Estudo Dirigido Pra Ap1 de Bio Cel 1

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Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna 
Estudo Dirigido de Biologia celular I para AP1 
 
Aula 1 - Microscopia óptica 
 
1) Quando surgiu o primeiro microscópio ? 
No século XVII, mesma época que Robert Hook observou pela primeira vez uma 
célula em lâminas de cortiça. 
 
2) Quem foi Robert Hook ? 
Um inglês, pioneiro na microscopia, hoje conhecido como o Homem dos 7 
instrumentos. Deu sua contribuição em vários ramos da ciência, como a Física, a 
Astronomia, Química, Biologia, Geologia, Arquitetura, etc. 
Hook desenvolveu um microscópio composto que usava para examinar insetos, 
esponjas e finas lâminas de cortiça, onde descobriu a existência das células. 
 
3) Qual é a importância de cada um dos itens citados a seguir pra a observação ao 
microscópio óptico: fonte de luz, espessura e contraste da amostra ? 
♦ Fonte de luz: atravessar a amostra pra formar a imagem na retina do 
observador; 
♦ Lente condensadora: concentrar a luz, aumentando a intensidade do feixe; 
♦ Espessura e contraste da amostra: quanto mais espessa a amostra, menos a luz 
irá atravessa-la, maior será o contraste e menor a visibilidade dos detales. 
 
4) Quem foi Antony Van Leeuwenhoek ? 
Outro pioneiro no ramo da microscopia. Ele fez descobertas fundamentais no ramo 
da Biologia, como as bactérias e os protozoários. Ele não era um cientista convencional 
como os de sua época, pois era filho de comerciantes, sem fortuna e sem educação 
universitária, ainda assim, com sua habilidade extraordinária para polir lentes de 
microscópio e sua grande curiosidade e mente aberta, livre dos dogmas científicos, foi o 
primeiro a descrever as hemácias, os espermatozóides e muito mais. Seus microscópios, 
embora com uma única lente, eram capazes de aumentar até 200 vezes o objeto. 
 
5) Como funciona um microscópio óptico? 
Uma fonte de luz concentrada sobre a lente é condensada sobre a amostra. O 
feixe de luz vai atravessar a amostra e ser captado por uma das lentes objetivas do 
revolver. Essa lente objetiva irá produzir a primeira imagem ampliada, que será captada 
pela lente ocular que irá projetar a imagem final na retina do observador. O aumento no 
microscópio óptico é resultado da multiplicação dos valores da lente objetiva pelo 
aumento da lente ocular. 
 
6) O que é e do que depende o poder de resolução de um microscópio? 
Limite de resolução é a menor diatânca em que 2 pontos podem ser distinguidos 
como individuais. Esse poder de resolução depende das lentes, da intensidade da luz e 
de outros fatores mais. 
 
7) Uma hemácia mede 8 micrômetros. Quando observada sob um aumento total de 
1.000 vezes, quanto medirá ? 
8.000 micrômetros. 
 
8) Uma célula foi fotografadacom 2.000x de aumento no microscópio óptico. Uma 
estrutura que tenha na realidade 2 micrômetros, aparecerá com quanto cm ? 
2000 X 2 = 4000 micrômetros = 4 mm = 0,4 cm. 
 
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9) Por que em geral o núcleo é a única estrutura claramente visível dentro de uma célula 
observada ao microscópio óptico ? 
Devido ao seu tamanho e localização. As outras estruturas ou são muito pequenas 
ou aparecem como túbulos ou vesículas dentro da célula. 
 
10) Quando chamamos um aumento de aumento vazio ? 
Quando há um aumento, mas sem resolução. 
 
