Relatório Final - Iniciação Científica em Imunogenética UFPR

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
NATALIA ANGELICA PETRY
RELATÓRIO FINAL
(08/2019 a 08/2020)
PROGRAMA DE IC: 
( X ) PIBIC
( ) PIBIC Af
( ) PIBIC EM 
( ) PIBITI 
MODALIDADE: 
( X ) CNPq 
( ) UFPR TN 
( ) Fundação Araucária
( ) Voluntária
ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO DOS GENES HLA-B E HLA-C E NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS
Relatório apresentado à Coordenação de Iniciação Científica e Tecnológica da Universidade Federal do Paraná como requisito parcial da conclusão das atividades de Iniciação Científica ou Iniciação em desenvolvimento tecnológico e Inovação - Edital 2018
Orientadora: Prof.ª Maria da Graça Bicalho
Co-orientadora: Prof.ª Patrícia Savio de Araújo-Souza
Título do Projeto: Imunogenética dos transplantes, da reprodução e de doenças
CURITIBA
2020
ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO DOS GENES HLA-B E HLA-C E NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS
RESUMO
	A infeção cervical por HPV é o principal fator de risco para a neoplasia intraepitelial cervical e, embora dependa de outros cofatores, pode levar ao desenvolvimento do câncer. A alta incidência de infecção por HPV em indivíduos imunocomprometidos é uma forte evidência da importância de uma resposta imunológica adequada. As moléculas codificadas pelos genes HLA-B e HLA-C são responsáveis por controlar a resposta das células Natural Killers, através da ligação com receptores KIR, e dos Linfócitos T, através do seu papel na ativação dos linfócitos. A função das moléculas HLA na resposta imunológica celular justifica que se investigue o polimorfismo dos genes HLA-B e HLA-C, e sua possível associação com as lesões cervicais. Para tanto, foram utilizadas 312 amostras na análise alélica de HLA-B, 319 na do grupo Bw, 418 na análise alélica HLA-C, 430 na do grupo C1/ C2, e 215 amostras para a análise conjunta dos dois grupos. As amostras, que passaram por um processamento laboratorial prévio por PCR-SSOP, foram reanalisadas computacionalmente pelo software HLA Fusion v. 4.3 fornecido pelo Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade – UFPR. Para classificar os alelos em Bw4/ Bw6 e C1/ C2, foi necessário determinar, com auxílio do HLA Fusion, os aminoácidos das posições 80-83 e 80, respectivamente. Na análise estátistica, conduzida com auxílio do programa Rstudio v. 1.3, foram encontradas associações positivas entre NIC II/ III com a presença dos alelos HLA-B*07:02 (OR: 2.05, p= 0.04) e HLA-C*03:04 (OR: 2.24, p= 0.01); com o genótipo C1/ C1 (OR: 1.54, p=0.05); e com combinações de do grupo C1 e Bw6 (OR: 2.56, p= 0.0001), sugerindo susceptibilidade, e associações negativas entre NIC II/ III com os alelos HLA-B*35:05 (OR: 0.44, p= 0.02) e HLA-B*14:02 (OR: 0.39, p= 0.04), sugerindo proteção. 
Palavras-chave: imunogenética; HLA-B; HLA-C; KIR; câncer de colo de útero; neoplasia intraepitelial cervical.
INTRODUÇÃO
	A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é considerada como um pré-requisito para o desenvolvimento do câncer de colo de útero (CCU). O CCU evolui a partir da neoplasia intraepitelial cervical, e é um dos tipos de câncer mais frequente em mulheres, especialmente as que vivem em regiões menos desenvolvidas do mundo. Estimativas brasileiras para o ano de 2020 sugerem a incidência de 16.590 novos casos no ano, dentre estes, 990 apenas no estado do Paraná (INCA, 2020; PRENDIVILLE e DAVIES, 2004)
	A infecção pelo HPV não apresenta sintomas na maioria das pessoas. Em alguns casos, o HPV pode ficar latente de meses a anos. A prevenção contra o HPV pode ser realizada por meio de vacinação, sendo esta a medida mais eficaz, e também pelo uso de preservativos, mas vale ressaltar que seu uso não impede totalmente a infecção por HPV, pois, frequentemente as lesões estão presentes em áreas não protegidas pela camisinha (vulva, região pubiana, perineal e bolsa escrotal). Exames preventivos regulares para a detecção precoce de lesões precursoras do CCU são altamente recomendados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2020).
	A alta incidência de infecção por HPV em indivíduos imunocomprometidos é uma forte evidência da importância de uma resposta imunológica adequada para o controle da infecção por HPV. A susceptibilidade genética também teria grande impacto neste tipo de câncer, visto que mulheres com histórico familiar de CCU são mais sujeitas ao desenvolvimento da doença devido a uma menor capacidade em combater a infecção (PRENDIVILLE e DAVIES, 2004; MAGNUSSON e GYLLENSTEN, 2000). 
	Os linfócitos T, células do sistema imunológico adaptativo, possuem receptores TCRαß para reconhecer peptídeos antigênicos apresentados por células apresentadoras de antígenos (Antigen Presenting-cells ou APCs). A capacidade das APCs de apresentarem antígenos depende da presença de moléculas especializadas codificadas por genes presentes no Complexo Principal de Histocompatibilidade, em humanos denominado HLA. O sistema gênico HLA encontra-se no cromossomo 6 em 6p21.3 (ALAM et al., 1996; CHRISTIANSEN et al., 1994).
	Quando receptores celulares de reconhecimento de padrão (PPRs, do inglês Pattern Recognition Receptors) detectam o HPV, isso desencadeia a ativação da resposta imunológica inata, e posteriormente da resposta imunológica adaptativa. As lesões cervicais de baixo grau na maioria dos casos tem resolução espontânea, fato decorrente principalmente da resposta mediada por linfócitos T (SANTOS et al, 2017). 
