Extração de DNA e PCR

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Extração de DNA
e PCR 
Prof.ª Msc. Camila Amato Montalbano
Doutoranda do PPGDIP-UFMS
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Extração de DNA
Extração de DNA é um procedimento de rotina para isolar e coletar o DNA.
É a primeira etapa para subsequente análise molecular ou forense.
DNA pode ser extraído de quase qualquer tecido celular intacto:
Pele
Sangue
Saliva
Sêmen
Muco
Músculo
Osso
Outros...
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Propósito da extração do DNA
Obter DNA em uma forma relativamente purificada o qual poderá ser utilizado em investigações 
Tipo de tecido para transplante
Detecção de patógenos
Testes de paternidade
Identificação de doenças congênitas
Identificação de genes problemáticos
Pesquisa
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Etapas básicas para extração de DNA
Existem 3 etapas básicas na extração de DNA, os detalhes vão depender do tipo de amostra e de qualquer substância que pode interferir com a extração e análise:
Romper as células e remover a membrana lipídica;
Remover proteínas celulares ligadas ao DNA que pode ser,
por adição de uma protease, 
por precipitação com acetato de sódio ou de amônio, 
ou utilizando um passo de extração com fenol/clorofórmio.
Precipitar o DNA em etanol frio ou isopropanol, o DNA é insolúvel no álcool e adere-se em conjunto, esta etapa também remove os sais.
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Lise celular
Na extração de DNA de plantas, esta etapa se refere a quebra da parede celular e membrana plasmática
A parede celular (feita de celulose) é rompida pela força mecânica (por exemplo, moagem das folhas)
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Do que são formadas as membranas celulares?
A lise celular é o processo de ruptura ou dissolução da membrana celular que leva à morte da célula e liberação de seu conteúdo.
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Lise celular
Em seguida, a adição de um detergente que rompem as membranas celulares
Os detergentes são capazes de romper as membranas devido à sua natureza anfipática (tendo ambas as regiões hidrofílicas e hidrofóbicas). As moléculas de detergente são capazes de separar as membranas
O resultado final da lise é que o conteúdo das células de plantas são distribuídos em solução.
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Precipitação
Etapa em que o DNA é separado do restante dos componentes celulares.
A primeira parte usa fenol/clorofórmio para remover as proteínas do DNA
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Precipitação
A segunda parte é a adição de sais, que interrompem as ligações de hidrogênio entre a água e a molécula de DNA
O DNA é então precipitado separando das proteínas usando isopropanol ou etanol.
Com o uso de uma microcentrífuga, o DNA forma um pellet no fundo do recipiente
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Lavagem e Ressuspensão
Lavagem
O DNA precipitado é carregado com sais de acetato. É "lavadas" com uma solução de etanol a 70% para remover os sais e outras impurezas solúveis em água.
Ressuspensão
O DNA limpo é agora ressuspenso num tampão para garantir a estabilidade e armazenamento à longo prazo.
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Quebra da parede e membrana celular
Separação dos sólidos do DNA dissolvido através de centrifugação.
Precipitação do DNA usando isopropanol
Centrifugação para separar o DNA dos sais e açucares dissolvidos. 
Lavagem e secagem do pellet de DNA com Etanol.
DNA dissolvido
Revisão do processo de extração de DNA
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Flowchart of the various steps
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
Inventada em 1983 por Kary Mullis
é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas 
Aplicações: 
seqüenciamento de genes 
diagnóstico de doenças hereditárias
testes de paternidade e na medicina forense
diagnóstico de doenças infecciosas
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Reação de PCR:
 DNA
dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) 
iniciadores (também chamados de primers)
DNA polimerase 
solução tampão 
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REAGENTES PARA A REAÇÃO
DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua concentração pode resultar na diminuição da sua especificidade; 
SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições da reação; 
REAGENTES PARA A REAÇÃO
MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima;
dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer.
PCR
Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos
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Desnaturação
Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura.
As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.
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Hibridação 
A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns segundos.
Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde
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Extensão 
Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos.
 A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores
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PCR-RFLP
Enzima de restrição:
 mutação cria sítio de restrição
 mutação elimina sítio de restrição
Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho
Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese
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PCR-RFLP
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PCR-SSCA (ou SSCP)
Análise de Conformação de Fita Simples
Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). 
DNA é amplificado por PCR 
Depois é desnaturado por calor
Gel de poliacrilamida não desnaturante 
As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e correm em posições diferentes no gel. 
Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).
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PCR-SSCA
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PCR em tempo real
É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR
A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR.
Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial 
Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese. 
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PCR em tempo real
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PCR em tempo real
SYBR Green
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PCR em tempo real
Taqman
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PCR em tempo real
Aplicações
Quantificação
Detecção de carga viral
Determinação do número de cópias de um gene
Análise da expressão gênica
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Seqüenciamento didesoxi
Método de Sanger
Síntese de DNA na presença de nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3’-hidroxila.
Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese
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https://www.youtube.com/watch?v=vO50-ZRQtuY
https://www.youtube.com/watch?v=M1QO1iglT5o
Vídeos
OBRIGADA!!!!!!!
montalbano.c@hotmail.com
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