Eletroforese

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(
Universidade Estadual Pa
ulista 
“
Julio
 Mesquita 
Filho
”
Unesp
 Rio Claro
)
 Relatório 1
Eletroforese Bidimensional 
Discente:	
Vivian Batista Purificação
Docentes:
Mario Palma
Disciplina:	
Proteômica
Rio Claro – Jun/2016
1. Introdução:
	Uma das atividades mais comuns na área de proteômica é a separação de proteínas de determinada amostra biológica. Para tanto, um dos recursos mais utilizados e eficientes é o da Eletroforese Bidimensional (2D-SDS-PAGE). Tal processo é permite uma alta resolução das formas proteicas em determinada amostra, de uma forma reprodutível, além disso também permite separar formas proteicas que tenham sofrido alterações pós traducionais. Ele é utilizado como principal passo para isolamento de proteínas para uma posterior identificação através de espectrometria de massa.
	O processo de separação por eletroforese bidimensional é baseado em dois procedimentos: um deles (1ª dimensão) é relacionado com o ponto isoelétrico (pI), sendo utilizada a técnica de Focalização Isoelétrica (IEF), e outro (2ª dimensão) relacionado com o peso molecular (MW) utilizando separação em gel SDS-PAGE.
O ponto isoelétrico (pI) é definido como o valor de pH onde a soma das cargas da molécula de uma proteína seja igual a zero. Dessa forma uma proteína é positivamente carregada quando os valores de pH são inferiores ao seu pI e negativamente carregada quando valores de pH são superiores ao seu pI específico.
	A separação é feita devido a influência de uma corrente elétrica, fazendo com que moléculas com carga migrem pelo gel, sendo que a migração dependerá de fatores como tamanho, forma e carga elétrica da molécula. Quando a separação é bem feita, obtêm-se ao final um gel de poliacrilamida contendo diversos spots, cada um correspondendo a uma determinada proteína.
	Apesar de tudo, ainda existem muitas limitações para que se possa utilizar 2D-SDS-PAGE, uma delas é a solubilização de proteínas membranares que necessita ser compatível com uma separação apropriada a 2D, isso se deve por causa dos tipos de detergentes que podem ser utilizados em 2D e que solubilizam de forma eficiente proteínas hidrofóbicas, além disso, quanto menor for a concentração da proteína na amostra mais difícil de identifica-la no gel, tanto devido aos limites dos métodos de detecção, quanto a possíveis sobreposições de proteínas que apresentam MW e pI semelhantes.
	De forma resumida, são necessários seguir determinados passos, para a realização de uma eletroforese, sendo ele: 1- preparação da amostra; 2- Re-hidratação da fita IPG (immobilized pH gradient); 3-IEF (isoelectricfocusing); 4-Reação de equilíbrio da fita IPG; 5-SDS-PAGE (SDS-poliacrylamide gel eletrophoresis); 6-Revelação do gel; e 7-Análise.
2. Objetivo:
	A aula prática teve como objetivo mostrar a utilização de um equipamento de eletroforese bidimensional, a partir de uma amostra já preparada do veneno do bruto da vespa Polybia paulista.
	Vale ressaltar que nenhuma das etapas da eletroforese foram realizadas, a aula prática foi uma explicação do funcionamento do aparelho.
3. Materiais e Métodos:	
3.1 Preparação da amostra:
	A preparação da amostra é uma etapa muito importante para que se possa obter bons resultados, porém é importante ressaltar que não existe uma única maneira de se preparar, já que existem amostras muito diversificadas, além disso também é importante o cuidado na hora do manuseio da amostra para que esta não seja contaminada. Logo para se preparar a amostra necessita-se de um prévio conhecimento do que se quer analisar e os objetivos que se pretende alcançar.
	A amostra proteica tem que ser completamente solúvel nas condições utilizadas durante o experimento, para tanto a eficiência da solubilização depende da escolha do método de ruptura celular, concentração de proteínas e método de dissolução, escolha do detergente e composição da solução de amostra.
