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1 Os ácidos nucleicos: DNA e RNA Professora Vanessa Kava-Cordeiro 1 2 3 Estrutura do DNA 4 Estrutura do DNA Erwin Chargaff e cols. (1950) Rosalind Franklin e Maurice Wilkins (1952,3) James Watson e Francis Crick (1953) 5 Erwin Chargaff estabeleceu proporções entre as bases nitrogenadas 6 2 Conclusões de Chargaff A quantidade de nucleotídeos pirimidínicos (T+C) é sempre igual a quantidade total de nucleotídeos purínicos (A+G) A quantidade de T = A; C = G A quantidade de A+T é diferente de G + C A relação A + T / G + C é espécie específica 7 1905 - 2002 Descobertas que ajudaram na elucidação da estrutura do DNA 1953 – Rosalind Franklin e Maurice Hugh Frederick Wilkins 8 1920 - 1958 1916 - 2004 Padrão de difração de raios X obtida do DNA 9 As bases e as medidas sugeridas por Rosalind 10 Rosalind Franklin e Maurice Wilkins Resultados com difração de raio X O DNA é longo e fino Tem partes semelhantes e paralelas, correndo ao longo da molécula É helicoidal 11 1953 – James Watson e Francis Crick propuseram a “dupla hélice” baseando-se nos dados de Rosalind e Wilkins e nas relações de Chargaff 12 1916 - 2004 1928 - 3 Prêmio Nobel de Medicina 1962 13 Ácidos nucleicos Macromoléculas compostas de subunidades repetidas chamadas nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por: 1. Um grupo fosfato 2. Um açúcar com 5 carbonos (pentose) 3. Um composto nitrogenado cíclico (base) 14 15 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum: radical fosfato pentose Estruturas do DNA e RNA 16 PURINAS PIRIMIDINAS DNA Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma 17 18 Especificidade no pareamento: Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio 4 As fitas do DNA estão dispostas em direções opostas 19 Antiparalelismo Complementariedade: quando uma fita é conhecida, a outra também é! 20 Estrutura do DNA Ciclo de 3,4 nm 0,34 nm entre “degraus” Raio de 1 nm 21 A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas da cromatina 22 Sulco menor Sulco maior A Dupla Hélice PONTOS IMPORTANTES O DNA geralmente existe como dupla hélice, com os dois filamentos mantidos por pontes de hidrogênio entre bases complementares (G=C e A=T) A complementariedade garante a estocagem e transmissão da informação genética Os dois filamentos de DNA tem polaridade química oposta O RNA geralmente existe como uma molécula unifilamentar com uracila no lugar de timina 23 Questões 24 1. Se o conteúdo GC de uma molécula de DNA é 56%, qual a porcentagem de cada uma das bases nesta molécula? 2. Qual é a propriedade da molécula de DNA que permite a resolução dessa questão? 3. Qual seria a resposta se a pergunta tratasse de uma molécula de RNA? 5 25 Estruturas Cromossômicas e Genomas Profa. Vanessa Kava-Cordeiro 26 O comprimento do ácido nucleico é muito maior do que o do compartimento que o contém! Empacotamento do DNA 27 Empacotamento do DNA DNA de humanos ~ 40 km de fio em uma bola de tênis Complexo desafio de empacotar o DNA Proteínas especializadas que se ligam ao DNA e o dobram Elevado nível de organização, evitando que o DNA se torne um emaranhado DNA deve estar pronto para ser replicado, reparado e os genes disponíveis para produzir proteínas (expressão gênica) 28 Estruturas cromossômicas e genoma em vírus 29 Estruturas cromossômicas em vírus Muitos vírus tem apenas um cromossomo (DNA, RNA, fita dupla ou fita simples) Menores vírus (RNA) – apenas 3 genes! Maiores vírus (DNA – cerca de 150 genes como o fago T2 “Experimento de Hershey- Chase”) 30 O genoma viral está empacotado dentro do capsideo 6 31 Bacteriófago T2 envolto pela sua molécula de DNA. Foi liberado pela lise do bacteriófago que está disperso em água. O tamanho do DNA é aprox. 3500 vezes maior que a partícula do bacteriófago. 