A maior rede de estudos do Brasil

Grátis
16 pág.
Resumo de Imunologia Básica - Parte II

Pré-visualização | Página 1 de 5

P2 IMUNOLOGIA
 Elisa- enzyme linked immunosorbent assay
*ELISA sanduíche
*ELISA de captura de anticorpos
*ELISA de captura de antígenos
São feitos em placas de 96 poços. Também existem placas com mais poços, existe também vários formatos de poços cada um com uma aplicação diferente.
A placa pode ser de PVC ou poliestireno. O método comum para ligar o antígeno no fundo da placa é coloca-lo dentro da placa e ele irá se ligar por adsorção passiva.
Adsorção passiva: As porções hidrofóbicas da molécula vão ter afinidade por porções hidrofóbicas do plástico (que tem uma superfície hidrofóbica) não é uma ligação covalente. Quando há adsorção passiva, há interações do antígeno com o plástico, que podem modificar a estrutura do antígeno, ou esconder epítopos que sejam importantes para a ligação com o anticorpo que será pesquisado
*O antígeno pode cair na placa de várias formas:
Além disso, o antígeno pode ser extremante hidrofílico, sem região hidrofóbica para ligar ao plástico, ele fica solúvel e vai embora. Portanto, existem placas com modificações químicas como contendo grupos hidrocarbonetos com grupo reativo na ponta (spacer arm) com ele pode-se saber a distância com que cada antígeno liga na placa e direciona quimicamente a ligação do antígeno a esse grupo reativo.
Etapas:
1. Adsorção do antígeno (Ag)
Não precisa do próprio vírus HIV, só pega os antígenos mais imunogênicos do patógeno, são aqueles que levam uma maior resposta humoral.
2. Bloqueio da placa
Não se põe a amostra do paciente diretamente nos pocinhos, pois os anticorpos podem adsorver passivamente nas paredes da placa e dará um resultado falso positivo.
Os anticorpos têm resíduos tem resíduos hidrofóbicos na sua estrutura.
 O bloqueio da placa é feito com uma solução de proteínas imunologicamente não relacionadas ao ensaio. Ex: O que está sendo relacionado com o ensaio ? antígenos HIV e anti-HIV.
O bloqueio pode ser feito com albumina bovina, caseína, gelatina, leite...
É bom que seja usado vários tipos de proteína, assim até os espaços mais pequenos serão preenchidos e o bloqueio será mais eficiente.
3. Colocar amostra do paciente
A amostra é diluída para poder mantes condições que se assemelhem a uma condição biologicamente comparável, assim como nosso organismo. É preciso manter o meio aquoso, força iônica, pH, e também pode colocar detergente (que seja “brando”, e não desnaturante, ele deve atuar nas interações hidrofóbicas para atrapalhar as interações inespecíficas que eventualmente ocorram entre antígeno-anticorpo.
NaCl 120-150 mM
KCl
Tampão pH 7,4-7,6
Detergente 0,015 %
Pode-se usar plasma de sangue do paciente. E então dilui no agente bloqueante.
4. Lavar com tampão 5x
Tudo o que não ligou é jogado fora. Anticorpos que estão ligados fracamente no agente bloqueante ou ao antígeno, também serão removidos, A lavagem é feita com o tampão.
5. Colocação de um anticorpo secundário ou conjugado
Permite evidenciar a ligação antígeno-anticorpo usando um outro anticorpo acoplado em uma enzima.
 Terá antígeno, anticorpo anti-HIV, anti anticorpo
 Se o anticorpo anti-anticorpo foi feito numa cabra, é chamado de cabra- anti IG humana- HRPO (enzima peroxidase)
É possível amplificar ainda mais a reação, se ao invés da enzima, esse secundário estiver ligado numa vitamina chamada biotina que tem alta afinidade por uma proteína chamada avidina. Cada biotina liga seis avidinas, e cada avidina liga uma enzima, isso possibilita ter uma quantidade maior de enzimas no sistema. No final das contas, evidencia-se a interação antígeno-anticorpo-conjugado, a partir da atividade enzimática observada nesse sistema.
6. Lavar
7. Revelar
Fazer uma reação na qual essa enzima vai levar uma modificação da cor no sistema
OPD (reduzido) + H2O2 H2O +O2 + OPD (oxidado)
OPD é uma molécula orgânica que na forma reduzida é incolor e na forma oxidada se torna laranja.
TMB (reduzido) + H2O2 H20 + O2 + TMB (oxidado)