	As células NK atuam na resposta imunológica inata e diferem funcionalmente das células características da resposta adaptativa por reagirem de maneira rápida, em poucas horas, durante a invasão do organismo por patógenos. Além disso, não necessitam do processo de maturação e seleção realizado no timo para serem ativadas. Pacientes com ausência de células NK, ainda que apresentem a resposta adaptativa funcional, sofrem com infecções virais persistentes. Estas reconhecem células infectadas, transformadas ou transplantadas pela “ausência ou presença” das moléculas HLA em sua superfície, e exercem sua atividade citotóxica. Além disso, as células NK ainda secretam citocinas e quimiocinas, promovendo uma resposta inflamatória, de modo a exercer um controle regulatório na resposta imune adaptativa (MORETTA et al., 2014; PARHAM, 2005).
	Segundo O’Connor, Hart e Gardiman (2006, p.4) as células NK tem muitos receptores para o HLA classe I, tais como KIR e NKG2D, os quais podem enviar tantos sinais positivos, de forma a ativar a atividade citotóxica das células NK, quanto negativos de modo evitar a lise de células saudáveis. Estes sinais dependem da presença dos ligantes HLA de classe I. Em circunstâncias normais, a expressão dos genes HLA mantém a tolerância das células NK, de modo a evitar a morte celular indesejada, porém, em certas situações, como por exemplo, uma infecção viral, a expressão de HLA é alterada, de modo a libertar as células NK dos sinais inibitórios, dando ínicio aos seus efeitos citotóxicos. .. . ,
	Os ligantes para os receptores KIR são as moléculas HLA de classe I, em especial as moléculas HLA-C, as quais se enquadram em dois grupos atípicos referidos como HLA-C1 e HLA-C2, podendo ser assim classificados, respectivamente, pela presença do aminoácido Asparagina ou Lisina na posição 80 (BIASSONI et al., 1994). Nem todas as moléculas HLA-B e HLA-A são ligantes para os receptores KIR, e dentre as moléculas HLA-B apenas as que expressam o epítopo Bw4 possuem afinidade pelo receptor de célula NK (CELLA et al, 1994). 
	As moléculas HLA-B e HLA-C, cujos alelos codificadores são pertencentes aos grupos HLA-C1/C2 e Bw6/ Bw4, possuem afinidade diferencial com os receptores KIR. O grupo codificado por alelos HLA-C1 interage mais fortemente com os receptores KIR2DL2 e KIR2DL3 (ambos inibidores), enquanto C2 possui uma maior interação com os receptores KIR2DL1 (inibidor) e KIR2DS2 (ativador). Moléculas pertencentes ao grupo Bw4 com uma Isoleucina na posição 80, se liga ao KIR3DL1 realizando uma maior inibição na lise mediada pelas células NK do que moléculas Bw4 com uma Isoleucina em 80. (KULKARNI et al, 2008)
	O presente trabalhotem como objetivo geral investigar a associação de neoplasias intraepiteliais cervicais com o polimorfismo dos genes HLA-B e HLA-C, responsáveis por codificar proteínas celulares envolvidas com a resposta imunológica ao HPV. Os objetivos específicos da pesquisa são: comparar as frequências alélicas dos genes HLA-B e HLA-C entre mulheres com NIC (casos) e sem lesão (controles), e comparar a frequência de alelos pertencentes aos grupos HLA-C1/ C2 e HLA-Bw4/ Bw6 nesta população. Estudos como este podem contribuir com a hipótese de uma associação de certos genótipos com uma maior susceptibilidade, ou maior proteção às lesões pré-câncer, fato que pode ocorrer tanto pela ligação aos peptídeos virais do HPV, quanto pela tendência de ativação das células Natural Killer.
REVISÃO DA LITERATURA
Câncer de colo de útero e HPV
	O CCU é o terceiro tumor maligno mais frequente na população feminina (atrás apenas do câncer de mama e colorretal), sendo a quarta maior causa de morte de mulheres por câncer no Brasil. Estimativas brasileiras para o ano de 2020 sugerem a incidência de 16.590 novos casos no ano, dentre estes, 990 apenas no estado do Paraná (INCA, 2020). A infecção pelo Papilomavírus Humano é considerada como um pré-requisito para o desenvolvimento de NICs e CCU (PRENDVILLE E DAVIES, 2004). A transmissão deste vírus geralmente ocorre através do contato com a mucosa infectada, principalmente pelo ato sexual (BURCHELL et al., 2006).
	As lesões cervicais precursoras do CCU, de acordo com o sistema de nomenclatura de Bethesda (1998), podem ser classificadas a partir de exame histopatológico como neoplasia intraepitelial de grau I (baixo grau), II e III (alto grau). 
	A prevenção primária do câncer de colo de útero está relacionada à diminuição do contágio pelo HPV, e pode ser feita através da vacina tetravalente contra o HPV, ofertada gratuitamente pelo Ministério da Saúde para meninas e meninos de até 14 anos. Porém mesmo as mulheres vacinadas devem fazer exames preventivos periodicamente, visto que a vacina não protege contra todos os tipos oncogênicos do vírus, mas apenas os quatro tipos mais prevalentes: 6, 11, 16 e 18 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2020).
	Os papilomavírus possuem tropismo por células epiteliais e está presente na pele e mucosa de vários animais. Os HPVs que afetam as mucosas e genitais podem ser classificados em dois grupos levando em conta o potencial carcinogênico: o de baixo risco (HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72 e 81), e de alto risco (HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 e 82) (PRENDVILLE E DAVIES, 2004).
	A infecção por HPVs de baixo risco pode causar proliferação celular local, levando ao desenvolvimento de verrugas e condilomas, no entanto, a maior parte desses tumores benignos regride espontaneamente (PRENDVILLE E DAVIES, 2004). Já a infecção por HPV de alto risco poderá progredir para o câncer, e este precedido por uma longa fase de doença pré-invasiva caracterizada por graus variados de displasia e neoplasia intraepitelial cervical (NIC I, NIC II e NIC III). A progressão vai depender de diversos cofatores como, por exemplo, o início precoce da atividade sexual, uso de contraceptivos hormonais, tabagismo, susceptibilidade genética, tipo do HPV, co-infecções por outros patógenos, e a presença de doenças que podem afetar a resposta imunológica dos indivíduos (WALBOOMERS et al., 1999).	A maior parte das pessoas sexualmente ativas serão infectadas por HPV durante a vida, porém, a grande maioria das infecções são rapidamente resolvidas pelo sistema imunológico (SCHIFFMAN et al., 2011), 