	Para uma análise completa de proteínas intracelulares é necessária a ruptura da célula, para tanto é necessário saber o tipo de amostra celular que se está sendo utilizada. Porém, proteases, que podem estar presentes na hora da extração de amostras celulares, podem prejudicar os resultados das análises, logo a amostra deve ser protegida durante o rompimento da célula. No entanto, se deseja analisar subgrupos de proteínas técnicas de fracionamento podem ser utilizadas durante a preparação. 
	No geral procura-se preparar a amostra de forma simples, e para tal existem algumas estratégias:
	1) Manter a estratégia de preparação da amostra o mais simples possível para evitar que ocorram perdas parciais da amostra. A adição de passos pode melhorar ou aumentar a qualidade do resultado final, porém, podem ocorrer maiores perdas da amostra; 
2) A extração de proteínas a partir de células ou tecidos deve seguir um caminho que seja possível minimizar a ação de proteases que poderiam degradar ou causar modificações nas proteínas presentes na amostra; 
3) As amostras devem ser preparadas na hora ou imediatamente antes da realização do experimento ou devem ser aliquotadas e congeladas; 
4) Realizar a preparação da amostra imediatamente antes da focalização isoelétrica, ou estocar a amostra anteriormente preparada à -80°C; 
5) Deve-se remover todas as partículas de material por centrifugação. Partículas sólidas e lipídicas não devem estar presentes, pois podem bloquear os poros do gel; 
6) Para evitar modificações nas proteínas, nunca aqueça a amostra após adicionar ureia. Quando a amostra contém ureia, a temperatura não deve ultrapassar os 37°C.
3.2 Contaminantes:
Também é necessário remover possíveis contaminantes que a amostra possa conter e que podem prejudicar a análise. Alguns deles são:
- Sais, resíduos de tampão e pequenas moléculas carregadoras (resultantes da etapa de preparação da amostra), tais resíduos podem ser através de técnicas de diálise, filtração em gel e precipitação/ressuspensão.
- Pequenas moléculas iônicas que podem ser removidas com técnicas de precipitação e dessalinificação. 
- Detergentes iônicos podem ser removidos através da adição de outros detergentes não iônicos.
- Ácidos nucléicos são retirados com tratamentos com misturas de DNAse/RNAse livres de proteases, causando assim, a redução dos ácidos nucléicos em mono ou oligonucleotídeos.
- Polissacarídeos são precipitados com sulfato de amônia ou acetato de amônia, logo após centrifugados e removidos. 
- Lipídeos precisam diminuir suas interações com proteínas, para tanto são usadas técnicas de denaturação na presença de detergentes, para que os lipídeos se liguem a este último no lugar de se ligarem com proteínas. 
- Compostos fenólicos podem ser removidos com precipitação.
- Por último, para materiais insolúveis recomenda-se centrifugar a amostra antes de aplicar o gel.
3.3 Primeira Dimensão - Focalização Isoelétrica (IEF):	
A focalização é um método de separação de proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos, já que elas podem carregar cargas positivas, negativas ou neutras dependendo do pH do meio.
Logo o primeiro passo a se determinar para o início da eletroforese, é o pH a ser utilizado e isso depende da amostra, já os passos utilizados nessa primeira etapa da eletroforese são os de re-hidratação da fita de pH, aplicação da amostra e focalização.
Para o sucesso do procedimento é necessário um gradiente de pH, pois, sob influência de uma corrente elétrica, as moléculas de proteína movem-se até uma determinada posição onde o balanço de suas cargas é igual a zero. 
	3.3.1 Re-hidratação da fita de pH:
Ao iniciar-se o procedimento, deve-se re-hidratar a fita de pH que será utilizada, antes da focalização. 
