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Estudo Dirigido Pra Ap1 de Bio Cel 1

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da in vivo. Os mais utilizados são o e o glutaraldeído, superior ao formol e por isso mais 
utilizado do que este. Essas substâncias, chamadas fixadores, são empregadas diluídas 
em tampões, que ajudam a manter o pH e a osmolaridade da solução fixadora o mais 
próximas possível das condições vitais. Dessa maneira evita-se a deformação ou o 
rompimento das estruturas celulares. 
 
2– Pós-fixação e contrastação: Como os seres vivos são compostos basicamente por 
átomos leves que desviam pouco ou nada a passagem do feixe de elétrons, são 
utilizadas soluções de sais de metais pesados (Fe, Os, Ur, Pb), que, além de melhorarem a 
preservação das células, aumentam o contraste das amostras quando observadas ao 
microscópio eletrônico de transmissão. Esses sais se impregnam seletivamente nas 
membranas, no DNA ou em outros componentes celulares, facilitando a visualização 
dessas estruturas. 
 
3– Desidratação, inclusão e microtomia: A fixação confere preservação às células; 
entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas para que o feixe de 
elétrons possa atravessá-las também é um obstáculo a ser superado. Para isso as 
amostras têm toda sua água substituída, inicialmente por um solvente orgânico como 
álcool etílico ou acetona, e em seguida por uma resina que, inicialmente, é líquida, mas 
nas condições adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as 
amostras sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os elétrons possam passar 
nas áreas em que não se impregnaram os metais pesados. 
 
18) Qual a principal diferença do microscópio eletrônico de transmissão par o de 
varredura? 
A imagem do MET é bidimensional devido aos cortes finos feitos nas amostras, já o 
de varredura as imagens são tridimensionais. O de transmissão se baseia na capacidade 
Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna 
do feixe de elétrons de atravessar a amostra, enquanto no de varredura o feixe de 
elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado num 
monitor. 
 
19) Quando deve ser usado o microscopia eletrônica de transmissão ? 
Quando se deseja obter informações das organelas intercelulares. Nesse 
microscópio é impossível a observação de células vivas, pois as células passam por vários 
processos de preparação e são cortadas em fatias muito finas. 
 
20) Quando deve ser usado a microscopia de varredura? 
Quando se quizer obter informações sobre a forma externa das amostras (sejam elas 
células, folhas, insetos, dentes, pêlos etc.), estas não são cortadas em fatias. È impossível 
a observação de uma célula viva, pois a célula vai sofrer vários processos de 
preparação, como tratamento com soluções fixadoras, a secagem do material (para 
remover toda a água, já que esse microscópio também opera sob vácuo) e seu 
revestimento com ouro ou outro elemento condutor, para geração do sinal 
 
21) Comente sobre o microscópio eletrônico de alta voltagem. 
Enquanto no microscópio eletrônico de transmissão convencional o feixe de 
elétrons é acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observação de amostras até 100-150 
nm de espessura, no microscópio eletrônico de transmissão de alta voltagem a 
aceleração do feixe é de até 1.000 KV. Isso permite a observação de amostras bem mais 
espessas (até 2 µm!). 
 
22) Quando se deve usar o microscópio de varredura de alta resolução? 
Quando o objetivo é observar detalhes que passam despercebidos na varredura 
convencional. Organelas e filamentos do citoesqueleto que normalmente não são visíveis 
ao microscópio eletrônico de varredura podem ser vistas aqui. 
 
23) Quando se deve usar o Microscópio de varredura de pressão variável? Qual é sua 
desvantagem? 
Quando o objetivo é observar amostras vivas e frescas sem nenhum tratamento 
químico e sem o processo de secagem e obter uma maior resolução que a microscopia 
óptica. 
 
24) Faça uma tabela comparando o poder de resolução, a natureza das lentes e o 
tipo de emissão do filamento do microscópio eletrônico de transmissão em relação ao 
microscópio óptico. 
 