	O HPV pertence à família Papilomaviridae, e apresenta um genoma com aproximadamente 8Kb em uma dupla fita de DNA circular. Conserva três oncogenes (E5, E6 e E7) que codificam proteínas envolvidas com a estimulação da proliferação celular, imortalização e transformação das células do hospedeiro. Apresenta também genes E1 e E2, responsáveis por modular a transcrição e replicação viral, e os genes L1 e L2 responsáveis por codificar proteínas que constituem o capsídeo viral. Existem fortes evidências que as mutações nos genomas do HPV são eventos raros (VILLIERS et al., 2004).
	O ciclo do HPV está ligado ao programa de diferenciação da célula do hospedeiro. A infecção ocorre pela penetração do vírus através de microlesões, as quais expõem a camada basal do epitélio de modo a permitir que o vírus infecte as células. Quando isto ocorre, a expressão dos genes virais é ativada. As proteínas E1 e E2, responsáveis por modular a replicação, são essenciais para este passo. Posteriormente ocorre a síntese de proteínas do capsídeo, a montagem e liberação do vírus nas camadas suprabasais (LONGWORTH e LAIMINS, 2004; GEORGESCU et al., 2018). 
	A carcinogênese é mediada pelos oncogenes já citados. As proteínas E6 estão presentes no núcleo e citoplasma, e possuem a habilidade de induzir a formação de um complexo com a enzima ubiquitina-ligase e p53, resultando na ubiquitinação e degradação da p53, o que suprime a resposta da proteína p53 aos danos no DNA. Já as proteínas E7 estão majoritariamente no núcleo e tem a habilidade de inativar as proteínas retinoblastoma (Rb), p21 e p27, importantes na regulação do ciclo celular, de modo a alterar o ciclo e permitir que a célula entre na fase S. Normalmente, após esta alteração feita por proteínas E7, a p53 atuaria levando a apoptose da célula, mas como já mencionado, esta proteína é inibida pela ação da E6, o que leva a uma multiplicação descontrolada das células alteradas (LONGWORTH e LAIMINS, 2004; GEORGESCU et al., 2018; ZUR HALSEN 2002; MARULLO et al., 2015).
	A alta incidência de infecção por HPV em indivíduos imunocomprometidos é uma forte evidência da importância de uma resposta imune adequada para evitar a progressão. A susceptibilidade genética também teria grande impacto no câncer de colo de útero, visto que mulheres com histórico familiar são mais sujeitas ao desenvolvimento da doença devido a uma menor capacidade em combater a infecção (PRENDIVILLE e DAVIES, 2004; MAGNUSSON e GYLLENSTEN, 2000). 
	Quando receptores celulares de reconhecimento de padrão (PPRs, do inglês Pattern Recognition Receptors) detectam o HPV, isso desencadeia a ativação da resposta imunológica inata, e posteriormente da resposta imunológica adaptativa. As lesões cervicais de baixo grau na maioria dos casos tem resolução espontânea, fato decorrente principalmente da resposta mediada por linfócitos T, resposta esta que depende da apresentação dos peptídeos antigênicos mediada por proteínas HLA (SANTOS et al, 2017).
Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) em Humanos (HLA)
	Os linfócitos T, células do sistema imunológico, são essenciais para a resposta contra o HPV, e reconhecem antígenos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs) através de receptores denominados TCRs (T cell receptor). A capacidade destas células de apresentarem peptídeos antigênicos irá depender da presença de proteínas especializadas, codificadas por genes presentes no Complexo Principal de Histocompatibilidade, em humanos denominado HLA (Human Leukocyte Antigens). Os genes que codificam as moléculas HLA são altamente polimórficos e polialélicos, e estão localizados no braço curto do cromossomo 6, região que possui mais de 220 genes codificadores de proteínas, em sua grande maioria relacionadas a resposta imunológica. Como já citado, o genótipo do hospedeiro influencia na persistência do HPV no organismo, e um dos fatores genéticos mais importantes é o polimorfismo dos genes HLA. (CHRISTIANSEN et al., 1994; TORRES e MORAES, 2011; MACIAG e VILLA, 1999).
	O MHC é dividido em três classes: I,II e III. A região de classe I possui genes que codificam as moléculas HLA-A, -B e –C, referidas como clássicas. Estas moléculas estão presentes em todas as células nucleadas, e tem função de apresentar peptídeos aos linfócitos T citotóxicos (CD8+). Existe também um sub-grupo de genes HLA de Classe I, referidos como não- clássicos (HLA-G, HLA-E e HLA-F) , cujos produtosparticipam de outras funções específicas, como por exemplo, a proteína HLA-G que está envolvida na indução da tolerância entre o sistema imunológico materno e o feto. Na região de classe II situam-se os genes que codificam as moléculas HLA-DR, -DQ e –DP, responsáveis por apresentar peptídeos aos linfócitos T auxiliares (CD4+). Já os genes da região de classe III, codificam várias moléculas envolvidas com a resposta imunológica do organismo, como por exemplo, o fator de necrose tumoral e componentes do sistema complemento (ALVES et al., 2006; BRENOL et al, 2012).