11) Como é feito o preparo de amostras para o microscópio óptico de campo claro ? 
Para que possam ser guardadas por muito tempo, as amostras de células e tecidos 
precisam em geral de um tratamento químico que garanta sua preservação. Esse 
tratamento inclui várias etapas: 
a) Fixação: é o tratamento da amostra com substâncias químicas, como o formol, 
que preservem sua forma original. 
b) Desidratação: é a substituição da água presente dentro e fora das células por um 
solvente orgânico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido, 
deixando a lâmina secar, quanto pode ser substituído por parafina ou outra resina que 
torne o tecido rígido, permitindo que seja fatiado. 
c) Microtomia: é a fatiação dos tecidos, pois alguns tecidos como fígado ou músculo 
são muito espessos apenas fatiados eles permitem a passagem parcial da luz. Para 
isso, devem ser embebidos em parafina, e quando solidificado pode ser cortado 
(fatiado). 
d) Coloração: como a maioria das células e seus componentes não são naturalmente 
coloridos, são usados uma série de corantes que tem afinidade química por 
determinados componentes celulares, assim, pode-se identificar os diferentes 
compartimentos celulares. O azul de metileno é um desses corantes. 
 
12) Em que tipo de microscópio podemos observar amostras vivas e sem a adição de 
corantes? 
Nos microscópios de contraste de face e no de contraste interferencial. 
 
13) O que vc pode entender sobre microscopia de Fluorescência? 
No microscópio de4 fluorescência a amostra é tratada comum corante fluorescente 
e iluminada com uma fonte de luz ultravioleta, capaz de fazer com que apenas as áreas 
onde o corante se fixou apareçam na imagem. 
 
14) Em que tipo de amostra e em qual situação deve-se usar os seguintes 
microscópios ópticos: 
a) Microscópio de campo claro Æ (amostra morta e fina) esse microscópio não 
permite visualizar uma amostra viva. Requer que a amostra seja preparada com 
corantes e fatiada, ficando fina o suficiente para que a luz consiga ultrapassa-la; 
b) Microscópio de contraste de faceÆ (amostra viva e fina) esse microscópio permite 
a visualização de amostras vivas, pois não precisa de corante, mas se a amostra não 
pode ser muito espessa, senão terá que ser fatiada e morta; 
c) Microscópio de contraste interferencialÆ(amostra viva e espessa) tb permite 
observar células vivas, mas nesse, não importa se a amostra é mais espessa, ela não 
precisa ser fatiada. 
d) Microscópio de fluorescênciaÆ esse requer o uso de corantes fluorescentes. Em 
algumas situações a célula pode ser observada viva, outras não; 
e) Microscópio confocal de varredura a laserÆ fornece imagens tridimensionais na 
trela de um computador, podendo ser observadas as organelas intercelulares. 
 
Aula 2 – Princípios de funcionamento dos microscópioseletrônicos 
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15) Comente sobre o microscópio eletrônico? 
Esse tipo de microscópio utiliza um feixe de elétrons para produzir uma imagem 
ampliada de um objeto. Essa família é composta por dois tipos de microscópios: os 
microscópios eletrônicos de transmissão e os microscópios eletrônicos de varredura. Os 
de transmissão se baseiam na capacidade do feixe de elétrons de atravessar a amostra, 
enquanto nos de varredura o feixe de elétrons percorre a superfície da amostra gerando 
um sinal que será visualizado num monitor. 
 
16) Quais são as diferenças do Microscópio eletrônico de transmissão para o óptico? 
O microscópio eletrônico de transmissão é idêntico ao microscópio óptico na 
montagem de seus itens básicos apenas é maior e invertido. As principais diferenças são: 
‰ a fonte: luz visível no microscópio óptico e feixe de elétrons no microscópio 
eletrônico de transmissão; 
‰ o vácuo na coluna do microscópio eletrônico de transmissão. É necessário não 
apenas para impedir a combustão do filamento na presença de oxigênio como 
também para impedir a colisão do feixe de elétrons com moléculas do ar. 
‰ as lentes: de vidro no microscópio óptico e eletromagnetos no microscópio 
eletrônico de transmissão. As lentes magnéticas desviam e orientam o feixe de 
elétrons da mesma forma que as lentes de vidro desviam e orientam o feixe de luz; 
‰ a espessura da amostra: a amostra precisa ser cortada em fatias muito finas para 
ser atravessada pelos elétrons. 
 
