Aula 2 - Cromatografia em Papel

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Cromatografia Planar - Cromatografia em Papel
Curso Técnico em Química – IFFluminense campus Itaperuna
Cromatografia
Profª: Juliana Simões
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Cromatografia em Papel
Aperfeiçoada por Consden, Gordon e Martin em 1944.
É uma técnica simples;
Utiliza pequena quantidade de amostra;
Tem boa capacidade de resolução; 
Aplica-se, de preferência, na separação e identificação de compostos orgânicos (antibióticos hidrossolúveis, ácidos aorgânicos) e íons metálicos.
 
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Cromatografia em Papel
Método de separação
É classificada como cromatografia por partição, em razão de a fase estacionária e a fase móvel serem líquidas.
Esse mecanismo de separação pode ser explicado da seguinte maneira: a celulose é constituída por duas mil ou mais unidades de celulose anidra, ligadas por átomos de oxigênio; um líquido polar como a água tem grande afinidade com as hidroxilas de cada glicose, formando ligações de hidrogênio, ficando retido e funcionando como fase estacionária, e os líquidos menos polares (solventes orgânicos) são repelidos por essa estrutura e funcionam como fase móvel.
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Cromatografia em Papel
Tipos de Cromatografia em Papel
A forma mais simples de cromatografia em papel é a ascendente, que utiliza uma tira de papel de tamanho variável, em função da cuba que será utilizada. 
Cromatografia ascendente
Cromatografia descendente
Cromatografia 
circular
Cromatografia 
bidimensional
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Cromatografia em Papel
Cromatografia ascendente
Marca-se com um lápis o ponto de partida da amostra, a cerca de 2 cm de uma das bordas; marca-se também a linha de chegada da fase móvel (ou frente do solvente), geralmente a 10 cm do ponto de partida (irá depender do tamanho da cuba).
Se a tira de papel for estreita, apenas uma alíquota do padrão ou da amostra, será aplicada no centro do ponto de partida. Se houver a possibilidade de se aplicar mais de uma alíquota, deixa-se 2 cm de distância nas bordas laterais e um intervalo de 1,5 a 2 cm entre os pontos de aplicação.
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Cromatografia em Papel
Cromatografia ascendente
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Cromatografia em Papel
Cromatografia ascendente
Por capilaridade, a fase móvel se movimenta em fluxo ascendente , no início rapidamente, diminuindo de modo gradativo e podendo até parar por completo quando a força ascendente de capilaridade for neutralizada pela ação da gravidade.
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Cromatografia em Papel
Quando a fase móvel atingir a linha de chegada, retira-se o papel da cuba e seca-se, ao ar livre ou com secador de cabelos com ar quente ou frio até eliminar a parte móvel.
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Cromatografia em Papel
No caso de misturas de compostos coloridos, a cor se desdobrará em cores distintas em função do número de substâncias que a compõe. Já para misturas de substâncias incolores pode-se detectar (revelar) esses componentes por técnicas diversas. 
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Cromatografia em Papel
Definições e termos usados na Cromatografia em Papel
Cromatografia em papel (CP): método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, em função do deslocamento diferencial de solutos, arrastados por uma FM, sendo retidos seletivamente por uma FE líquida (normalmente água), retida no suporte (papel), na cromatografia com fase normal.
 Suporte: papel sobre o qual fica retida a fase estacionária (FE), água.
Fase móvel (FM): líquido ou mistura que fluem através do papel arrastando os solutos.
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Cromatografia em Papel
Definições e termos usados na Cromatografia em Papel
Câmara ou cuba cromatográfica: recipiente de vidro com tampa fechada hermeticamente, não deixando escapar vapores da FM e onde se coloca o papel cromatográfico.
Revelador ou agente cromogênico: agente físico (UV, p.e.) ou químico (p.e.: vapores de iodo) que tornam visíveis as substâncias separadas pela CP.
Resolução: distância mínima em que se encontram duas manchas sendo possível distingui-las individualmente.
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Cromatografia em Papel
Definições e termos usados na Cromatografia em Papel
Desenvolvimento: é o movimento diferencial dos componentes de uma amostra, ao serem deslocados pela FM. Pode ser ascendente, descendente, horizontal ou circular.
Aplicação: colocação da solução da amostra (mistura das substâncias) no ponto de partida sobre o papel cromatográfico.
Frente da FM: linha de chegada da FM, visível quando se retira o papel da cuba cromatográfica.
Distância percorrida: distância percorrida pela FM, desde o ponto de partida, até a linha de chegada ou a do componente.
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Cromatografia em Papel
Definições e termos usados na Cromatografia em Papel
Rf: fator de retardamento é o quociente entre a distâncias percorridas simultaneamente desde o ponto de partida, até o centro de maior concentração da mancha do soluto e até a frente da fase móvel.
