Relatorio Tecnicas histologicas

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Universidade Federal de Goiás 
Instituto de Ciências Biológicas 
Curso de Biomedicina 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 
 
 
 
 
Discente: Renata Marques De Souza 
Docente: Drª Glaucia Maria Cavasin 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Goiânia 
2019
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Sumário 
 
1 Introdução ..…………………........………………………………..03 
2 Materiais e Métodos.........……………………….........................04 
 2.1 Coleta, fixação e clivagem........…………….........................04 
2.2 Desidratação Inclusão e Microtomia........……......................05 
 2.3 Montagem lamina de osso desgastado........……...................03 
2.4 Esfregaço de mucosa oral..........…………….........................08 
2.5 Coloração.....................................……………........................09 
3 Resultados e Discussões…………………………………….......09 
4 Conclusão........…………............................................................14 
5 Referências bibliográficas…...……….......................................15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 
 
1 Introdução 
A histologia é a ciência que estuda as células no contexto da estrutura 
tecidual e a inter-relação delas com os constituintes da matriz extracelular. A 
histotecnologia proporciona o entendimento dos fundamentos técnicos para a 
análise dos elementos teciduais, normais ou patológico, isto é, suas células e os 
elementos da matriz extracelular, abrangendo diversas técnicas histoquímicas. 
A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao 
estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por 
luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser 
examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que 
serão coletados em lâminas muito finas e transparentes. 
Os procedimentos utilizados para se obterem amostras de tecido ou 
preparados histológicos retirados de um organismo para exame microscópico 
incluem: coleta do material, fixação, clivagem, processamento, incluso, 
microtomia (corte) e coloração.Realizamos os outros procedimentos nos quais 
serão citados neste relatório. 
Nosso órgão de estudo será o epidídimo consiste em um delgado ducto, 
com aproximadamente 4 a 6 m de comprimento, altamente contorcido, dobrado 
em um espaço de somente 7 cm de comprimento, responsável pela coleta e 
armazenamento dos espermatozoides produzidos nos testículos. 
Histologicamente é possível observar que esta estrutura é revestida por 
um epitélio pseudoestratificado, composto por dois tipos distintos de células: 
Células basais: células epiteliais baixas, que variam de piramidais a 
poliédricas. Apresentam núcleo redondo com grande acúmulo de 
heterocromatina. Acredita-se que essas células atuem como células-tronco, 
regenerando-se assim como dando origem às células principais quando 
necessário. 
Células principais: células epiteliais altas, com núcleo oval e irregular com 
um ou dois grandes nucléolos. Possuem estereocílios em sua membrana apical, 
no qual se encontram na base desses uma grande quantidade de vesículas 
pinocíticas e encapadas. São responsáveis por absorver o fluido da luz, que é 
endocitado por vesículas pinocíticas e encaminhados até o endolisossomos, 
local onde são eliminados. Além disso, essas células também fagocitam restos 
de citoplasma não eliminados pelas células de Sertoli. Também sintetizam 
glicerofosfocolina, uma substância responsável pela inibição da capacitação dos 
espermatozoides impedindo-os, desta forma, de fertilizarem um ovócito 
secundário antes de penetrarem no trato genital feminino. 
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Objetivo: aprendizagem das técnicas histológicas desde do processo 
inicial de confecção da lamina, todo seu preparo até etapa final que refere se a 
coloração e a observação das estruturas no microscópio. 
 