17) Como é feito o preparo de amostras para ser observadas num microscópio 
eletrônico ? 
1– Fixação: Em geral é feita mergulhando as células ou tecidos em soluções que 
estabilizam as membranas e os constituintes celulares na forma o mais próxima possívelda in vivo. Os mais utilizados são o e o glutaraldeído, superior ao formol e por isso mais 
utilizado do que este. Essas substâncias, chamadas fixadores, são empregadas diluídas 
em tampões, que ajudam a manter o pH e a osmolaridade da solução fixadora o mais 
próximas possível das condições vitais. Dessa maneira evita-se a deformação ou o 
rompimento das estruturas celulares. 
 
2– Pós-fixação e contrastação: Como os seres vivos são compostos basicamente por 
átomos leves que desviam pouco ou nada a passagem do feixe de elétrons, são 
utilizadas soluções de sais de metais pesados (Fe, Os, Ur, Pb), que, além de melhorarem a 
preservação das células, aumentam o contraste das amostras quando observadas ao 
microscópio eletrônico de transmissão. Esses sais se impregnam seletivamente nas 
membranas, no DNA ou em outros componentes celulares, facilitando a visualização 
dessas estruturas. 
 
3– Desidratação, inclusão e microtomia: A fixação confere preservação às células; 
entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas para que o feixe de 
elétrons possa atravessá-las também é um obstáculo a ser superado. Para isso as 
amostras têm toda sua água substituída, inicialmente por um solvente orgânico como 
álcool etílico ou acetona, e em seguida por uma resina que, inicialmente, é líquida, mas 
nas condições adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as 
amostras sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os elétrons possam passar 
nas áreas em que não se impregnaram os metais pesados. 
 
18) Qual a principal diferença do microscópio eletrônico de transmissão par o de 
varredura? 
A imagem do MET é bidimensional devido aos cortes finos feitos nas amostras, já o 
de varredura as imagens são tridimensionais. O de transmissão se baseia na capacidade 
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do feixe de elétrons de atravessar a amostra, enquanto no de varredura o feixe de 
elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado num 
monitor. 
 
19) Quando deve ser usado o microscopia eletrônica de transmissão ? 
Quando se deseja obter informações das organelas intercelulares. Nesse 
microscópio é impossível a observação de células vivas, pois as células passam por vários 
processos de preparação e são cortadas em fatias muito finas. 
 
20) Quando deve ser usado a microscopia de varredura? 
Quando se quizer obter informações sobre a forma externa das amostras (sejam elas 
células, folhas, insetos, dentes, pêlos etc.), estas não são cortadas em fatias. È impossível 
a observação de uma célula viva, pois a célula vai sofrer vários processos de 
preparação, como tratamento com soluções fixadoras, a secagem do material (para 
remover toda a água, já que esse microscópio também opera sob vácuo) e seu 
revestimento com ouro ou outro elemento condutor, para geração do sinal 
 
21) Comente sobre o microscópio eletrônico de alta voltagem. 
Enquanto no microscópio eletrônico de transmissão convencional o feixe de 
elétrons é acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observação de amostras até 100-150 
nm de espessura, no microscópio eletrônico de transmissão de alta voltagem a 
aceleração do feixe é de até 1.000 KV. Isso permite a observação de amostras bem mais 
espessas (até 2 µm!). 
 
22) Quando se deve usar o microscópio de varredura de alta resolução? 
Quando o objetivo é observar detalhes que passam despercebidos na varredura 
convencional. Organelas e filamentos do citoesqueleto que normalmente não são visíveis 
ao microscópio eletrônico de varredura podem ser vistas aqui. 
 