 Microscópio óptico Microscópio Eletrônico 
Poder de resolução 2 micrômetros 2 nanômetros 
Lentes De vidro Eletromagnéticas 
Emissão de filamentos Luz visível Elétrons (radiação não 
visível) 
 
25) Se a área de observação na tela de um microscópio eletrônico mede 9 X 9cm e 
uma célula mede cerca de 30 micrômetros, qual é o maior aumento com o qual 
poderemos observar toda sua circunferência ? 
30 micrômetros = 30 x 10 –4 cm 
9/30 x 10 –4 = 3 x 10 –3 = 3000 
 
26) As células são hidratadas e, mesmo sendo formadas de elementos leves, são 
muito espessas para permitir a passagem de um feixe de elétrons. Quais os principais 
Isabel Titoneli – Pólo Itaperuna 
processos a que precisam ser submetidas antes da observação no microscópio de 
transmissão? 
Fixação, para estabilizar a estrutura química. 
 
27) Por que é necessário que a coluna do microscópio eletrônico permaneça sob o 
vácuo ? 
Para que os elétrons não sejam barrados ou desviados por moléculas de ar 
(Oxigênio, gás carbônico e vapor de água) na coluna. O oxigênio também causaria 
combustão do filamento. 
 
Aula 3 – Criofatura 
 
28) Quais são os procedimentos básicos para criofatura? 
• Fixação: manter a estrutura geral da célula; 
• Infiltração com glicerol: o glicerol impede a formação de cristais de gelo durante 
o congelamento. Os cristais perfurariam e destruiriam a célula; 
• Fratura: feita a baixa temperatura e sob vácuo, expõe as superfície das 
membranas plasmática e das organelas intracelulares. 
• Evaporação com platina: feita em ângulo de 45 o visa criar áreas sombreadas 
segundo o relevo das proteínas de membrana e estruturas celulares. 
• Evaporação com Carbono: feita homogeneamente por toda a réplica cria uma 
“base”, sendo o carbono transparente ao feixe de elétrons. 
• Limpeza da réplica: feita com ácidos ou bases fortes. Remove restos celulares que 
estejam grudados na réplica. 
• Lavagem: feita com água. Depois dela a réplica é recolhida sobre uma grade e 
levada ao microscópio eletrônico de transmissão. 
 
29) Explique detalhadamente as etapas da criofatura. 
Fixação Æ Antes do congelamento, a célula deve ser fixada para preservar suas 
estruturas como. Se congelarmos uma célula ela iria formar cristais de gelo que poderiam 
perfura-las. Para que isso não ocorra, antes de congelar a célula, as amostras devem ser 
fixadas em Glicerol (substância que dificulta a formação de cristais de gelo, ele se liga a 
moléculas como DNA, proteínas, lipídios com a função de unir essas moléculas como se 
a célula ainda estivesse viva). 
Congelamento Æ um fator que impede a formação desses cristais é um 
congelamento ultra-rápido feito no Nitrogênio líquido; 
Fratura Æcom a amostra já congelada, vamos fazer a fratura do bloco de gelo 
formado. Essa fratura é feita numa câmara a vácuo, a baixa temperatura e a pressão 
constante. O bloco de gelo pode quebrar em 3 lugares diferentes: em cima da célula, 
em baixo da célula e no meio da célula, o lugar que nos interessa. A probabilidade de 
uma fratura perfeita é muito pequena, por isso vaias amostras devem ser preparadas. 
Replicação Æ ainda sob vácuo, alta temperatura, a superfície de gelo que foi 
quebrado ao meio, vai receber um bombardeamento de carbono, num ângulo de 90°, 
atingindo assim, os vales das células. Logo após, irá receber um bombardeamento de 
platina (metal pesado), num ângulo de 45° para contornar as laterais da célula e 
melhorar o contraste. Depois disso, já se tem uma réplica da superfície da célula, é feita a 
limpeza dessa réplica com ácidos ou bases fortes. Isso, irá remover os restos celulares que 
estejam grudados na réplica. Depois de remover os restos celulares, é feita a lavagem, 
onde a réplica é colocada em água sanitária para extrair toda água e ficar apenas a 
película de platina e carbono. Depois