	Devido ao fato dos genes HLA serem altamente polimórficos, foi necessário um sistema de nomenclatura para diferencia-los. A atual Nomenclatura dos Fatores do Sistema HLA segue regras estabelecidas em Setembro de 2008, durante uma reunião do comitê de nomenclatura realizada no 15º Workshop Internacional de Histocompatibilidade, em Búzios (RJ). Estas regras foram implantadas em Abril de 2010. Na atual nomenclatura é possível observar separados por delimitadores: o grupo de alelos, a proteína específica, presença de mutação sinônima, e os polimorfismos na região intrônica. A forma de expressão de determinados alelos pode ser sinalizadas por determinados sufixos, como por exemplo, o sufixo N (null) que indica que o gene não codifica produtos proteicos; L (low) para genes que codificam proteínas de baixa expressão; S (secreted) para indicar codificação de uma molécula na forma solúvel; C (cytoplasm) é usado para quando os produtos estão expressos no citoplasma da célula; A (aberrant) para indicar que há dúvidas sobre onde ocorre a expressão; e Q (de questionable) indica que é indefinido, ou seja, sem definição se a mutação gera ou não modificação na expressão (Figura 1) (TORRES e MORAES, 2011).
Figura 1 Nomenclatura dos genes HLA
Extraído de: TORRES E MORAES, 2011.
	Para resolver ambiguidades na nomenclatura de alelos com diferenças encontradas fora da região codifica a fenda de ligação do peptídeo, foram criados os códigos P e G. O código P é utilizado para agrupar alelos que possuem a sequencia de nucleotídeos diferentes, mas que resultam em proteínas idênticas no sítio de reconhecimento antigênico (SRA), e o código G para agrupar os alelos que possuam a mesma sequência de nucleotídeo para os éxons codificadores do SRA (TORRES e MORAES, 2011).
Células NK e classificação dos ligantes KIR
	As células Natural Killer (NK) e os linfócitos T CD8+ têm muito em comum: marcadores na superfície celular, secreção de citocinas e funções efetoras citotóxicas. No entanto, as células NK reagem rapidamente aos patógenos, enquanto que os linfócitos T podem demorar dias, devido à dependência do processo de ativação e diferenciação que estes passam antes de se tornarem efetores (PARHAM, 2006).
	Nos anos 90, novas categorias de receptores para as moléculas HLA de classe I foram descobertas, estes receptores estavam presentes principalmente na superfície das células NK e foram denominados KIR e NKG2D. Os sinais desencadeados por eles podem ser de ativação ou inibição e, controlam as respostas das células NK. Resposta esta que deve ser de tolerância às células saudáveis e citotoxidade contra células alteradas, de modo a manter a homeostase (PARHAM, 2005). 
	Células NK requerem sinais inibitórios das moléculas HLA de Classe I para prevenir a morte de células saudáveis, estes sinais são passados via receptores KIR e CD94/NKG2D. Durante infecções por patógenos a expressão dos genes HLA é alterada, o que leva a ativação das células NK. Esta ativação ocorre tanto pela diminuição dos sinais inibitórios, quanto pelo aumento dos sinais de ativação desencadeados por moléculas HLA nos receptores de célula NK, e resulta no efeito citotóxico de induzir apoptose em células infectadas ou alteradas (O’CONNOR; HART; GARDINER, 2006).
	A família genica KIR consiste em quinze genes e dois pseudogenes localizados numa região do cromossomo 19q13.4. Os ligantes para os receptores KIR são as moléculas HLA de classe I (HLA-A, B e C). Os receptores codificados por esses genes podem desencadear tanto sinais inibitórios quanto de ativação. As interações entre receptores KIR e moléculas HLA são importantes para o funcionamento das células NK, e existem diversos trabalhos demonstrando associação entre estes dois genes com lesões precursoras do CCU (SONG et al 2013; RIZZO et al, 2014; MARAGON et al, 2013) .
	Como os genes HLA e KIR estão presentes em cromossomos diferentes, existem indivíduos cujos produtos dos genes KIR não se ligam em nenhuma molécula HLA de Classe I. A posição 44 do domínio D1 de KIR que determina qual molécula HLA estes receptores irão interagir, e as caudas intracitoplasmáticas curtas ou longas definem sua atividade funcional inibidora ou ativadora. Moléculas KIR com caudas longas (L) apresentam imunorreceptores com características inibitórias baseadas em tirosina (ITIM), e moléculas KIR de cauda curta (S) liberam sinais ativadores por intermédio de imunorreceptores ativadores baseados em tirosina (ITAM) (Figura 2) (BIASSONI et al., 1995; KULKARNI et al, 2008; KHAKOO et al, 2004; JOBIM e JOBIM, 2008; MAEDA et al, 2012). 
Figura 2 Receptores KIR com cauda curta (S) e cauda longa (L) e seus efeitos bioquímicos
Extraído de: MAEDA et al. 
Moléculas KIR com caudas longas (L) apresentando imunorreceptores com características inibitórias (ITIM), e moléculas KIR de cauda curta (S) com imunorreceptores (ITAM)
	É possível classificar o HLA-C em dois grupos distintos a partir de um dimorfismo no aminoácido da posição 80 da alfa-hélice: grupo 1 (HLA-C1), que possui uma Asparagina (N) nesta posição, e grupo 2 (HLA-C2), que possui Lisina (K). A distinção entre os grupos HLA-B pode ser feita a partir do aminoácido da posição 80, sendo que, o alótipo –Bw6 possui pouca ou nenhuma afinidade por KIR, e o alótipo –Bw4 (definido pelos epítopos IALR, TLLR, ou TALR nos resíduos 80-83) tem afinidade por KIR. A modulação da expressão de alelos HLA responsáveis por codificar moléculas responsáveis por desencadear sinais ativadores ou inibidores via receptores KIR, permite que a atividade citotóxica das células NK seja controlada. A análise focada no aminoácido da posição 80, relevante para definir a afinidade da interação KIR/HLA, é um método de boa sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade (BAO et al, 2018; KULKARNI et al., 2008; MORETTA et al, 1995; O’CONNOR; HART; GARDINER, 2006; UGLOTTI et al, 2011).
	Já foi demonstrada uma associação negativa entre o CCU e o genótipo KIR3DL1 em combinação com seu ligante HLA-Bw4, e com o genótipo KIR2DL1 com o ligante HLA-C2 (Lys80). Ambas as combinações associadas são inibitórias. (CARRINGTON et al, 2005).