TMB é uma molécula orgânica que na forma reduzida é incolor e na forma oxidada se torna azul.
8. Parar/bloquear a reação com H2SO4 muda a cor para amarelo. (analisa no espectrofotômetro)
Se o poço ficar amarelo, o paciente é positivo.
Resumão: Nesse tipo de ELISA, primeiramente são ligados ao fundo da placa de teste os anticorpos de captura, impedindo que haja outros pontos de ligação fortes para o antígeno. A seguir, é adicionada a amostra de interesse, e caso exista antígeno específico procurado, este se liga aos anticorpos de captura. Em seguida é feita uma lavagem para a retirada de antígenos que não se ligaram aos anticorpos de captura. Posteriormente, são adicionados a amostra os anticorpos conjugados a enzima, que farão o reconhecimento da presença do antígeno. A seguir é feita uma segunda lavagem para a retirada dos anticorpos conjugados que não se ligaram a amostra e, por fim, é adicionado o substrato que reagem com a enzima, que promove a mudança de cor ou fluorescência. 
Como essa técnica utiliza anticorpos de captura, há um aumento da especificidade da ligação destes com a amostra. Dessa forma, não há necessidade de purificá-la, evitando a competição com outros antígenos e melhorando o processo de análise. Além disso, é comum que os anticorpos conjugados a enzimas reconheçam e possam se ligar a regiões do anticorpo ligado ao antígeno. Em suma, esse processo é bastante específico, podendo ser utilizado para exames contra falsos-positivos. 
*ELISA de captura de anticorpos (COMPETIÇÃO)
Há vários poços com a mesma quantidade de anticorpos de captura neles. Há o antígeno frio e o antígeno quente marcado com iodo radioativo. Coloca-se uma quantidade constante do antígeno quente, e vai variar a quantidade de antígeno frio. O anticorpo que esta ali não deve conseguir discernir entre o antígeno quente e frio, ele deve ter a mesma afinidade química pelos dois.
No 1º poço não é colocado nada, no 2º coloca-se uma molécula fria, no 3° coloca-se o dobro e assim por diante. No 1° poço, o antígeno quente vai ligar, no 2° tem mais chance do quente se ligar, no 3° tem a mesma probabilidade de ligar o quente e ófrio, no 4° tem maior probabilidade do frio se ligar, e assim por diante. Esses resultados são colocados em um gráfico
-A forma quente vai caindo conforme competição com a espécie fria.
Para dosar uma amostra do paciente: num outro poço com a mesma quantidade de anticorpo de captura, mesma quantidade de antígeno quente e a amostra (que não se conhece a quantidade do antígeno frio). Se a amostra foi colocada e foi obtido sinal de 100% significa que o paciente é negativo para a amostra de interesse.
Quando não tem nada de molécula fria também pode dar um sinal de 100% e conforme tem amostra fia o sinal vai cair, então enquanto menos sinal, mais tem antígeno problema na amostra.
 Defesas do corpo contra a infecção:
Funções de comunicação das superfícies mucosas as tornam vulneráveis à infecção:
As superfícies mucosas são as principais portas de entrada de microrganismos para o nosso corpo, são as mais expostas ao ambiente externo.
Toda a superfície mucosa que recobre a boca também está sujeita a ter a entrada de microrganismo 
Com a evolução, se desenvolveu uma imunidade típica das superfícies mucosas. Há tecidos linfoides que podem se assemelhar ao órgão linfoide secundário, que tem o papel de organizar as células da resposta imunológica, muito próximos ao local que vai haver a infecção. Essas estruturas são interligadas pela rede linfática.
Captação e transporte de antígenos por células M
Célula M é especializada na captura de antígenos do lúmen do intestino para estimular células B e T nessas estruturas linfóides.
As células M ficam em regiões inter epiteliais, e são especializadas na captura e transporte de antígenos. Ela pode captar antígenos direto do lúmen do intestino por endocitose ou fagocitose, e entrega os antígenos nas regiões basais das células epiteliais, onde estão presentes células dendríticas que devem captar esses antígenos, processar e apresenta-los para os linfócitos T ou B virgens, que se tornem ativadas e vão permanecer,