32 •1640 vírus tiveram seu genoma completamente sequenciado! (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=genome&cmd=search&term=viru s%20genome acesso em16/03/2009) (42 viróides: 246 a 399 nucleotídeos) 33 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=24016 Genome > Viruses > Allium virus X, complete genome Links Lineage: Viruses; ssRNA viruses; ssRNA positive-strand viruses, no DNA stage; Flexiviridae; Potexvirus; unclassified Potexvirus; Allium virus X Genome Info: Features: BLAST homologs: Links: Review Info: Refseq: NC_012211 Genes: 5 COG Genome Project Publications: None GenBank: FJ670570 Protein coding: 5 TaxMap Refseq FTP Refseq Status: PROVISIONAL Length: 7,127 nt Structural RNAs: None TaxPlot GenBank FTP Seq.Status:Completed GC Content: 50% Pseudo genes: None GenePlot BLAST Sequencingcenter: None % Coding: 97% Others: None gMap TraceAssembly Completed: 2009/03/12 Topology: linear Contigs: None CDD Organism Group Molecule: RNA Other genomes for species: 34 Estrutura cromossômica e genoma de procariontes 35 Estruturas cromossômicas em procariontes Procariontes são MONOPLÓIDES (tem apenas um conjunto de genes) A maioria dos procariontes estoca seu conjunto único de genes em um só cromossomo circular O DNA acumula-se no nucleóide Fonte: Genes VIII p. 549 36 Cromossomo bacteriano -Varia em tamanho: ~ 750 kb em Mycoplasma ~ 5.000 kb em Escherichia coli ~ 10.000 kb em Streptomyces (~1.000 a 10.000 genes) 7 37 Quando ocorre a lise bacteriana, as fibras de DNA são libertadas sob a forma de loops, agarrados à membrana da célula. Tortora, Funke and Case, 1996 38 Genoma compactado Estado funcional 50 a 100 domínios ou alças (cada uma super- helicoidizada negativamente de modo independente) RNA (conectores) e proteínas são componentes do genoma compactado no nucleóide mas ~80% é DNA Genoma pode ser parcialmente relaxado por DNAse e/ou RNAse e/ou agentes que atuem nas proteínas As proteínas que atuam na condensaçao do DNA ainda não são totalmente conhecidas 39 Estrutura do estado funcional do cromossoma de E. coli Relaxa o DNA apenas nos domínios cortados Descompacta o RNA parcialmente, eliminando alças 40 - Presença de proteínas associadas, semelhantes às histonas, envolvidas no empacotamento do cromossomo e regulação de transcrição Cromossomo bacteriano 41 Estrutura e organização do cromossomo de E. coli 4.6 Mb 90% do genoma codifica proteínas 4288 genes, 40% dos quais ainda não se sabe o que codificam Quase não tem DNA repetitivo Sequências de bacteriófagos encontradas em 8 locais (devem ter sido invadidas por vírus, pelo menos, 8 vezes durante a história evolutiva) 42 Cromossomo de E. coli 8 43 Descobertos nos anos 50 (Japão): genes de resistência em epidemia de disenteria por Shigella dysenteriae - Molécula de DNA de fita dupla, circular e super- enovelada Exceções: em poucas espécies, são lineares ou de fita simples. - Replicação autônoma (independente do cromossomo) Plasmídeos 44 Plasmídeos DNA de uma célula de E. coli lisada. (setas indicam plasmídeos) 45 Plasmídeos -Estrutura não essencial, mas que pode conferir vantagens seletivas -Exemplos: •resistência a drogas e outros agentes antimicrobianos •produção de fatores de virulência (toxinas, adesinas)•degradação de substâncias inusitadas (ex. petróleo) •alguns conferem mecanismos adicionais de transferência genética (conjugação) > plasmídeos conjugativos Funções: -Importantes ferramentas em Engenharia Genética 46 - Tamanho variável (~1 a 200kb) - No. variável em uma mesma bactéria: Pode não conter plasmídeos, ou pode conter vários tipos de plasmídeos, simultaneamente. - No. de cópias de cada molécula é controlado: pequenos (5-10 kb) 50-100 cópias/célula grandes (50-200 kb) 1-10 cópias/célula Plasmídeo 47 -Fragmentos de DNA lineares -Tamanho: variável (~700 a 40.000 pb) -Associados a uma molécula de DNA auto-replicativa -Podem mover-se de uma região para a outra, na mesma ou outra molécula (podem inativar genes...) - Embora não essenciais, podem ser vantajosos (ex. genes de resistência, produção de toxinas) Elementos Transponíveis Sequências de inserção e Transposons Ilhas de patogenicidade (PAIs) 48 9 49 Vírus bacterianos (Bacteriófagos ou fagos) Fago temperado: genoma insere-se no cromossomo bacteriano, mantendo-se de modo ~ estável> (estado de profago) Bactérias contendo profagos são denominadas lisogeneizadas Fago virulento (ou lítico): lisa bactérias infectadas 50 Vírus bacterianos Conversão fágica (ou conversão lisogênica): Fenômeno onde uma propriedade bacteriana é codificada pelo profago Ex. Corynebacterium diphtheriae (difteria) Genes que codificam toxina diftérica são