	As moléculas HLA-B e HLA-C, cujos alelos codificadores são pertencentes aos grupos HLA-C1/C2 e Bw6/ Bw4, possuem afinidade diferencial com os receptores KIR. O grupo codificado por alelos HLA-C1 interage mais fortemente com os receptores KIR2DL2 e KIR2DL3 (ambos inibidores), enquanto C2 possui uma maior interação com os receptores KIR2DL1 (inibidor) e KIR2DS2 (ativador) Já as moléculas pertencentes ao grupo Bw4 com uma Isoleucina na posição 80, se liga ao KIR3DL1 realizando uma maior inibição na lise mediada pelas células NK do que moléculas Bw4 80-I (Figura 3) (KULKARNI et al, 2008)
Figura 3 Alelos pertencentes aos grupos HLA-C1/C2 e Bw6/ Bw4 e interação com genes KIR.
Adaptado de: KULKARNI et al., 2008 
As flechas vermelhas indicam interações mais fracas do que as flechas azuis, e a interação entre o KIR3DL1 e Bw4-80I (azul escuro) é mais forte do que com Bw4-80T
	Na figura 4 é possível observar o grupo de receptores KIR e seus ligantes de acordo com seu efeito na célula NK. Como já mencionado, a vigilância imunológica dessa célula é realizada através do aumento da expressão dos ligantes que desencadeiam sinais ativadores, ou então, pela perda da expressão de ligantes que desencadeiam sinais inibitórios (RALINGAM, 2016). 
Figura 4 Receptores inibitórios KIR e seus ligantes HLA
Adaptado de: RAJALINGAM, 2016
Receptores inibitórios(ITIM) em roxo, e receptores ativadores (ITAM) em laranja, com os seus respectivos ligantes.
MATERIAIS E MÉTODOS
AMOSTRAS
Os casos utilizados no trabalho são pacientes do Hospital Central de Câncer Erasto Gaertner (HCCEG) com diagnostico histopatológico confirmado de neoplasia intraepitelial cervical de grau II (NIC II) e III (NIC III), e os controles incluem mulheres não portadoras de NICs, selecionadas randomicamente em campanhas de prevenção ao câncer cervical do HCCEG. Todos os indivíduos da coorte tiveram 10mL do sangue periférico coletados através de punção venosa. Casos e controles foram coletados no mesmo período (2010 a 2012), e todas as mulheres incluídas neste estudo assinaram um termo de consentimento. O estudo está aprovado pelo comitê de Ética e Pesquisa em seres Humanos do Hospital Erasto Gaertner sob o número 1943/2009. 
GENOTIPAGEM
As amostras foram genotipadas através do método PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probes), que se baseia na amplificação do DNA amostral e sua hibridização com sondas de oligonucleotídeos sequência-específicas (XAVIER, 2012). Os resultados obtidos nas análises laboratoriais, foram apresentados em teses e dissertações desenvolvidas no Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade (LIGH), do departamento de Genética-UFPR. 
O gene HLA-C foi genotipado por Marina Bárbara de Souza Xavier e os resultados foram apresentados em sua tese de mestrado (XAVIER, 2012), enquanto que o gene HLA-B foi tipado pela doutoranda Patrícia Pinho França, que apresentou os resultados na sua tese em 2012 (FRANÇA, 2012). 
Para aumentar o tamanho amostral, também foram utilizados 27 controles tipados para os genes HLA-C e HLA-B pelo método NGS (Next Generation Sequencing), cedidas por colaboração com o Dr. Danilo Gardenal Augusto (University of California, San Francisco). 
Os dados brutos, obtidos através do processamento laboratorial pelo método PCR-SSOP (XAVIER, 2012; FRANÇA, 2012), foram recuperados no banco de dados do LIGH-UFPR e passaram por uma nova análise computacional no Software HLA Fusion versão 4.3, cuja função é analisar as combinações de sondas positivas para a amostra e fornecer as possibilidades de combinações alélicas (genótipo). Foram analisadas computacionalmente 302 amostras de HLA-B (159 casos e 143 controles) e 410 de HLA-C (203 casos e 207 controles) em alta resolução, ou seja, quatro dígitos. 
	Levando em conta que o HLA Fusion oferece uma gama de possibilidades de genótipos, foi necessária seleção de genótipo entre os possíveis. Para tanto. Foram utilizados os critérios descritos a seguir. No caso de amostras genotipadas pelas técnicas PCR-SSOP e NGS, foi utilizada a genotipagem obtida por NGS, por ser um método mais sensível. Amostras genotipadas para HLA-C e HLA-B (n= 215) foi verificado o desequilíbrio de ligação entre as variantes alélicas dos dois genes, para encontrar possíveis discrepâncias na genotipagem e verificar qual o haplótipo mais provável entre as possibilidades genotípicas obtidas. A análise baseada no desequilíbrio de ligação foi feita utilizando a tabela Haplotype Frequencies do National Marrow Donnor Program (NMDP), e a ferramenta de busca de haplótipo do website The allele Frequency Net Database (AFND), que levam em conta a frequência em que as variantes alélicas são herdados juntos. No restante das amostras o alelo mais frequente, indicado pelo HLA Fusion, foi considerado. Amostras com ambiguidade alélica, ou cuja aferição de alelo não foi possível pelos meios utilizados, foram utilizadas apenas na análise de grupos ligantes KIR.
	Para a definição de C1/ C2 e Bw4/ Bw6 (T/I), foi necessário identificar em cada amostra, no Software HLA Fusion, qual(is) sonda(s) foi positiva na posição 80, e qual o aminoácido contemplado pela sonda. Na análise do HLA-C as sondas que contemplavam a posição 80 da cadeia poderiam representar uma Asparagina (N), indicando que a amostra possuía um ligante C1, ou uma Lisina (K), indicando um ligante C2 (Quadro 1). 
Quadro 1 Sondas que hibridizam com a posição 80 do HLA-C e o aminoácido correspondente.
	Sonda Hibridizada
	Aminoácido da posição 80
	#007 (C413) : 75-VS-RN—82
	Asparagina (N)
	#015 (B116) : 79RN---83
	Asparagina (N)
	#019 (C414): 80K---83
	Lisina (K)
	#020 (C412): 75-V--RK-81
	Lisina (K)
	#063 (C602G): [32---Q---38 + 77--RK-81]
	Lisina (K)
	#097 (C759G) : [65Q-Y-RQ70 + 77--RK-81]
	Lisina (K)
	#507 (C413): 75-VS-RN—82
	Asparagina (N)
	#515 (B116) : 79RN---89
	Asparagina (N)