23) Quando se deve usar o Microscópio de varredura de pressão variável? Qual é sua 
desvantagem? 
Quando o objetivo é observar amostras vivas e frescas sem nenhum tratamento 
químico e sem o processo de secagem e obter uma maior resolução que a microscopia 
óptica. 
 
24) Faça uma tabela comparando o poder de resolução, a natureza das lentes e o 
tipo de emissão do filamento do microscópio eletrônico de transmissão em relação ao 
microscópio óptico. 
 
 Microscópio óptico Microscópio Eletrônico 
Poder de resolução 2 micrômetros 2 nanômetros 
Lentes De vidro Eletromagnéticas 
Emissão de filamentos Luz visível Elétrons (radiação não 
visível) 
 
25) Se a área de observação na tela de um microscópio eletrônico mede 9 X 9cm e 
uma célula mede cerca de 30 micrômetros, qual é o maior aumento com o qual 
poderemos observar toda sua circunferência ? 
30 micrômetros = 30 x 10 –4 cm 
9/30 x 10 –4 = 3 x 10 –3 = 3000 
 
26) As células são hidratadas e, mesmo sendo formadas de elementos leves, são 
muito espessas para permitir a passagem de um feixe de elétrons. Quais os principais 
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processos a que precisam ser submetidas antes da observação no microscópio de 
transmissão? 
Fixação, para estabilizar a estrutura química. 
 
27) Por que é necessário que a coluna do microscópio eletrônico permaneça sob o 
vácuo ? 
Para que os elétrons não sejam barrados ou desviados por moléculas de ar 
(Oxigênio, gás carbônico e vapor de água) na coluna. O oxigênio também causaria 
combustão do filamento. 
 
Aula 3 – Criofatura 
 
28) Quais são os procedimentos básicos para criofatura? 
• Fixação: manter a estrutura geral da célula; 
• Infiltração com glicerol: o glicerol impede a formação de cristais de gelo durante 
o congelamento. Os cristais perfurariam e destruiriam a célula; 
• Fratura: feita a baixa temperatura e sob vácuo, expõe as superfície das 
membranas plasmática e das organelas intracelulares. 
• Evaporação com platina: feita em ângulo de 45 o visa criar áreas sombreadas 
segundo o relevo das proteínas de membrana e estruturas celulares. 
• Evaporação com Carbono: feita homogeneamente por toda a réplica cria uma 
“base”, sendo o carbono transparente ao feixe de elétrons. 
• Limpeza da réplica: feita com ácidos ou bases fortes. Remove restos celulares que 
estejam grudados na réplica. 
• Lavagem: feita com água. Depois dela a réplica é recolhida sobre uma grade e 
levada ao microscópio eletrônico de transmissão. 
 
29) Explique detalhadamente as etapas da criofatura. 
Fixação Æ Antes do congelamento, a célula deve ser fixada para preservar suas 
estruturas como. Se congelarmos uma célula ela iria formar cristais de gelo que poderiam 
perfura-las. Para que isso não ocorra, antes de congelar a célula, as amostras devem ser 
fixadas em Glicerol (substância que dificulta a formação de cristais de gelo, ele se liga a 
moléculas como DNA, proteínas, lipídios com a função de unir essas moléculas como se 
a célula ainda estivesse viva). 
Congelamento Æ um fator que impede a formação desses cristais é um 
congelamento ultra-rápido feito no Nitrogênio líquido; 
Fratura Æcom a amostra já congelada, vamos fazer a fratura do bloco de gelo 
formado. Essa fratura é feita numa câmara a vácuo, a baixa temperatura e a pressão 
constante. O bloco de gelo pode quebrar em 3 lugares diferentes: em cima da célula, 
em baixo da célula e no meio da célula, o lugar que nos interessa. A probabilidade de 
uma fratura perfeita é muito pequena, por isso vaias amostras devem ser preparadas. 
Replicação Æ ainda sob vácuo, alta temperatura, a superfície de gelo que foi 
quebrado ao meio, vai receber um bombardeamento de carbono, num ângulo de 90°, 
atingindo assim, os vales das células. Logo após, irá receber um bombardeamento de 
platina (metal pesado), num ângulo de 45° para contornar as laterais da célula e 
melhorar o contraste. Depois disso, já se tem uma réplica da superfície da célula, é feita a 
limpeza dessa réplica com ácidos ou bases fortes. Isso, irá remover os restos celulares que 
estejam grudados na réplica. Depois de remover os restos celulares, é feita a lavagem, 
onde a réplica é colocada em água sanitária para extrair toda água e ficar apenas a 
película de platina e carbono. Depoisda réplica pronta, ela é recolhida em uma grade e 
levada ao microscópio de transmissão. 
 
