8 pág.
Pré-visualização | Página 2 de 3
da in vivo. Os mais utilizados são o e o glutaraldeído, superior ao formol e por isso mais utilizado do que este. Essas substâncias, chamadas fixadores, são empregadas diluídas em tampões, que ajudam a manter o pH e a osmolaridade da solução fixadora o mais próximas possível das condições vitais. Dessa maneira evita-se a deformação ou o rompimento das estruturas celulares. 2– Pós-fixação e contrastação: Como os seres vivos são compostos basicamente por átomos leves que desviam pouco ou nada a passagem do feixe de elétrons, são utilizadas soluções de sais de metais pesados (Fe, Os, Ur, Pb), que, além de melhorarem a preservação das células, aumentam o contraste das amostras quando observadas ao microscópio eletrônico de transmissão. Esses sais se impregnam seletivamente nas membranas, no DNA ou em outros componentes celulares, facilitando a visualização dessas estruturas. 3– Desidratação, inclusão e microtomia: A fixação confere preservação às células; entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas para que o feixe de elétrons possa atravessá-las também é um obstáculo a ser superado. Para isso as amostras têm toda sua água substituída, inicialmente por um solvente orgânico como álcool etílico ou acetona, e em seguida por uma resina que, inicialmente, é líquida, mas nas condições adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as amostras sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os elétrons possam passar nas áreas em que não se impregnaram os metais pesados. 18) Qual a principal diferença do microscópio eletrônico de transmissão par o de varredura? A imagem do MET é bidimensional devido aos cortes finos feitos nas amostras, já o de varredura as imagens são tridimensionais. O de transmissão se baseia na capacidade Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna do feixe de elétrons de atravessar a amostra, enquanto no de varredura o feixe de elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado num monitor. 19) Quando deve ser usado o microscopia eletrônica de transmissão ? Quando se deseja obter informações das organelas intercelulares. Nesse microscópio é impossível a observação de células vivas, pois as células passam por vários processos de preparação e são cortadas em fatias muito finas. 20) Quando deve ser usado a microscopia de varredura? Quando se quizer obter informações sobre a forma externa das amostras (sejam elas células, folhas, insetos, dentes, pêlos etc.), estas não são cortadas em fatias. È impossível a observação de uma célula viva, pois a célula vai sofrer vários processos de preparação, como tratamento com soluções fixadoras, a secagem do material (para remover toda a água, já que esse microscópio também opera sob vácuo) e seu revestimento com ouro ou outro elemento condutor, para geração do sinal 21) Comente sobre o microscópio eletrônico de alta voltagem. Enquanto no microscópio eletrônico de transmissão convencional o feixe de elétrons é acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observação de amostras até 100-150 nm de espessura, no microscópio eletrônico de transmissão de alta voltagem a aceleração do feixe é de até 1.000 KV. Isso permite a observação de amostras bem mais espessas (até 2 µm!). 22) Quando se deve usar o microscópio de varredura de alta resolução? Quando o objetivo é observar detalhes que passam despercebidos na varredura convencional. Organelas e filamentos do citoesqueleto que normalmente não são visíveis ao microscópio eletrônico de varredura podem ser vistas aqui. 23) Quando se deve usar o Microscópio de varredura de pressão variável? Qual é sua desvantagem? Quando o objetivo é observar amostras vivas e frescas sem nenhum tratamento químico e sem o processo de secagem e obter uma maior resolução que a microscopia óptica. 24) Faça uma tabela comparando o poder de resolução, a natureza das lentes e o tipo de emissão do filamento do microscópio eletrônico de transmissão em relação ao microscópio óptico. Microscópio óptico Microscópio Eletrônico Poder de resolução 2 micrômetros 2 nanômetros Lentes De vidro Eletromagnéticas Emissão de filamentos Luz visível Elétrons (radiação não visível) 25) Se a área de observação na tela de um microscópio eletrônico mede 9 X 9cm e uma célula mede cerca de 30 micrômetros, qual é o maior aumento com o qual poderemos observar toda sua circunferência ? 30 micrômetros = 30 x 10 –4 cm 9/30 x 10 –4 = 3 x 10 –3 = 3000 26) As células são hidratadas e, mesmo sendo formadas de elementos leves, são muito espessas para permitir a passagem de um feixe de elétrons. Quais os principais Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna processos a que precisam ser submetidas antes da observação no microscópio de transmissão? Fixação, para estabilizar a estrutura química. 27) Por que é necessário que a coluna do microscópio eletrônico permaneça sob o vácuo ? Para que os elétrons não sejam barrados ou desviados por moléculas de ar (Oxigênio, gás carbônico e vapor de água) na coluna. O oxigênio também causaria combustão do filamento. Aula 3 – Criofatura 28) Quais são os procedimentos básicos para criofatura? • Fixação: manter a estrutura geral da célula; • Infiltração com glicerol: o glicerol impede a formação de cristais de gelo durante o congelamento. Os cristais perfurariam e destruiriam a célula; • Fratura: feita a baixa temperatura e sob vácuo, expõe as superfície das membranas plasmática e das organelas intracelulares. • Evaporação com platina: feita em ângulo de 45 o visa criar áreas sombreadas segundo o relevo das proteínas de membrana e estruturas celulares. • Evaporação com Carbono: feita homogeneamente por toda a réplica cria uma “base”, sendo o carbono transparente ao feixe de elétrons. • Limpeza da réplica: feita com ácidos ou bases fortes. Remove restos celulares que estejam grudados na réplica. • Lavagem: feita com água. Depois dela a réplica é recolhida sobre uma grade e levada ao microscópio eletrônico de transmissão. 29) Explique detalhadamente as etapas da criofatura. Fixação Æ Antes do congelamento, a célula deve ser fixada para preservar suas estruturas como. Se congelarmos uma célula ela iria formar cristais de gelo que poderiam perfura-las. Para que isso não ocorra, antes de congelar a célula, as amostras devem ser fixadas em Glicerol (substância que dificulta a formação de cristais de gelo, ele se liga a moléculas como DNA, proteínas, lipídios com a função de unir essas moléculas como se a célula ainda estivesse viva). Congelamento Æ um fator que impede a formação desses cristais é um congelamento ultra-rápido feito no Nitrogênio líquido; Fratura Æcom a amostra já congelada, vamos fazer a fratura do bloco de gelo formado. Essa fratura é feita numa câmara a vácuo, a baixa temperatura e a pressão constante. O bloco de gelo pode quebrar em 3 lugares diferentes: em cima da célula, em baixo da célula e no meio da célula, o lugar que nos interessa. A probabilidade de uma fratura perfeita é muito pequena, por isso vaias amostras devem ser preparadas. Replicação Æ ainda sob vácuo, alta temperatura, a superfície de gelo que foi quebrado ao meio, vai receber um bombardeamento de carbono, num ângulo de 90°, atingindo assim, os vales das células. Logo após, irá receber um bombardeamento de platina (metal pesado), num ângulo de 45° para contornar as laterais da célula e melhorar o contraste. Depois disso, já se tem uma réplica da superfície da célula, é feita a limpeza dessa réplica com ácidos ou bases fortes. Isso, irá remover os restos celulares que estejam grudados na réplica. Depois de remover os restos celulares, é feita a lavagem, onde a réplica é colocada em água sanitária para extrair toda água e ficar apenas a película de platina e carbono. Depois