Saturação da cuba: distribuição uniforme no interior da cuba da fase vapor da FM após alcançado o equilíbrio.
Cromatograma: papel com as substâncias separadas.
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Cromatografia em Papel
Considerações sobre a Cromatografia em Papel
Papel: tira retangular ou uma folha circular de papel que funciona 
como uma camada fina de celulose. A característica mais importante é a uniformidade de sua composição e de sua superfície.
O papel cromatográfico é uma variável muito importante para a técnica. Dependendo da amostra a ser analisada podem ser utilizadas as seguintes marcas:
Whatman;
Schleicher e Schull (S&S);
Macherey-Nagel.
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Cromatografia em Papel
Considerações sobre a Cromatografia em Papel
Fase móvel (FM): variável que possui maior efeito na separação dos componentes da mistura.
Para separar os componentes de uma mistura tem que se levar em consideração a natureza química das substâncias que devem ser separadas, assim como a viscosidade e a polaridade da fase móvel.
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Cromatografia em Papel
Considerações sobre a Cromatografia em Papel
Algumas FM ordenadas em função de suas polaridades.
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Cromatografia em Papel
Considerações sobre a Cromatografia em Papel
Efeitos da temperatura: promove a variação da viscosidade e solubilidade entre as substâncias e a FM e FE.
A temperatura ideal vai depender da amostra a ser analisada, tal como o papel e a FM que serão utilizados.
Temperaturas acima da ambiente melhora o tempo de análise, mas pode prejudicar a resolução.
Temperaturas abaixo da ambiente pode melhorar a resolução mas prejudicar o tempo de análise. 
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Cromatografia em Papel
Cromatografia Normal e de Fase Reversa
FASE NORMAL:
FE polar e FM menos polar ou apolar. O papel é tratado com a FE polar.
FE aquosa: o papel é saturado com vapor de água ou com vapor de água e outro solvente no interior de uma cuba cromatográfica, hermeticamente fechada, antes de iniciar-se o desenvolvimento cromatográfico.
FE não-aquosa: o papel é embebido em solução de acetona e dimetilformamida, por 10 a 15 minutos, e depois deixar secar.
Utilizada para separar substâncias hidrófilas.
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Cromatografia em Papel
Cromatografia Normal e de Fase Reversa
FASE REVERSA: 
FM polar e FE menos polar ou apolar. O papel é tratado com a FE apolar.
FE não-aquosa: o papel é tratado com substâncias hidrófobas (parafina líquida, óleo, silicone) dissolvidos em solventes orgânicos como éter de petróleo, hexano e benzeno.
Utilizada para separar substâncias hidrófobas.
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Cromatografia em Papel
Técnica da Cromatografia em Papel
AMOSTRA: a amostra a ser analisada deve ser dissolvida em um solvente volátil, empregando o menor volume possível.
• Éter etílico, clorofórmio, acetato de etila, acetona, etanol...
Quanto menor a quantidade de amostra aplicada maior a capacidade de resolução.
O volume de amostra aplicado deve dar uma mancha no papel de cerca de 0,5 cm de diâmetro máximo. 
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Cromatografia em Papel
Técnica da Cromatografia em Papel
APLICAÇÃO DA AMOSTRA: o volume de amostra a ser aplicado vai depender da sensibilidade da reação cromogênica empregada na 
revelação.
Como determinar a quantidade ideal?
Preparar solução padrão, quali e quantitativamente semelhantes a amostra. 
Aplicar no papel e desenvolver o cromatograma.
Revelar com o agentecromogênico.
Identificar a diluição mínima dos padrões com melhor sensibilidade à reação cromogênica. 
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Cromatografia em Papel
Técnica da Cromatografia em Papel
APLICAÇÃO DA AMOSTRA: Aplicar 1 µL por vez – manter o diâmetro da mancha em 0,5 cm.
Padrão A
Volume aplicado: 1µL de cada solução (ppm)
Padrão B
Padrões A e B sensíveis à reação cromogênica a partir de 
concentrações diferentes da solução. 
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Cromatografia em Papel
Técnica da Cromatografia em Papel
MÉTODOS DE DETECÇÃO: normalmente as substâncias separadas são incolores ou invisíveis à luz ordinária.
Como visualizar a separação?
Métodos químicos: a solução reveladora é borrifada sobre o papel, agentes cromogênicos.
Métodos físicos: o papel quando tratado com solução de fluoresceína, frequentemente, destaca as manchas tornando-as amarelo-esverdeadas, brancas ou azuis. Usar lâmpada UV.
Métodos biológicos e enzimáticos: para localizar antibióticos, pela inibição do crescimento de certos microorganismos ou para localizar enzimas ou seus substratos.