30) Qual é a parte da membrana que é exposta na fratura? 
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O plano médio, isto é, aquele para onde convergem as caudas hidrofóbicas dos 
fosfolipídeos. 
 
31) A que correspondem as partícula intramembranosas observadas nas réplicas? 
Às proteínas integrais da membrana. 
 
32) Qual é a contribuição da criofatura na elaboração do modelo do mosaico fluído? 
Mostrou que as proteínas se inserem na bicamada lipídica, podendo ser de 
diferentes tamanhos e estar distribuídas aleatoriamente (ao acaso) ou formando arranjos 
como linhas paralelas, círculos, aglomerados, etc. Daí a comparação a um mosaico. 
 
Aula 4 – Cultura de células 
 
33) O que significa cultivar células? 
Manter vivas as células retiradas de um organismo. 
 
34) Como se faz uma cultura? 
As culturas podem ser preparadas diretamente de tecidos retirados de um animal. 
Nesse caso, são chamadas de culturas primárias. Grupos de células que são retirados das 
culturas primárias e continuam a crescer in-vitro, dão origem a culturas secundárias. Esse 
processo pode ser repetido várias vezes, mantendo as células por semanas ou meses. 
 
35) Do que precisa uma célula em cultura? 
Para que uma célula sobreviva in-vitro devem ser garantidas condições de 
temperatura e umidade semelhante a do organismo onde ela se originou. Além disso, o 
ambiente precisa ser mantido livre de bactérias, fungos e outros microorganismos que 
podem contaminar a cultura de células. 
As células também precisam nutrir-se, por tanto o meio de cultura deve conter 
todos os nutrientes necessários para o metabolismo de cada tipo celular em cultivo. As 
células em cultura também produzem excreções que modificam a acidez do meio e 
podem intoxicar e matar as células em cultivo. Tais substâncias precisam ser removidas, 
seja pela substituição do meio de cultura, seja pela transferência de grupos de células 
para placas ou garrafas com meio novo. 
 
36) O que é um meio de cultura e como ele deve ser para que a cultura de certo? 
É uma mistura de moléculas necessárias à nutrição da célula. Originalmente era 
utilizado o soro de animais como cavalo e boi. Também foi muito empregado o extrato 
de embriões de galinha. Atualmente existem muitas formas quimicamente definidas, em 
que se pode avaliar o efeito da omissão ou adição de determinado componente sobre 
o comportamento das células. Além de aas. , açúcares, vitaminas e sais minerais, 
geralmente entram na composição dos meios de cultura proteínas do soro, antibióticos e 
fungicidas, estes dois últimos para diminuir o risco de contaminação. O meio de cultura 
deve ter osmolaridade e pH adequados para o tipo celular em estudo. 
 
37) Quais os requisitos básicos para manutenção de células em cultura? 
As células, para serem mantidas em cultura, devem estar em ambiente estéril, a 
temperatura, pressão e pH dentro de uma faixa que permita sua sobrevivência e 
multiplicação. O meio de cultura deve conter ainda todos os nutrientes necessários 
(proteínas, açúcares, lipídeos, sais minerais) e fatores de crescimento, como vitaminas e 
hormônios. 
 