Fonte: HLA Fusion Versão 4.3
Aminoácidos destacados em negrito correspondem à posição 80
	Já na análise do HLA-B, além das sondas da posição 80, também foram consideradas as da posição 81, 82 e 83, de modo a definir Bw4 pelos epítopos IALR, TLLR, ou TALR nos resíduos 80-83, (BAO et al, 2018), e categoriza-los em Bw4 80I, Bw4 80T, ou Bw6 pela ausência dos epítpos citados.	Nem todas as sondas de HLA-B possuíam os aminoácidos da posições 80-83 claramente no HLA Fusion, alguns aminoácidos são representados pelo hífen (-), nesses casos foi necessário fazer o alinhamento de todas as possibilidades alélicas da sonda. O alinhamento foi feito com auxílio da ferramenta Allign do IPD-IMGT/ HLA 3.41.0, e nele foi possível definir qual aminoácido a sonda estava representando (com exceção da sonda 526) (Quadro 2). Amostras que positivaram para a sonda 526 (n= 76 casos e 84 controles), ou que foram genotipados por NGS (n= 27 controles), ao invés de ter a classificação definida diretamente pela bead, passaram por dupla checagem através do alinhamento das possibilidades alélicas utilizando a ferramenta do IPD-IMGT/ HLA 3.41.0.
Quadro 2 Sondas que hibridizam com o resíduo 80-83 do HLA-B e os aminoácidos correspondentes 
	Sonda
	Aminoácido 80
	Aminoácido 81
	Aminoácido 82
	Aminoácido 83
	Classificação
	#004 (B115): 80-ALR--85
	Treonina (ACC)
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80T
	#073 (B154): 78-RN--(-/D)83 
	Asparagina
	Leucina (CTG)
	Arginina (CGC)
	Aspartato
	Bw6
	#081 (B204G) : [66IC-68 + 79RIALR83]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#515 (B117): [75-ED77 + 79R--LR--85]
	Treonina (ACC)
	Leucina (CTG)
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80T
	#519 (B153) : 78-RIALR83
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#526 (B112G) : [72--Y-E-77 + 81ALR--85]
	Treonina/ Isoleucina (ATC/ ACC)
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 
	#528 (B422G) : [67S-TN70 + 77S-RN-81]
	Asparagina
	Leucina (CTG)
	Arginina (CGC)
	G (GGC)
	Bw6
	#554 (B199G) : [62R--QI66 + 79RIALR83]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#581 (B200) : [62RN-QI66 + 79RIALR83]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#593 (B226G) : [42-PRK---48 + 79RIALR-84]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#600 (B284G) : [42-PR-A-47 + 78-RIAL82]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina (CGC)
	Bw4 80I
Fonte: HLA Fusion Versão 4.3
Aminoácidos da posição 80-83 estão destacados em negrito nas sondas. Aminoácidos em vermelho foram obtidos por alinhamento
	Para verificar a confiabilidade dos resultados obtidos, e detectar possíveis erros na genotipagem, foi calculado o Equilíbrio de Hardy-Weinberg das amostras utilizando o grupo ligante KIR e os alelos definidos. O cálculo foi feito pelo programa Genalex v. 6.51b2, e alelos com frequência menor que 3% foram agrupados em uma única categoria, de modo a evitar que genótipos raros levassem ao desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (conforme utilizado em BOOSLOPER, 2020). 
	Como na primeira análise as frequências genotipícas da amostra controle não se encontravam em equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi necessário revisitar os dados de todas as amostras no HLA Fusion v. 4.3 via acesso remoto.
ANÁLISE ESTÁTISTICA 
	Para a análise de associação, após contagem direta, os dados foram organizados em tabela 2x2 de número de portadores e não-portadores dos alelos nos casos e controles, e o software Rstudio v. 1.3.1056 foi utilizado para a análise estatística. Grupos ligantes KIR e alelos com frequência de portadores maior que 3%, em no mínimo um dos grupos, passarampelo teste qui-quadrado (X²) com grau de liberdade 1, para observar diferenças significativas entre casos e controles. Foi calculado o OR (Odds ratio) de alelos que obtiveram diferenças significativas no teste qui-quadrado (p<0,05), ou cujo valor de p foram próximos do nível de significância (p<0.07). Nos casos possíveis, também foi realizada análise considerando a presença de dois grupos simultaneamente (Ex: C1+Bw4 80I).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. HLA-B e grupos Bw4/ Bw6
	Após a exclusão de dados onde não foi possível inferir o genótipo, restaram 312 amostras para a análise alélica de HLA-B (n= 155 controles e 157 pacientes), e 319 amostras para a análise do grupo Bw (n =164 controles e 158 pacientes). A amostra mostrou-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg, tanto para frequências genotípicas (p= 0.481 para controle e p=0.227 para os casos), quanto para a frequência dos epítopos Bw6/ Bw4 80I/ Bw4 80T (p= 0.976). O alelo com maior número de portadores foi o HLA-B*51:01 para casos (n=31) e controles (n= 27).
	Os resultados da análise de associação são apresentados na tabela 1. Na análise estatística foi encontrada associação negativa entre NICs e a presença do alelo HLA-B*35:05 (OR: 0.44, IC 95% (0.21-0.89], p= 0.02) (TABELA 1). Nas teses que utilizaram apenas as amostras genotipadas por SSOP e cuja a definição dos alelos não foi feita baseando-se na frequência haplotípica entre HLA-B e HLA-C, esta associação não foi encontrada, porém foi encontrada associação significativa com o HLA-B*39 (BOSLOOPER, 2020; FRANÇA, 2012). 
	Os alelos HLA-B*07:02 e HLA-B*14:02 não apresentaram diferença significativa no teste qui-quadrado (p= 0.06 para ambos), porém quando calculado o Odds Ratio, um método mais preciso, foi possível encontrar uma associação de risco com HLA-B*07:02 (OR: 2.05, IC 95% [1.03-4.11], p= 0.04), e de proteção com HLA-B*14:02 (OR: 0.39, IC 95% [0.16-0.97], p=0.04). 
Tabela 1 Análise de asssociação entre a presença de variantes alélicas de HLA-B e NIC II/III
	Grupo
	 Casos (n= 155)
	 Controles (n= 157)
	p-value (X²)
	OR (CI: 95%)
	