2 Materiais e Métodos 
2.1 Coleta, fixação e clivagem 
O processo de coleta de material é realizado para a retirada da amostra 
biológica de um organismo vivo ou morto obtidas através de biópsia, peças 
cirúrgicas e necropsia. Nossa amostra é material biológico de um rato Wistar 
uma linhagem albina da espécie (Rattus norvegicus) do centro de pesquisa do 
ICB 2, onde o mesmo foi eutanásiado e sacrificado através da guilhotina. Antes 
de proceder a coleta, deve organizar o espaço, separar os utensílios que serão 
utilizados e preparar o líquido fixador. O tecido é imerso em um frasco 
contendo a solução fixadora que deve ser bem fechado, evitando assim que 
ocorra a evaporação do fixador ou mesmo que estes vapores tóxicos 
contaminem o meio ambiente ; este procedimento deve ser realizado no 
interior de uma cabine. 
O tecido a ser estudo e escolhido para observação foi o epidídimo do rato, 
utilizamos uma solução salina 9% para retirar o excesso de sangue e 
prosseguimos com a próxima etapa que é a fixação. Que consiste na utilização 
de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias 
constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para 
suportar as demais etapas. 
 O fixador utilizado foi o Metacarn que leva na composição etanol 60%, 
clorofórmio 30% e ácido acético 10% este fixador deve estar necessariamente 
estar gelado. O órgão fixado por 3 horas. 
Para uma boa preparação histológica é fixação completa e adequada do 
tecido a estudar obedecer alguns requisitos como: intervalo mínimo entre coleta 
e a fixação, volume do fixador deverá ser o mínimo 30 vezes maior que a peça. 
Seguimos então para a clivagem consiste em reduzir as dimensões dos 
fragmentos dos tecidos coletados. Dependendo do tipo de fixador empregado, a 
clivagem poder· ocorrer em até algumas horas após a fixação. Na clivagem ideal, 
os fragmentos devem atingir cerca de 3 mm de espessura; porém, dependendo 
do tipo de órgão, esse fragmento pode chegar a mais do que 5 mm. 
 
 
 
 
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Figura 1: Esquema inicial preparação da lamina 
 
2.2. Desidratação Inclusão e Microtomia 
Materiais 
 Álcool 70% 
 Álcool 80% 
 Álcool 95% 
 Álcool absoluto I 
 Álcool absoluto II 
 Álcool absoluto III 
 Xilol I 
 Xilol II 
 Xilol III 
 Parafina I 
 Parafina II 
 Parafina III 
Metodologia 
A desidratação é importante para que um material de inclusão, possa 
penetrar a parafina no tecido seu conteúdo em água deve ser removido. A 
desidratação é levada a efeito imergindo o bloco de tecido em concentrações 
crescentes de álcool etílico. 
O álcool é o agente mais comumente utilizado neste processo, sendo empregado 
numa série crescente, inicialmente no álcool 70% durante 1 hora, álcool 80% 1 
hora (onde nesta etapa o material pode permanecer em overnight), álcool 95% 
por 1 hora e álcool Absoluto (I, II,III) também durante uma hora em cada etapa. 
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Várias são as substâncias utilizadas como agentes de desidratação: álcoois 
etílico, butílico, metílico e isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido 
propileno. O álcool etílico é o mais utilizado em técnica de rotina. 
Após a desidratação, o etanol presente nos fragmentos é substituído por 
uma solução intermediária (geralmente um solvente orgânico) que é miscível 
tanto em etanol como nomeio de inclusão (parafina ou resinas) (Bioaula, 2007; 
Carneiro et al., 2004). 
Para a inclusão em parafina, o xilol é a substância intermediária mais utilizada. 
Este solvente tem como objetivo retirar o álcool do interior dos tecidos, já que o 
álcool não é miscível com o meio de inclusão, a parafina. Após este 
procedimento, os tecido ficam com um aspecto transparente e/ou translúcido 
(Bioaula, 2007; Carneiro et al., 2004). 
Na fase de diafanizarão que visa remover completamente o álcool do interior dos 
tecidos, preparado os para as etapas subsequentes. A remoção do álcool é de 
extrema importância pois a parafina não se mistura homogeneamente com o 
álcool. Dessa forma,é fundamental a completa remoção do álcool para eu a 
parafina possa penetra completamente o interior dos tecidos. Utilizamos xilol I 
por uma hora e xilol II por uma hora. 
Já na impregnação deve ser realizada em estufa a 60ºC. Os fragmentos serão 
transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeterminados. 
Parafina (I,II e III) intervalor de 1 hora cada, não se deve realizar somente uma 
passagem pela parafina, pois ser· insuficiente para remover todo o xilol dos 
tecidos. Contudo, recomenda-se nunca deixar o material permanecer na parafina 
por muito tempo, pois como a parafina somente É líquida em temperatura alta, o 
calor em um longo período de tempo poder· causar grande dano ao tecido. 
 