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Cromatografia em Papel
Análise Qualitativa
A cromatografia em papel é uma técnica muito útil para a separação de componentes de uma mistura e realização de sua análise qualitativa em função dos Rf (fatores de retardamento) e das cores apresentadas.
Cromatograma dos extratos de pimentões amarelos (1), verdes (2) e vermelhos (3).
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Cromatografia em Papel
Análise Qualitativa
Na prática, a distância percorrida pelo soluto em um determinado tempo é medida desde o ponto de aplicação até o centro da mancha. E a distância percorrida pela fase móvel é medida desde o ponto de partida até o ponto extremo atingido por ela (linha de chegada).
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Cromatografia em Papel
Análise Qualitativa
O Rf é característico de uma determinada substância, desde que se observem as características do papel, a qualidade e a quantidade de fase móvel, a temperatura, o volume e a concentração da substância aplicada.
Devido a essas variáveis, é aconselhável trabalhar com padrão e amostra de forma mais semelhante possível, realizando a análise de ambos nas mesmas condições, evitando, dessa maneira, os erros de análise devidos ao papel, a fase móvel, a temperatura, etc.
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Cromatografia em Papel
Análise Quantitativa
Realizar análise qualitativa e na sequência selecionar um sistema de FM que separe perfeitamente as substâncias.
Diretamente sobre o papel: após o cromatograma ser revelado.
Comparação de intensidade das cores reveladas: variando as concentrações dos padrões e amostras (Erro +/- 20%).
- Área da mancha: cortar a área da manha e pesar. Construir um gráfico dos log das quantidades da substância presente na mancha.
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Cromatografia em Papel
Análise Quantitativa
Extração da substância: após o cromatograma ser revelado.
Extrai o derivado colorido do papel e faz a leitura em espectrofotômetro. A quantificação se dá a partir da comparação com a curva analítica da mesma substância.
- Extrair e quantificar por métodos analíticos (Espectrofotometria, microtitulação, microgravimetria...).
Cromatografia Planar - Cromatografia em Camada Fina ou Delgada (CCF ou CCD)
Curso Técnico em Química – IFFluminense campus Itaperuna
Cromatografia
Profª: Camila Nunes
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Cromatografia em Camada Delgada
A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada (fina) de adsorvente retido sobre uma superfície plana.
Sua aplicação inicial, em 1938, se deu como ferramenta analítica em química e bioquímica, e somente em 1960 passou a ser largamente utilizada em análises de substâncias orgânicas e organometálicas.
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Cromatografia em Camada Delgada
Vantagens oferecidas pela CCD:
Fácil compreensão e execução;
Separações em breve espaço de tempo;
Versatilidade;
Grande reprodutibilidade; 
Baixo custo. 
Pode ser de aplicação analítica ou preparativa, cuja escala está na dependência da espessura da camada adsorvente e na quantidade da amostra a ser analisada.
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Cromatografia em Camada Delgada
Mecanismo de Separação:
O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno da adsorção. Entretanto, usando-se fases estacionárias tratadas, pode ocorrer também por partição ou troca iônica, o que permite seu emprego tanto na separação de substâncias hidrofóbicas como hidrofílicas.
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Existe uma grande variedade de adsorventes para fins cromatográficos que podem ser adquiridos para a confecção de placas no próprio laboratório ou como placas pré-fabricadas, onde esses adsorventes são espalhados em camadas de diferentes espessuras.
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Sílica (SiO2)
Ácido silício amorfo, altamente poroso, é seguramente um dos adsorventes mais utilizados em cromatografia por adsorção. Apresenta caráter fracamente ácido. 
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Sílica (SiO2)
Existem vários tipos de sílica no comércio, de acordo com as características adicionais de cada produto:
Sílica com ou sem aglutinantes – para reter o adsorvente sobre a placa;
Sílica com substâncias flourescentes – indicada para análises de substâncias que possam sofrer excitação em determinado comprimento de onda;
Sílica ultrapura – sem aditivos.
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Sílica (SiO2)
Utilização: Separação por adsorção de compostos lipofílicos, como:
Aldeídos;
Cetonas;
Fenóis;
Ácidos graxos;
Aminoácidos;
Alcalóides;
Terpenóides;
Esteróides.
Quando a sílica for propositalmente desativada com vapor de água, retém água suficientes para que a separação se dê como na cromatografia em papel (partição).
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Alumina (Al2O3)
Depois da sílica, é o adsorvente mais utilizado. Tem características alcalinas, embora possa ser preparada também com características neutra ou ácida. A Alumina pode catalisar diversas reações orgânicas, como a condensação de compostos carbonílicos.
Além das mesmas variações na composição citadas para a sílica, a alumina pode ainda apresentar variação na superfície específica.
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Alumina (Al2O3)
Utilização: separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder ser preparada com características ácida, básica ou neutra, é bastante útil na separação de substâncias que apresentam variações dessas características.