	Portadores
	Não portadores
	Portadores
	Não portadores
	
	
	HLA-B*07:02
	26
	129
	14
	143
	0.05662
	2.045 [1.0306-4.1125] (p= 0.040)
	HLA-B*08:01
	14
	141
	11
	146
	0.6524
	
	HLA-B*14:01
	5
	150
	1
	156
	0.2104
	
	HLA-B*14:02
	7
	148
	17
	140
	0.06018
	0.38950 [0.1568-0.9677] (p= 0.0426)
	HLA-B*15:01
	5
	150
	7
	150
	0.7858
	
	HLA-B*15:03
	5
	150
	3
	154
	0.7065
	
	HLA-B*18:01
	7
	148
	12
	145
	0.3585
	
	HLA-B*27:05
	12
	143
	8
	149
	0.4696
	
	HLA-B*35:01
	13
	142
	27
	130
	0.03092
	0.4408 [0.2182-0.8904] (p=0.0224)
	HLA-B*35:03
	10
	145
	4
	153
	0.164
	
	HLA-B*38:01
	6
	149
	6
	151
	1
	
	HLA-B*40:01
	5
	150
	4
	153
	0.9844
	
	HLA-B*40:02
	10
	145
	8
	149
	0.7865
	
	HLA-B*44:02
	17
	138
	12
	145
	0.4144
	
	HLA-B*44:03
	11
	144
	11
	146
	1
	
	HLA-B*45:01
	6
	149
	7
	150
	1
	
	HLA-B*50:01
	9
	146
	6
	151
	0.5791
	
	HLA-B*51:01
	31
	124
	27
	130
	0.6236
	
	HLA-B*52:01
	5
	150
	13
	144
	0.09459
	
	HLA-B*53:01
	7
	148
	10
	147
	0.6372
	
	HLA-B*57:01
	8
	147
	5
	152
	0.555
	
	HLA-B*58:01
	5
	150
	7
	150
	0.7858
	
	HLA-B*15:04
	4
	151
	4
	153
	1
	
	HLA-B*13:02
	4
	151
	9
	148
	0.2671
	
	HLA-B*35:02
	0
	155
	5
	152
	0.07362
	 
Fonte: A autora (2020)
	Apesar de Carrington et al (2005) terem relatado que a presença de alelos HLA-Bw4 confere proteção as lesões cervicais (OR: 0.71, p= 0.02), não foi encontrada diferenças estatisticamente significantes na análise de associação da presença de epítopos Bw, como visto na tabela 2, possivelmente pelo baixo número amostral.
Tabela 2 Análise de associação do epítopo Bw 
	Grupo
	 Casos (n= 155)
	 Controles (n= 157)
	p-value (X²)
	
	Portadores
	Não portadores
	Portadores
	Não portadores
	
	Bw6
	130
	28
	141
	26
	0.7099
	Bw4 80I
	70
	88
	68
	99
	0.5883
	Bw4 80T
	37
	121
	49
	118
	0.2783
	Bw4 80I/ Bw4 80 I
	8
	150
	5
	162
	0.5039
	Bw4 80T/ Bw4 80 T
	9
	149
	10
	157
	1
	Bw4 / Bw4
	28
	130
	25
	142
	0.6025
	Bw6/ Bw6
	57
	101
	61
	106
	1
Fonte: A autora
2. HLA-C e grupos C1/ C2
	O alelo mais frequente entre para pacientes e controles foi o HLA-C*04:01. A amostra controle de HLA-C, assim como a de HLA-B, se mostrou em equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), tanto para as frequências genotípicas (p= 0.163) quanto para os aminoácidos da posição 80 (p=0,105). Porém, quando calculado o EHW na frequência genotípica dos casos, a amostra não se mostrou em equilíbrio (p= 0.017), este fato pode ser devido a seleção atuante no genótipo, ou por erro na genotipagem. Na análise estátistica foi encontrada uma associação de risco com o alelo HLA-C*03:04 (OR= 2.24, CI 95% [1.12-4.13], p= 0.01) (Tabela 3).
Tabela 3 Resultado da análise de associação dos alelos HLA-C 
		Alelo
	
	Casos (n= 195)
	Controles (n= 223)
	p-value
(X²)
	Odds Ratio (CI: 95%)
	
	Portadores
	Não portadores
	Portadores
	Não portadores
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	HLA-C*01:02
	7
	188
	13
	210
	0.4005
	
	HLA-C*02:02
	18
	177
	19
	204
	0.9342
	
	HLA-C*03:03
	18
	177
	20
	203
	1
	
	HLA-C*03:04
	32
	163
	18
	205
	0.0135
	2.2359 [1.2112-4.1273] (p=0.0101)
	HLA-C*04:01
	51
	144
	73
	150
	0.1731
	
	HLA-C*05:01
	18
	177
	23
	200
	0.8363
	
	HLA-C*06:02
	28
	167
	33
	190
	1
	
	HLA-C*07:01
	35
	160
	43
	180
	0.8233
	
	HLA-C*07:02
	38
	157
	40
	183
	0.7795
	
	HLA-C*08:02
	18
	177
	22
	201
	0.9574
	
	HLA-C*12:03
	20
	175
	21
	202
	0.9021
	
	HLA-C*14:02
	11
	184
	7
	216
	0.3098
	
	HLA-C*15:02
	19
	176
	21
	202
	1
	
	HLA-C*16:01
	22
	173
	23
	200
	0.8725
	
	HLA-C*17:01
	11
	184
	12
	211
	1
	
	HLA-C*12:02
	3
	192
	7
	216
	0.4548
	
FONTE: A autora (2020)
	No trabalho realizado em 2012, essa associação com HLA-C*03:04 não tinha sido feita, e os alelos HLA-C*05:01, HLA-C*07:01P, HLA-C*07:02P e HLA-C*23:02 foram associados à susceptibilidade (XAVIER, 2012). Essa discrepância nos resultados pode ser derivada do procedimento diferente utilizado na definição dos alelos, visto que no presente trabalho foi realizado o pareamento de HLA-C e HLA-B para imputação alélica, ou também do fato de terem sido adicionadas 27 amostras genotipadas por NGS para aumentar o tamanho amostral. A análise conduzida por Song et al (2013), feita a partir de um total de 159 mulheres com NIC e 132 controles saudáveis, apontou uma associação com os alelos C*01 (OR=0.56) e C*0303 (OR=1.89) na população coreana.	
	Na análise de associação entre grupos C1/ C2 (Tabela 4), apesar de não ter sido encontrada diferença significativa entre os grupos no teste qui-quadrado, a presença do genótipo C1/ C1 foi maior nos casos do que nos controles (OR= 1.54, CI 95% [1.01-2.34], p= 0.05), sugerindo que este genótipo poderia conceder risco à infecção por HPV. O resultado corrobora com a metanálise de Carrington et al. (2005), onde a presença de HLA-C2 foi associada a proteção (OR: 0.65, p= 0.024), e a presença HLA-C1 associada ao risco de desenvolver a doença (OR: 2.14, p= 0,02). Já foi encontrada em outro trabalho uma associação negativa entre NIC causadas por HPV 16 e homozigotos C1, porém a associação foi restrita a portadores dos genes KIR2DL2 (OR: 0,67, p=0.00045) e KIR2DS2 (OR: 0.69, p= 0.0006) (BAO et al., 2019).
Tabela 4 Resultado da análise de associação entre grupos ligantes KIR e NIC
	Grupo
	 Casos (n= 198)
	 Controles (n= 232)
	p-value (X²)
	OR (CI: 95%)
	