Para isso existem dois meios:
1. DryStrip Reswelling Tray utilizando-se o Multiphor II: Neste caso a fita é colocada no DryStrip e coberta com um fluido protetor, tal procedimento ocorre a uma temperatura de 35ºC e leva em média 10 horas, logo está esta etapa já estava pronta na aula prática. Depois de re-hidratas elas são retiradas do Reswelling, lavadas com água deionizada e colocadasna plataforma Multiphor II, onde os eletrodos são posicionados de acordo com o tamanho da fita, e por fim a amostra é aplicada.
2. Utilizando fitas de pH IPGphor Strip holders e sistema IPGphor™: Neste caso a solução de re-hidratação depende da amostra, mas geralmente são usadas soluções compostas com ureia, detergente zwitteriônico ou não iônico, ditiotreitol (DTT), tampão (IPG Buffer) apropriado à faixa de pH do gradiente da fita e um marcador (geralmente um colorante). A solução é colocada no Strip holder e logo após posiciona-se a fita a ser re-hidratada em cima da solução, acima da fita adiciona-se o fluido protetor, depois é só fechar o Strip holder e programar a re-hidratação. Depois de hidratada, aplica-se a amostra.
	3.3.2 Focalização:
A fita de pH re-hidratada e já com a amostra é colocada horizontalmente em uma plataforma de uma unidade de eletroforese, já na plataforma aplica-se uma voltagem que aumenta gradualmente até atingir cerca de 3500V, tal voltagem é mantida até alguns mil Volts/horas. 
Após a focalização a fita é equilibrada em uma solução de equilíbrio e aplica-se um gel horizontal ou vertical de SDS-PAGE.
3.4 Segunda dimensão - 2D-SDS-PAGE:
Os passos utilizados nessa etapa da eletroforese são: Preparação do gel, equilíbrio da fita de pH, posicionamento da fita de pH no gel SDS-PAGE, corrida da eletroforese.
O 2D-SDS-PAGE é um método eletroforético que separa os componentes de uma amostra de acordo com o peso molecular dos componentes. Tal técnica utiliza um gel de poliacrilamida contendo dodecil-sulfato de sódio (SDS). 
	3.4.1 Preparação do gel em placas – sistema vertical:
O gel pode ser preparado de duas formas, uma delas com uma concentração única de acrilamida em toda extensão do gel e outra com uma graduação da concentração de acrilamida.
Dependendo do foco da análise, cada um dos géis possui suas vantagens. O gel com concentração única oferece uma melhor resolução para um faixa especifica de peso molecular, já o gel com concentração graduada possibilita a separação de moléculas com diferentes pesos moleculares em um intervalo maior, além de, geralmente, obter bandas mais definidas.
A porcentagem de acrilamida no gel vai de acordo com o intervalo de massa desejado para a separação, mas além da concentração de acrilamida, também é importante analisar a espessura do gel.
	3.4.2 Equilibrando a fita de pH (IPG):
O equilíbrio da fita de pH é feito a partir de uma saturação da fita com um sistema de tampões SDS. A solução de equilíbrio, geralmente, contém tampão, ureia, glicerol, agente redutor, SDS e um corante.
	3.4.3 Aplicação da fita de pH equilibrada:
Depois de equilibrada, a fita de pH é mergulhada no tampão de SDS e posicionada entre as placas na superfície do gel da segunda dimensão, contra uma das placas de vidro, colocando toda a extensão da fita em contato com o gel, com o cuidado para não formar bolhas, entre a fita e o gel e entre a fita e o vidro.
Em uma das extremidades do gel, coloca-se uma amostra contendo pesos moleculares já conhecidos.
Sela-se a fita de pH com agarose (0,5%) para evitar que a fita se mova. Coloca-se a placa contendo o gel e a fita em uma cuba de eletroforese e por fim programa a unidade de eletroforese.