38) O que você entende por células in vitro? E in vivo? 
Cultivar in vitro consiste em retirar células de um organismo e fazê-las sobreviver em 
um recipiente como uma placa de Petri, tubo de ensaio ou outros. Algumas células se 
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multiplicam in vitro, outras apenas sobrevivem e se diferenciam, geralmente aderindo às 
paredes do vidro ou plástico do recipiente. In vivo consiste em manter células dentro de 
um organismo, que será seu hospedeiro. Alguns protozoários parasitas, como o 
Toxoplasma gondii, são normalmente mantidos em camundongos, já que morrem 
rapidamente se não penetrarem em outras células. Alguns heterocárions formam tumores 
que secretam anticorpos de interesse para os pesquisadores. Esses tumores também são 
mantidos por passagem entre animais. 
 
39) Por quanto tempo uma cultura deve ser mantida? 
Num organismo, cada tipo celular é programado para um determinado número de 
divisões e tempo de vida. Por Exemplo, as células da nossa pele estão constantemente 
sendo renovadas, graças as as divisões das células das camadas mais profundas. Essas 
culturas matem in-vitro as mesmas características dos tecidos de onde se originaram. 
 
40) O que é uma cultura primária? 
É uma cultura inicial, obtida a partir de células extraídas de um animal. 
41) O que são linhagens celulares estabelecidas? 
Quando tiramos uma amostra de um tecido e se coloca in-vitro, temos uma cultura 
primária. Para que a células não morram, o meio de cultura deve ser trocado, pois estão 
cheios dos restos metabólicos celulares. Para que isso não ocorra, deve-se trocar o meio 
de cultura (repique). Esse repique é feito várias vezes. Depois desses repiques, chamamos 
as células dessa cultura, de células estabelecidas. Nesse meio, as células se dividem 
ilimitadamente, pois ela “gosta” desse meio. As células estabelecidas conseguem 
manter-se iguais às do tecido original por anos. 
 
42) Diferencie uma célula transformada para uma célula cancerosa. 
Tanto a célula tumoral quanto a transformada podem se multiplicar 
indefinidamente; entretanto, a célula transformada guarda as características do tipo 
celular que lhe deu origem (e.g., a cultura de células epiteliais transformadas forma uma 
camada com as células unindo-se entre si, como num epitélio normal), enquanto a 
célula cancerosa cresce desorganizadamente, formando grumos ou massas. 
 
43) Uma linhagem é um clone? 
Não, um clone só é formado quando a cultura é derivada da multiplicação de uma 
única célula e não de várias células diferentes. 
 
44) O que é um heterocáriom? 
É a fusão induzida entre duas células de origens diferentes formando apenas uma 
célula. A célula resultante dessa fusão contém dois núcleos com material genético das 
duas células. Por essa célula ter dois núcleos, ela é chamada de heterocariom. 
 
45) O que é um hibridoma? 
♦ Quando se induz a fusão de duas células e o núcleo dessas duas se fundem. 
♦ É uma célula formada pela fusão de dois tipos celulares diferentes. Seu núcleo 
reúne o DNA das duas células originais e ela se comporta combinando características 
das duas células originais. 
 
46) Da fusão de uma célula tumoral com uma célula secretora forma obtidos 
heterocárions com as seguintes características: 
a) Células com baixa capacidade de divisão, mas alta atividade secretora; 
b) Células com alta capacidade de divisão e baixa atividade secretora; 
c) Células com alta capacidade de divisão e alta atividade secretora; 
d) Células com baixa capacidade de divisão e baixa atividade secretora. 
Qual desses heterocárions será mais interessante? Justifique sua resposta. 
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C, pois com a alta taxa de multiplicação, será mais rápida a obtenção de grandes 
quantidades da proteína secretada. 
47) O que são células-Tronco? 
São células pluripotentes, que ao se multiplicar podem dar origem a todos os tipos 
celulares que constituem um organismo.