do vírus somente as bactérias lisogeneizadas da espécie são virulentas 51 Estrutura cromossômica e genoma de eucariontes 52 Células Eucarióticas célula animal célula vegetal 53 célula vegetal DNA nuclear + DNA cloroplastidial + DNA mitocondrial DNA nuclear + DNA mitocondrial célula animal Genoma eucariótico Grande nível de complexidade 54 Moléculas enormes de DNA Altamente condensadas durante a mitose e meiose (durante a interfase não é possível visualizar cromossomos individuais Centrômeros e telômeros têm estruturas únicas Cromossomos eucarióticos 10 55 c = centrômeroTelômero Telômero Centrômero: Local onde se prendem as proteínas que ligam os cromossomos às fibras do fuso. Telômero: Estruturas características localizadas nas extremidades dos cromossomos. 56 Genoma eucariótico Maioria dos organismos é DIPLÓIDE (dois conjuntos completos de genes, um de cada genitor) – alguns podem ser POLIPLÓIDES ou ainda HAPLÓIDES 57 58 Cariótipo eletroforético de Saccharomyces cerevisiae 16 cromossomos visualizados em bandas em gel de agarose 59 Genoma eucariótico O tamanho do genoma tem ordens de grandeza maior que de vírus e procariontes (apesar de eucariontes terem apenas 2 a 15 vezes mais genes que a E. coli) 60 11 61 Cromossomos interfásicos Chroma (grego): cor Cromatina: complexo DNA + proteínas Eucromatina: material genético pouco corado durante a intérfase, com muitos genes Heterocromatina: cromatina que se cora intensamente durante a intérfase, em geral contendo DNA repetitivo com poucos genes 62 63 Proteínas da cromatina Proteínas básicas (carga positiva em pH neutro): HISTONAS Proteínas ácidas (carga negativa em pH neutro): grupo heterogêneo, coletivamente chamadas de PROTEÍNAS CROMOSSÔMICAS NÃO-HISTONAS 64 HISTONAS Importantes para a composição da estrutura da cromatina Todos os eucariontes tem histonas em quantidades equivalentes à quantidade de DNA Interação HISTONA + DNA conservada 65 CLASSES DE HISTONAS 5 tipos: H1, H2a, H2b, H3 e H4 (presentes em quase todos os tipos de células – exceção: alguns espermatozóides com protaminas) Proporções molares: 1 H1 : 2 H2a : 2 H2b : 2 H3 : 2 H4 H2a, H2b, H3 e H4 são proteínas muito conservadas (constantes entre espécies amplamente divergentes) Importantes na estrutura da cromatina (mas não tanto em processos regulatórios) 66 PROTEÍNAS NÃO-HISTONAS Grande número de proteínas heterogêneas Variam amplamente, mesmo entre diferentes tipos de células do mesmo organismo Prováveis candidatas a papéis na regulação da expressão gênica 12 67 Compactação dos cromossomos eucarióticos Cada cromossomo é uma única molécula de DNA Estas moléculas tem de 1 a 20 cm de comprimento (maior cromossomo humano tem 8,5 cm) 68 Autorradiografia de uma molécula de DNA com 1,2 cm de tamanho de Drosophila melanogaster 69 Compactação dos cromossomos eucarióticos 3 níveis de compactação 1) Estrutura de contas (microscopia eletrônica) Fibra de 10 nm 70 Estrutura de um nucleossomo (cerne do nucleossomo: ~150 a 200 pb de DNA associados a 2 cópias de histonas (H2A, H2B, H3 e H4) e uma histona H1 externa. 71 Compactação dos cromossomos eucarióticos - 3 níveis 2) Fibra de cromatina de 30 nm (microscopia eletrônica e óptica) Encontrada em cromossomos mitóticos e meióticos Fibra de 10 nm enrolada em uma super-hélice de ordem maior (um solenóide) Histona H1 parece desempenhar papel de estabilização e composição desta fibra 72 Fibra de cromatina de 30 nm Microscopia eletrônica da estrutura Compactação dos nucleossomos 13 73 74 Compactação dos cromossomos eucarióticos - 3 níveis 3) Proteínas não-histonas Cromossomo metafásico Parece não depender de histonas Formam um arcabouço envolvido na condensação cromossômica Domínios super-helicoidizados 75 Cromossomo humano metafásico do qual foram removidas as histonas O arcabouço tem a mesma forma do cromossomo metafásico antes da remoção das histonas Proteínas cromossômicas não- histonas (ou não histônicas) 76 • Representação esquemática do DNA cromossômico preso a um arcabouço (scaffold) nuclear. • Cada dobra representa mais uma compactação. • Dentro dos loops estão genes com funções relacionadas. 77 Composição de cromossomos eucarióticos 78
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