Tais procedimentos são para um sistema de gel vertical, para o sistema de gel horizontal, deve-se colocar o gel em uma plataforma de eletroforese horizontal; posicionar o cátodo e o ânodo nas extremidades do gel; colocar a fita de pH, que estava na solução de equilíbrio, no gel e deixar drenando por 3 minutos; aplicar em uma das extremidades do gel uma amostra com pesos moleculares padrões; e por fim programar a unidade de eletroforese.
3.5 Visualização de Resultados:
	O método de detecção utilizado foi o da técnica de Coomassie, o azul de Coomassie liga-se as proteínas e por tanto é o método mais utilizado quando se tem a intenção de quantificar proteínas por densidade e levar os spots para a espectrofotometria de massa. 
4. Resultados e Discussão:
Imagem 1: Resultado obtido ao Final da Eletroforese Bidimensional e do Tratamento de Imagem, mostrando os diferentes pesos moleculares.
Imagem 2: Resultado obtido ao Final da Eletroforese Bidimensional e do Tratamento de Imagem, mostrando os diferentes pontos isoelétricos.
	Como pode ser observado nas imagens, pode-se separar uma grande quantidade de proteínas, contornadas em azul (spots), no entanto algumas delas, como as do canto direito da imagem, tiveram uma maior dificuldade de separação, talvez por terem pesos moleculares e valores de pI semelhantes.
	A seguir tem-se os valores encontrados para os spots circulados.
	Spot
	Protein
	Volume
	1st Dimension : pI
	2nd Dimension : MW (kd)
	1
	-
	6,881,300.000
	5.075
	89.490
	2
	-
	6,283,068.000
	5.145
	90.967
	7
	-
	53,468,502.000
	4.992
	54.289
	8
	-
	36,203,775.000
	4.875
	54.289
	10
	-
	7,564,311.000
	5.252
	91.717
	11
	-
	5,031,371.000
	5.206
	89.126
	12
	-
	14,138,351.000
	6.165
	83.531
	13
	-
	8,465,405.000
	6.249
	82.200
	16
	-
	17,177,806.000
	6.416
	81.872
	17
	-
	10,744,548.000
	6.332
	82.862
	18
	-
	14,107,319.000
	6.509
	81.872
	19
	-
	29,238,692.000
	6.663
	80.574
	20
	-
	36,973,164.000
	6.817
	80.253
	24
	-
	56,216,057.000
	6.956
	81.220
	26
	-
	63,454,755.000
	7.091
	82.200
	37
	-
	40,728,866.000
	7.175
	74.749
	43
	-
	2,483,516.000
	7.245
	80.574
	48
	-
	15,270,722.000
	7.250
	75.633
	50
	-
	20,495,052.000
	7.324
	86.273
	51
	-
	19,912,490.000
	7.403
	85.577
	46
	-
	17,775,784.000
	7.240
	86.623
	53
	-
	48,316,026.000
	7.333
	73.021
	54
	-
	15,412,995.000
	7.417
	74.749
	55
	-
	51,633,621.000
	7.533
	72.738
	56
	-
	67,464,456.000
	7.794
	73.879
	57
	-
	12,017,659.000
	5.411
	68.920
	58
	-
	23,717,504.000
	6.021
	49.975
	59
	-
	29,090,506.000
	6.197
	50.144
	61
	-
	23,878,689.000
	6.644
	49.470
	63
	-
	22,903,147.000
	6.928
	58.722
	64
	-
	13,522,769.000
	7.357
	58.510
	65
	-