Figura 2: Processo de desidratação, diafanização e impregnação. 
 
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No processo de inclusão o tecido é passado em duas trocas de parafina 
para assegurar a substituição de todo o agente clarificador pela parafina. 
Emprega-se a parafina a uma temperatura de 56 a 60 ºC (parafina fundida), de 
modo que a temperatura alta também possibilita que o solvente utilizado na 
diafanização evapore. O bloco de tecido permanecerá imerso na parafina 
fundida (em estufa) durante o tempo necessário para a completa impregnação. 
Posteriormente serão retirados da estufa e deixados à temperatura ambiente até 
que a parafina endureça, após o que o bloco de parafina com o tecido será 
retirado da forma e conduzido ao corte. 
Com auxílio de uma pinça os tecidos que foram previamente infiltrados 
em parafina no interior de um molde que já contem parafina liquida com a 
superfície a ser seccionada (cortada ao micrótomo). Os fragmentos devem ser 
colocados na parafina enquanto aquecidos, evitando a formação de bolhas de 
ar em torno deles. Após o resfriamento os blocos de parafina com o material 
incluído são obtidos, para uma boa inclusão é necessário eu o fragmento esteja 
completamente desidratado, clarificado e corretamente impregnado e levamos o 
molde com o material incluído para resfriar. 
 
 
Figura 3:: Processo de inclusão imagem retirada do site: 
medicina.blogspot.com/2013/12/histologia-tecnicas-de-preparacao-de.html. 
Posteriormente continuamos o processo de microtomia onde é necessário 
que os blocos estejam gelados, para melhor resultados nos cortes, utilizamos 
uma navalha nova, onde no manuseio de micrótomo os cortes precisam ser 
contínuos sem quebra, tivemos orientações da profissional responsável do 
laboratório de histologia Mônica quando uso correto do aparelho e ajuste para 
tamanho do corte espessura de 4 a 6 µm, com o auxílio de uma pinça retiramos 
a fita formada do micrótomo é transportada para o banho maria em torno de 
40ºC, pescamos o fragmento com uma lamina limpa e colocada no suporte para 
secar, realizamos teste com uma lamina guia para verificar as estruturas antes 
da coloração. 
 
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2.3 Montagem lamina de osso desgastado 
Materiais 
 Fragmento de osso 
 Lixa 
 Recipiente com agua 
 Lamina 
Metodologia 
Enquanto aguardamos o processo de desidratação, realizamos a confecção 
de lâminas ósseas por desgaste. Inicialmente, foi retirado um fragmento do osso 
envelhecido sem matéria orgânica a ser analisado, um recipiente com agua e 
uma lixa de ferro a prova d´agua, realizamos movimentos circulares para evitar 
ranhuras e conseguir a transparência suficiente, utilizamos duas lixas uma 
granulometria grossa para o primeiro polimento. O polimento final uma lixa 
mais fina, com movimentos firmes e no mesmo sentido, até que se tenha obtido 
uma camada de osso delgada. O osso é retirado e aderido à superfície da lâmina 
de vidro. Sobre ele é colocada uma lamínula e fixada com resina. 
 
 
2.4 Esfregaço de mucosa oral 
Materiais 
 Espátula (palito de sorvete) 
 Lamina 
 Corante 
 Papel absorvente 
 Óleo de imersão 
 Microscópico ótico 
 
