicas a seguir? 
 a) Cromatografia de filtração em gel. 
 b) Cromatografia por afinidade. 
 c) Cromatografia de troca iônica. 
3- Submeteu-se à eletroforese um pH 3,08 uma mistura composta de glutamato (pI 3,08), lisina (pI 10,54), leucina (pI 6,03), leucil-lisina (pI 6,03) e lisil-histidina (pI 9,8). Representar no esquema seguinte às posições relativas em que deveriam ser encontrados os aminoácidos e dipeptídeos ao final da eletroforese.
pI:
Glutamato - 3,08
Leucina - 6,03
Lisina - 10,54
Leucil-leucina - 6,03
Lisil-histidina - 9,8 
4- Desenvolva um experimento para purificar uma proteína X em uma coluna de troca aniônica. A proteína X tem pI 7,0.
5- Quatro amostras da solução de um aminoácido foram submetidas à eletroforese em diferentes valores de pH, com a mesma voltagem e durante o mesmo tempo. O esquema seguinte mostra a localização do aminoácido no início (linha pontilhada e ao final (círculos vermelhos) da eletroforese. Sabendo que o pI da alanina é 6,11; do aspartato é 2,94 e da lisina 10,54, responda: 
a) O aminoácido utilizado foi alanina, aspartato ou lisina? 
b) Fazer um esquema do resultado que seria obtido se o experimento houvesse sido feito com os outros dois aminoácidos.
6- A mobilidade eletroforética em pH 8,6 da hemoglobina normal e de hemoglobinas anormais (que diferem da hemoglobina normal pela substituição de um aminoácido) está representada a seguir:
Identificar a posição (A, B, C ou D) correspondente à hemoglobina que tem: 
- Valina em lugar do glutamato (HbS); 
- Aspartato em lugar de glicina (HbJ); 
- Glutamato em lugar de lisina (HbN); 
- Lisina em lugar de glutamato (HbC).