	13,822,103.000
	7.664
	55.059
	66
	-
	16,020,674.000
	8.106
	55.254
	67
	-
	8,721,908.000
	7.785
	55.254
	70
	-
	8,913,159.000
	7.147
	58.089
	71
	-
	9,110,221.000
	7.231
	58.722
	72
	-
	9,894,084.000
	7.063
	58.510
	74
	-
	32,493,788.000
	6.421
	49.806
	77
	-
	18,211,430.000
	6.812
	44.679
	78
	-
	10,468,138.000
	6.947
	41.318
	76
	-
	21,243,629.000
	6.644
	44.395
	79
	-
	10,982,103.000
	6.691
	41.192
	80
	-
	12,288,518.000
	5.639
	36.531
	81
	-
	12,191,294.000
	5.806
	36.226
	83
	-
	21,379,204.000
	4.684
	36.327
	82
	-
	27,834,269.000
	4.792
	36.226
	84
	-
	12,260,665.000
	5.062
	32.317
	85
	-
	12,415,344.000
	4.922
	32.317
	86
	-
	11,320,161.000
	4.861
	42.087
	87
	-
	24,002,068.000
	4.750
	26.769
	88
	-
	31,204,507.000
	5.629
	23.501
	89
	-
	16,279,691.000
	4.954
	24.048
	90
	-
	37,649,548.000
	6.016
	23.501
	Spot
	Protein
	Volume
	1st Dimension : pI
	2nd Dimension : MW (kd)
	91
	-
	9,805,690.000
	6.295
	44.822
	75
	-
	3,019,695.000
	6.486
	44.395
	92
	-
	11,214,780.000
	6.407
	41.445
	93
	-
	20,064,324.000
	6.472
	29.093
	95
	-
	12,321,665.000
	7.026
	29.765
	94
	-
	15,739,131.000
	6.658
	29.159
	96
	-
	12,073,264.000
	6.761
	28.330
	97
	-
	9,227,108.000
	7.045
	28.207
	98
	-
	16,237,358.000
	7.259
	28.268
	99
	-
	8,163,854.000
	7.450
	31.214
	100
	-
	11,029,742.000
	7.431
	29.492
	101
	-
	9,203,430.000
	7.510
	28.268
	102
	-
	6,542,590.000
	7.883
	31.367
	103
	-
	12,700,846.000
	8.004
	28.392
	104
	-
	13,763,483.000
	8.334
	29.628
	107
	-
	8,471,980.000
	8.525
	28.579
	108
	-
	13,719,248.000
	8.441
	28.579
	109
	-
	22,612,401.000
	8.632
	28.579
	110
	-
	15,183,710.000
	8.758
	28.579
	111
	-
	26,624,894.000
	9.284
	28.706
	112
	-
	13,928,816.000
	9.302
	32.317
	115
	-
	13,875,516.000
	6.891
	26.346
	116
	-
	9,587,879.000
	6.840
	25.311
	117
	-
	20,416,218.000
	7.170
	26.503
	118
	-
	12,650,148.000
	7.575
	26.346
	119
	-
	27,256,333.000
	6.737
	23.501
	120
	-
	36,856,232.000
	7.273
	23.731
	121
	-
	9,937,818.000
	7.245
	22.351
	122
	-
	11,415,988.000
	7.422
	22.287
	124
	-
	22,568,901.000
	8.181
	23.653
	125
	-
	28,145,982.000
	8.860
	24.635
	126
	-
	25,735,047.0005.183
	20.547
	127
	-
	15,439,095.000
	4.996
	20.547
	128
	-
	19,836,713.000
	7.077
	20.433
	129
	-
	31,962,584.000
	7.212
	19.598
	130
	-
	31,945,803.000
	8.316
	19.635
	131
	-
	22,478,558.000
	8.516
	19.748
	133
	-
	22,083,158.000
	3.497
	18.713
	134
	-
	2,963,098.000
	4.452
	18.472
	135
	-
	14,712,367.000
	5.271
	18.658
	136
	-
	20,269,665.000
	5.453
	18.976
	137
	-
	15,422,775.000
	5.560
	18.323
	138
	-
	4,098,292.000
	5.788
	18.961
	139
	-
	50,153,260.000
	6.109
	18.397
	140
	-
	42,253,412.000
	6.635
	18.434
	141
	-
	26,337,350.000
