Resumo Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

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Resumo de Farmacognosia I 
 
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: 
Consiste na análise de extratos vegetais por cromatografia líquida de alta eficiência e tem 
como objetivo preparar e analisar curva de calibração com emprego de padrões de 
trabalho, descritos como Cumarina e Anetol. Além disso, permite a identificação e 
determinação do teor de Cumarina nos extratos de Cumaru (Amburana cearensis) e 
Anetol (Foeniculum vulgare) no óleo essencial de Funcho por cromatografia líquida de 
alta eficiência. 
• Materiais: 
Acetonitrila (grau HPLC) Pinça 
Água destilada (grau de purificação miliq) Placa de Petri 90x15 mm 
Balão volumétrico 500 mL – pesquisa Proveta – pesquisa 
Béquer Seringa – pesquisa 
Bomba a vácuo – pesquisa Sistema de filtração fase móvel 
Clorofórmio PA Sonicador 
Etanol PA 
Filtro para seringa PTFE 0,45 um 
Kitassato – pesquisa 
Membrana solvente orgânico – pesquisa 
Metanol – pesquisa 
Vial N9 incolor Graduado 11,6x32 mm – 1,5 mL com tampa de rosca para 
 
- Amostra: Extratos de Amburana cearensis 
 Óleo essencial de Foeniculum vulgare 
 
- Padrões: Cumarina e Anetol 
 
- Equipamento: Sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) da 
indústria Walters, USA. 
 
 
 
 
 
 Figura 1: Equipamento de cromatografia de alta eficiência – CLAE. 
 
Na imagem acima é possível visualizar na porção superior central os fracos onde são 
armazenados os constituintes da fase móvel, o próprio sistema permite compor a fase 
móvel em diferentes concentrações de cada componente de maneira a suprir as 
necessidades do método. Um pouco abaixo é possível identificar o monitor, que tem como 
função de permitir a visualização do processo realizado dentro do sistema, como por 
exemplo a pressão realizada pela bomba situada na porção inferior do aparelho. Além 
desses citados acima, tem-se a presença de uma coluna cromatográfica que será 
apresentada abaixo. 
 
A figura ao lado representa os “vials” que 
são os recipientes destinados para o depósito 
de soluções, sendo estas as amostras 
provenientes de extratos aquosos, os 
padrões utilizados para compor a curva de 
calibração. Como se trata de um sistema 
equipado e de avançada tecnologia, ambas 
as soluções podem ser colocadas nos “vials” 
em mesmo momento, e o próprio sistema se 
encarrega de diferenciá-las e operá-las. 
 
 
 
Acima tem-se a demonstração da bomba presente no sistema CLAE, que se caracteriza 
como essencial para fornecer uma ótima pressão visto que toda eluição se dá através do 
sistema de maneira isocrática, ou seja, sem alteração nos componentes da fase móvel 
durante todo o período de análise. 
 
Já na imagem ao lado, é possível visualizar a coluna 
cromatográfica utilizada para o sistema CLAE, que 
se encontra dentro de um forno e que este possui um 
alto controle de temperatura de maneira a mantê-la 
constante para que não haja interferências na análise 
ou no funcionamento do sistema em geral. 
 
 
 
 
Vale salientar que a coluna apresentada acima compõe um outro sistema de adsorção que 
se difere em relação à cromatografia em camada delgada, que se caracteriza por sua fase 
estacionária ser disposta em uma fina placa, já na CLAE, a fase estacionária é bastante 
compactada e condicionada em um suporte de metal, dentro da espessura dessas colunas 
existe uma sílica de fase reversa, ou seja, possui como fase estacionária a sílica definida 
como apolar constituída por 18 carbonos. O diâmetro da coluna é relativamente pequeno 
e possui dimensões pequenas por ser coluna própria para sistema analítico, quando se tem 
como intuito o sistema preparativo ou semi-preparativo, as dimensões da coluna 
cromatográfica são maiores, tendo em vista o aumento de volume utilizado nas soluções 
de amostra e padrão. 
 
 
 
 
 
• Método: 
Componentes Cumarina Anetol 
Coluna C 18 C 18 
Detector 259 nm 259 nm 
Fluxo 0,85 mL/min 1 mL/min 
Volume de injeção 20 µL 20 µL 
Tempo de corrida 10 minutos 10 minutos 
Fase móvel Acetonitrila e água (35:65) Metanol e água (85:15) 
Temperatura 37 °C 37 °C 
Diluente Fase móvel Fase móvel 
Eluição Isocrática Isocrática 
 
É necessário antes de iniciar o processo envolvendo o sistema prático, desenvolver o 
método analítico de maneira a aprimorar o funcionamento do CLAE e gerar o 
aproveitamento de diversas partes do processo. 
O diluente se trata da solução que prepara as amostras obtidas a partir de extratos aquosos 
foi a própria fase móvel. 
 
Na figura ao lado tem-se a representação 
do preparo dos padrões que são utilizados 
para compor a curva de calibração tanto 
para a Cumarina como para o Anetol, 
sendo esta responsável pela caracterização 
do método analítico como de fundamento 
linear ou não, o classificando com base no 
princípio da proporcionalidade e o 
definindo como ideal para a identificação, 
quantificação e segregação das espécies de 
interesse ou não. 
 