	Portadores
	Não portadoresPortadores
	Não portadores
	
	
	C1 (Asp80)
	158
	40
	179
	53
	0.5851
	
	C2 (Lys80)
	134
	64
	168
	64
	0.3345
	
	C1 / C1
	65
	133
	56
	176
	0.05877
	1.5360 [1.0068-2.3433] (p = 0.0464)
	C2/C2
	40
	158
	45
	187
	0.9302
	
Fonte: A autora (2020)
3. Análise Haplotípica e Pareamento C1/C2 + Bw4/ Bw6
	A partir da frequência em que os alelos HLA-B e HLA-C são herdados em conjunto, foi possível inferir o genótipo de 215 das 227 amostras que possuíam ambos os genes tipados. 
	Na análise estatística da amostra pareada (Tabela 5) foi encontrada uma associação entre a presença simultânea de ligantes C1 ligantes Bw6 com a susceptibilidade a NIC II/ III (OR: 2.56, ÍC 95% [1.69-4.05], p= 0.0001). A associação de risco com C1/ Bw6 corrobora indiretamente com o resultado do estudo de Carrington et al. (2005), onde a presença simultânea de Bw4 e C2 foi associada a proteção (OR=0.56, p= 0.002)
Tabela 3 Análise de associação entre ligantes de receptor KIR e NIC II/ III
	Grupo
	 Casos (n= 92)
	 Controles (n= 123)
	p-value (X²)
	OR (IC 95%)
	
	Portadores
	Não portadores
	Portadores
	Não portadores
	
	
	C1/ Bw6
	67
	25
	68
	55
	0.008468
	2.5618 [1.691- 4.0534] p= 0.0001
	C1/ Bw4 80T
	15
	77
	20
	103
	0.9931
	
	C1/ Bw4 80I
	33
	59
	33
	90
	0.155
	
	C2/ Bw6
	54
	38
	61
	62
	0.1855
	
	C2/ Bw4 80T
	16
	76
	21
	102
	0.9512
	
	C2/ Bw4 80I
	28
	64
	35
	88
	0.7524
	
Fonte: A autora (2020)
CONCLUSÕES
	Nas análises univariadas foram encontradas associações positivas entre NIC II/ III com a presença dos alelos HLA-B*07:02 (OR: 2.05, p= 0.04) e HLA-C*03:04 (OR: 2.24, p= 0.01), o genótipo C1/ C1 (OR: 1.54, p=0.05), e com combinações de ligantes KIR do grupo C1 e Bw6 (OR: 2.56, p= 0.0001), sugerindo susceptibilidade, e associações negativas entre NIC II/ III com os alelos HLA-B*35:05 (OR: 0.44, p= 0.02) e HLA-B*14:02 (OR: 0.39, p= 0.04), sugerindo proteção. 
PARTICIPAÇÃO EM OUTROS PROJETOS
Associação entre resíduos de aminoácidos em posições relevantes da fenda de moléculas HLA-B e HLA-DR com neoplasia intraepitelial cervical - Letícia Boslooper Gonçalves 
	Análise de 146 amostras para o gene HLA-DRB1 utilizando o Software HLA Fusion (versão 4.3), com enfoque nos aminoácidos da posição 13 e 71. Após as análises, foi redigida uma planilha com todas as possibilidades alélicas fornecidas pelo programa, categorizando os alelos em comuns ou raros, de modo a permitir que a mestranda realizasse a imputação dos alelos. Estes procedimentos foram realizados no Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade da Universidade Federal do Paraná.
Associação dos polimorfismos dos genes do ciclo 1 de carbono e da endotelina com enxaqueca crônica – Marco Antonio Takashi Utiumi
	Até o momento, foi realizado o processamento e armazenamento de 53 amostras do sangue de pacientes do doutorando. O processamento da amostra requer a centrifugação do sangue, para permitir que sejam separados e armazenados o plasma e o soro. Também foi feita a extração do DNA de 32 amostras, seguida da quantificação do DNA extraído por espectrofotometria. Estes procedimentos foram realizados no Laboratório de Genética Molecular Humana, localizado no Departamento de Genética da Universidade Federal do Paraná.
REFERÊNCIAS
ALAM, S.M.; TRAVERS, P.J.; WUNG, J.L.; NASHOLDS, W.; REDPATH, S.; JAMESON, S.C.; GASCOIGNE, N.R. T cell receptor affinity and thymocyte positive selection. Nature, London, v. 381, p. 616-620, 1996.
ALVES, C et al. Complexo principal de Histocompatibilidade: sua participação na patogênese das doenças reumáticas. Revista brasileira de promoção em saúde, Fortaleza, V. 19, n. 3, p. 155-163, 2006.
BAO, X et al. HLA and KIR Associations of Cervical Neoplasia. The Journal of Infectious Diseases. V. 218, n. 12, p. 2006-2015, 2018. https://doi.org/10.1093/infdis/jiy483
BIASSONI, R. et al. Amino acid substitutions can influence the natural killer (NK)-mediated recognition of HLA-C molecules: Role of serine-77 and lysine-80 in the target cell protection from lysis mediated by "group 2" or "group 1" NK clones. J exp med, [s. l.], 1995.
BOSLOOPER, Leticia Gonçalves. Associação entre resíduos de aminoácidos em posições relevantes da fenda de moléculas HLA-B e HLA-DR com neoplasia intraepitelial cervical. Tese de mestrado Universidade Federal do Parana. 2020
BRENOL, Claiton Viegas et al . O papel do gene e da molécula HLA-G na expressão clínica das doenças reumatológicas. Rev. Bras. Reumatol.,  São Paulo ,  v. 52, n. 1, p. 82-91,  2012.
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