	6.793
	18.916
	142
	-
	37,531,720.000
	7.133
	18.323
	143
	-
	41,063,946.000
	6.756
	17.799
	144
	-
	58,249,879.000
	7.007
	17.790
	146
	-
	27,404,461.000
	9.498
	18.127
	147
	-
	35,554,154.000
	9.680
	18.217
	148
	-
	3,202,504.000
	9.838
	17.936
	149
	-
	46,747,550.000
	3.423
	17.465
	Spot
	Protein
	Volume
	1st Dimension : pI
	2nd Dimension : MW (kd)
	150
	-
	45,491,335.000
	5.029
	17.857
	151
	-
	30,466,184.000
	5.015
	17.367
	152
	-
	32,248,043.000
	5.229
	17.465
	153
	-
	45,248,565.000
	5.508
	17.426
	154
	-
	57,873,580.000
	5.448
	17.163
	155
	-
	86,279,254.000
	5.830
	17.176
	156
	-
	27,650,679.000
	5.983
	17.544
	159
	-
	18,318,330.000
	6.169
	17.268
	160
	-
	17,950,535.000
	6.156
	17.138
	161
	-
	60,926,767.000
	7.268
	17.295
	162
	-
	4,389,372.000
	7.668
	17.295
	163
	-
	18,464,520.000
	7.966
	17.241
	145
	-
	33,744,813.000
	8.371
	17.707
	165
	-
	5,807,659.000
	8.534
	17.389
	164
	-
	60,702,127.000
	8.264
	17.345
	166
	-
	144,981,826.000
	8.939
	17.359
	167
	-
	35,790,114.000
	9.661
	17.316
	169
	-
	23,415,356.000
	9.251
	17.359
	168
	-
	12,413,100.000
	9.181
	17.176
	170
	-
	17,358,664.000
	4.047
	16.842
	171
	-
	14,118,270.000
	4.624
	16.885
	173
	-
	19,777,784.000
	4.475
	16.723
	174
	-
	20,905,022.000
	4.629
	16.715
	175
	-
	23,394,631.000
	4.489
	16.568
	176
	-
	18,681,768.000
	5.397
	16.736
	177
	-
	14,522,772.000
	5.564
	16.703
	178
	-
	3,125,245.000
	5.806
	16.837
	179
	-
	19,665,953.000
	5.359
	16.493
	181
	-
	48,926,969.000
	6.132
	16.490
	182
	-
	16,898,173.000
	6.365
	16.999
	183
	-
	43,013,348.000
	6.114
	16.679
	184
	-
	14,414,014.000
	6.979
	16.823
	187
	-
	57,020,041.000
	7.338
	16.715
	186
	-
	46,306,380.000
	7.222
	16.578
	188
	-
	33,089,198.000
	7.966
	16.642
	189
	-
	37,582,599.000
	8.474
	16.664
	190
	-
	54,965,360.000
	8.674
	16.653
	191
	-
	22,493,060.000
	8.944
	16.703
	192
	-
	58,292,059.000
	9.163
	16.620
	193
	-
	6,341,378.000
	9.582
	16.676
	194
	-
	9,094,122.000
	9.638
	37.582
	195
	-
	34,355,812.000
	4.778
	17.916
	196
	-
	13,866,962.000
	5.685
	22.448
	197
	-
	13,514,584.000
	10.024
	17.586
Tabela 1: Valores de pI e peso molecular dos 197 spots marcados para a amostra de veneno.
5. Conclusão:	 
A aula foi muito produtiva e pode exemplificar bem a importância do uso de tais aparelhos e da proteômica em si, mesmo que nem todas as etapas tenham sido exemplificas devido à grande duração delas.
6. Referências:
PALMA, M.S et. al. Material de Apoio: Curso de formação de Recursos Humanos em Análise Proteômica. Centro de Estudos de Insetos Sociais –CEIS, Departamento de Biologia UNESP – Rio Claro, p. 8-22. 
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