Metodologia 
Solicitou se que cada aluna com auxílio de Espátula (palito de sorvete), 
raspou se a face interna (mucosa) da bochecha, desprezou se o primeiro 
raspado em seguida depositou se o material coletado em uma lamina limpa, em 
cada acrescentou se duas gotas de Corante, secou se o excesso com um papel 
absorvente e levou se ao microscópio a objetiva de maior aumento para 
verificação atentamente as células. 
2.3. Coloração 
Materiais 
 Corante hematoxilina 
 Agua corrente 
 Corante eosina 
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 Lamínula 
 Lamina 
 Entellan 
 Pipeta 
Metodologia 
Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega 
uma carga positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido. 
Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os 
quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de 
glicosaminoglicanas e grupos carboxila das proteínas. A habilidade de grupos 
aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basófila, estruturas 
celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas. 
Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem 
heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. 
A hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes ácidos reagem 
com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando usados juntamente 
com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos 
citoplasmáticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas 
em vermelho ou rosa. 
No processo coramos com a solução recém- filtrada de hematoxilina por 
6 a 10 minutos, lavamos em agua da torneira por minutos, diferenciou em álcool-
ácido, com dois mergulhos, depois concentrações de álcool etílico 80% por 1 
minuto, coramos em solução de eosina por 2 minutos desidratamos com álcool 
95%. 
As lâminas são montadas, onde os fragmentos são protegidos pela 
cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada na lâmina através de 
substâncias selantes o Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser 
observadas ao microscópio de luz. 
 
3 Resultados e Discussões 
Ao final dos procedimentos realizados como coleta do material, fixação, 
desidratação, clarificação, inclusão, microtomia (corte) e coloração podemos 
observar que estão dentro dos resultados esperados através de nossos 
conhecimentos prévios dos cortes histológicos, analisamos a lamina de osso 
degastado, esfregaço bucal e o tecido objeto desse estudo que é o epidídimo. 
Seguem os resultados obtidos conforme fotos abaixo: 
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Figura 4: Esfregaço bucal, possível observar núcleo picnótico na ponta da seta, inclusões 
citoplasmáticas e limites celular. 
 
 
Figura 5: Lâmina de Osso degastado, observa se Sistema circunferencial interno e externo 
(lamelas paralelas) Sistema intermediário (remanescente do Sistema de Havers), Sistema de 
Havers (Osteon) -1 •Lamelas concêntricas •Osteoplastos •Canal de Havers Canal de Volkmann 
seta longa. 
1 
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A B 
C 
Figura 5: Testículo e epidídimo – HE, Túnica albugínea (cápsula) Túbulos seminíferos, 
A:Objetiva de menor aumento (4X), B: Objetiva seguinte (10x) e C: Objetiva de (40X). 
 
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Figura 6: Testículo e epidídimo – HE, Espermatôgonias (1) Células de Sertoli (2) 
Espermatócitos (3). 
 
 
Figura 7: Testículo e epidídimo – HE, Células intersticiais (de Leydig) - (seta longa) 
1 
3 
2 
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Figura 8: -Epidídimo - HE Tecido conjuntivo (vasos e nervos) Epidídimo Cápsula Epitélio simples 
cilíndico (6) com estereocilíos (seta longa) e células basais de subsitituição (pseudo-estratificado) 
Apoia-se sobre uma lâmina basal, envolta por células de m. liso e tecido conjuntivo frouxo. 
 
 
Discussões 
Resultados encontra se dentro do esperado coloração sem artefato que 
ocorre comumente em algumas preparações, onde uma estrutura, por exemplo, 
tem bolha, ou ausência de uma estrutura, espaço entre camadas celulares, que 
acontece quando uma das etapas de preparação da lâmina histológicafalha. 
Podendo influenciar numa análise levando a uma interpretação errada do 
material estudado, porem nosso tecido seguiu perfeitamente realizado em todas 
suas etapas. 
 
 
 
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 4 Conclusão 
O processamento histológico é um conjunto de processos técnicos 
executados em fases sequenciais que requerem, ao mesmo tempo, observação 
dos protocolos e capacidade de adaptação dos mesmos diante da necessidade 
de cada amostra, que é única. Apesar o conhecimento dos princípios físicos e 
químicos de suas diversas etapas, aliado a experiência laboratorial, possibilitam 
o corte histológico tenha a qualidade ideal e esperada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5 Referências bibliográficas 
Histological and histochemical methods Kiernan, J. A.2001. London 
[England]: Arnold. 
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 8 ed. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 1995. 
JUNQUEIRA, Luís Carlos U.; JUNQUEIRA, Luiza Maria M. S.Técnicas 
básicas de citologia e histologia. São Paulo: Santos, 1983.