Separa bem hidrocarbonetos policíclicos, alcaloides, aminas e vitaminas lipossolúveis.
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
Outros:
Celulose;
Poliamida – para separação de fenóis e de ácidos carboxílicos;
Uréia e polietileno – para separara ácidos graxos;
Silicato de cálcio ou magnésio – para separar açúcares;
Gel de dextrana – para separar aminoácidos e proteínas;
Carvão ativado – para separar fenóis.
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Cromatografia em Camada Delgada
Adsorventes:
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Preparação das Placas - Preparação por espalhamento
A primeira etapa consiste na limpeza da placa de vidro para eliminar toda a gordura da superfície.
Suspensão do adsorvente: Uso de aplicadores - 20 cm de comprimento e largura variável. Repousar a placa em superfície plana e deixar secar. Dificuldade em obter superfícies uniformes.
Imersão da placa: duas placas sobrepostas são imersas na suspensão de adsorvente. As placas são separadas e secas. Obtêm superfícies mais delgadas e uniformes. 
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Preparação das Placas – Placas pré-fabricadas
São mais uniformes e homogêneas, porém o custo é bem mais elevado.
Melhora a separação e torna os valores de Rf mais reprodutíveis.
CUIDADOS: aplicar as amostras exatamente na mesma linha de partida das amostras para que o Rf não tenha variações. 
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Ativação das placas
Em algumas separações, deve-se ativar as placas, para se retirar substâncias aderidas ao adsorvente.
A ativação é um aquecimentoe varia para cada adsorvente.
Sílica, alumina e terra diatomácea: 105 – 110°C por 30 a 60 min
Celulose: 105°C até no máximo 10 min 
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Seleção da fase móvel
O solvente ou mistura de solventes utilizado como fase móvel possui papel fundamental na separação dos componentes. 
Existe uma competição entre as moléculas da amostra e da fase móvel, pela superfície adsorvente, portanto considera-se a natureza 
química da amostra e a polaridade da FM.
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Seleção da fase móvel
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Seleção da fase móvel
Para se ter uma ideia do poder eluente de uma fase móvel, pode-se aplicar manchas de amostra em uma cromatoplaca e gotejar sobre cada uma delas diferentes solventes.
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Seleção da fase móvel
Quando uma fase móvel pura não separa bem os componentes de uma amostra, pode-se utilizar uma mistura de solvente.
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Aplicação das amostras
Aplicadas na forma de soluções, em solvente bastante voláteis, que possam ser facilmente eliminados após a aplicação.
Concentração da solução: 0,1% a 1,0% - conforme a sensibilidade do revelador.
Aplicar 1,5 cm a 2,0 cm acima do bordo inferior, evitando que fique mergulhada na FM. 
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Formas de desenvolvimento
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Revelação dos cromatograma
Pode ser por métodos físicos ou químicos.
Método físico: Compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com lâmapada de luz ultravioleta.
Método químico: Quase todas as classes de substâncias orgânicas (exceto alcanos e haletos alifáticos) reagem com iodo formando complexos. A formação desses complexos é reversível. 
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Cromatografia em Camada Delgada
Técnicas Gerais
Revelação dos cromatograma
Revelação sob luz ultravioleta (254 nm): indicado para substâncias com cromóforos (sistemas conjugados), pois absorvem radiação UV e tornam-se fluorescentes.
Revelação com vapores de iodo: revelador universal para qualquer 
substância orgânica. Forma manchas marrons.
Métodos químicos (destrutivo): a solução do revelador é borrifada com ar comprimido. Após aquecimento ocorre a reação da substância com o revelador formando manchas coloridas. Ex. CeSO4 (Universal)
Métodos biológicos: quando há procura por uma substância com atividade biológica. Revelador é uma suspensão de fungos.
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Cromatografia em Camada Delgada
Análise Quantitativa
Assim como a cromatografia em papel, a cromatografia de camada delgada pode ser utilizada como um método quantitativo de análise.
Diretamente sobre a camada de adsorvente: densitometria – determina a área e a intensidade da mancha. O inconveniente desta análise é o fato de compostos incolores apresentarem distribuição desigual da mancha em função da quantidade de revelador utilizado, aquecimento ou volatização da amostra.
Quantificação por outros instrumentos: retirada da área que contenha a substância, que é então eluída e quantificada.
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Cromatografia em Camada Delgada
Aplicações da CCD
Na análise de substâncias orgânicas e inorgânicas;
Acompanhamento de reações em sínteses;
Acompanhamento de reações de processos de purificações, ...
É mais fácil mencionar que ela está presente em quase todos os laboratórios de química ou biologia, em face de suas vantagens (existência de diferentes fases móveis e estacionárias, diferentes técnicas de desenvolvimento e visualização, rápida execução, repetitividade e baixo custo).