À esquerda é possível visualizar a preparação da cumarina e a na porção direita a que se 
refere ao anetol, essa preparação é precisa e necessária para que não haja o 
comprometimento de nenhuma parte do sistema. Desta forma, cada um dos padrões teve 
uma quantidade determinada pesada e depositada em balão volumétrico para atingir 
volume específico, em seguida, a solução foi filtrada e encaminhada para o vial, onde se 
é realizada a análise cromatográfica por CLAE. 
 Durante a preparação das amostras referentes aos extratos obtidos por diversos métodos 
extrativos, cerca de 1 mL do extrato é condicionado em balão volumétrico de 10 mL e é 
completado com o diluente adequado, no caso do processo descrito acima, o diluente é 
constituído pela própria fase móvel. O volume obtido é filtrado e depositado no vial, onde 
a análise por CLAE é realizada e se estabelece um resultado. 
 
Excepcionalmente no tocante ao extrato aquoso obtido por Sohxlet, é necessário realizar 
um diferente preparado da amostra para que o sistema CLAE não sofra alterações que 
possam comprometer seu funcionamento, tal fato é explicado pois durante o 
desenvolvimento do método Sohxlet é utilizado um solvente orgânico que precisa ser 
retirado do extrato para que a amostra possa ser utilizada, desta forma segue o 
procedimento para retirada de solvente orgânico: 
- Evaporação do solvente extratos (clorofórmio) à temperatura ambiente em capela de 
exaustão. 
- Resuspender o resíduo com 1 mL de etanol PA, filtrar e completar com o diluente 
adequado para o balão volumétrico de 10 mL. 
- Adicionar alíquota do extrato no Vial identificado e proceder a análise do marcador por 
CLAE. 
 
Ao lado apresenta-se a amostra preparada referente ao 
extrato aquoso obtido a partir da aplicação do método 
extrativo definido como infusão, em seguida essa solução 
presente no balão volumétrico de 10 mL é destinada para o 
vial após ser submetida a filtro. Em seguida essa amostra é 
retirada com o auxílio de uma seringa, ela é filtrada para a 
retirada de impurezas e possível restos de partículas advindas 
da droga vegetal utilizada durante o método extrativo e em 
seguida, após a filtração, a solução é depositada no vial. 
 
 
Na imagem ao lado, 
estão os 
equipamentos 
sutilizados para a 
fase final de 
preparação das 
soluções destinadas 
à análise de 
marcadores ativos 
no CLAE. 
 
O filtro acima é descartável e possui dentro de sua estrutura uma membrana fina 
responsável pela segregação de partículas presentes na solução. 
 
As soluções preparadas e 
depositadas nos vials são 
encaminhadas para a análise 
em CLAR, salientando que 
todos permanecem em posição 
definida como 45° e contém 
tanto as amostras como o 
padrão. 
 
Após isso o sistema é ajustado, nessa parte são definidas a temperatura, composição da 
fase móvel, identificação da amostra e definição de todas as características pré-
determinadas acima comoideais para a realização do método. 
Como resultado, tem-se o cromatograma que contém informações sobre a identificação 
de marcadores ativos procurados nas amostras, tempo de retenção que significa o tempo 
na corrida das soluções em que se identificou o marcador. Além disto, o cromatograma 
nos permite compreender a concentração de cumarina presente em cada um dos extratos 
aquosos analisados, isto por meio da área do pico gerado durante a identificação da 
presença das espécies. 
O tempo de retenção constitui o parâmetro qualitativo do sistema CLAE, ou seja, que 
demonstra a presença da substância pesquisada. Como o pico possui uma área, se faz 
possível a determinação de concentração da espécie, se caracterizando como parâmetro 
quantitativo. 
 
• Resultados: 
 
 
 
 
Esses dados foram utilizados para fazer uma análise de regressão linear, definindo-o como 
aceitável para determinação da presença e quantificação de espécies. O software após 
analisar, fornece uma equação da reta que demonstra como se dá a relação entre as duas 
variáveis estudadas, sendo a variável independente (eixo X) relativa à concentração de 
cumarina e a variável dependente (eixo Y) definida como área do pico. O método de fato 
cumpre o princípio de proporcionalidade e de maneira extremamente linear, tendo como 
base o coeficiente de correlação (R2). 
 
Análise do teor de Cumarina em extratos de Amburana cearensis A.C. SMITH por CLAE 
 
Método extrativo Área do pico 
Infusão 71713 
Decocção 385397 
Maceração e percolação 1316815 
Turbólise 1027051 
Soxhlet 885695 
 
Cromatogramas referentes às amostras relativas aos métodos de infusão e decocção: 
1) Cromatograma referente ao extrato aquoso obtido por Infusão: 
 
 
2) Cromatograma referente ao extrato aquoso obtido por Decocção: 
 
 
 
- Curva de calibração do Anetol: 
 
 
 
Método Área do pico 
Hidrodestilação 956626 
 
Cromatograma referente à amostra relativa ao método de Hidrodestilação: 
1) Cromatograma referente ao extrato aquoso obtido por Hidrodestilação