CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DO HORMÔNIO GH EM LEVEDURA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS 
GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA 
INSTITUTO CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FABRICAÇÃO DE FARMÁCO A PARTIR DA CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE 
DO HORMÔNIO GH EM LEVEDURA 
 
 
 
Juliana Rocha da Conceição 
Renata marques de Souza 
Docente: Mariana Vieira Tomazett 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Goiânia, Goiás 
Julho de 2019
Juliana Rocha da Conceição 
Renata marques de Souza 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FABRICAÇÃO DE FARMÁCO A PARTIR DA CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE 
DO HORMÔNIO GH EM LEVEDURA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Projeto de Pesquisa do curso de Biomedicina da 
Universidade Federal de Goiás, requerido pela 
Disciplina de Biologia molecular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Goiânia, Goiás 
Julho de 2019
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................03 
2 METODOLOGIA PARA EXECUÇÃO.................................................................03 
3 CLIVAGEM DO GENE ESCOLHIDO..................................................................04 
4 PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DA PROTEINA...............................................07 
5 RESULTADOS ESPERADOS.................................................................................07 
6 BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................08 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Clonagem sobre o gene do hormônio GH 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 A biologia molecular invade vários laboratórios de pesquisa haver com a 
clonagem de genes que geram proteínas de interesse no âmbito biotecnológico e clinico, 
sendo o último ligado a metodologia tratada neste trabalho, quanto a produção de GH 
(Growth Hormone) pela técnica de DNA recombinante. 
 O hormônio do crescimento, ou GH é produzido pela glândula hipófise, e age no 
organismo como um todo, promovendo não só o crescimento ligado à altura do indivíduo, 
mas também promovendo o aumento de todas as outras células que compõem o mesmo. 
Essa importante função liga-se ao fato do mesmo ter um intermediário, denominado de 
IGF-1 (somatomedina) ao qual é produzido no fígado, células musculares e células 
ósseas, ao qual exerce controle sobre a secreção do GH através de feed back negativo ao 
nível da hipófise e hipotálamo. Sendo assim essas duas substancias promovem o 
desenvolvimento e crescimento de todos os tecidos por estabelecerem como principal 
função o anabolismo do organismo como um todo. 
 
Objetivo da Proposta:utilizar a técnica do DNA recombinante para replicação do 
hormônio GH em larga escala proporcionando assim a liberação deste hormônio na forma 
de fármacos, que tendem a ajudar indivíduos com doenças como o Hipopituitarismo e a 
Síndrome de Turner. 
 
 
2 METODOLOGIA PARA EXECUÇÃO 
-Gene codificador do GH. 
 Como dito anteriormente o Growth Hormone se baseia em uma proteína, a qual 
como as outras dentro de um organismo, é sintetizada através de um gene especifico 
composto por dezenas de nucleotídeos presentes no cromossomo. 
 
 
 
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>NC_000017.11:c63918852-63917193 Homo sapiens chromosome 17, GRCh38.p7 
Primary Assembly 
AAGAGACCAGCTCAAGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTA 
GCTGCAATGGCTACAGGTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGCACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGC 
GACCTGTAGATGGGACGGGGGCACTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGTGAGTATCGCCATGTAAG 
CCCAGTATTTGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAAACAAACAGCTCC 
TGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCCCTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAGGCTC 
CCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCA 
ACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTG 
ACACCTACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGACTTT 
CCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTCCCGAAGCGAAAATGCAGGCAGA 
TGAGCACACGCTGAGTGAGGTTCCCAGAAAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCGTAGACCTTGGTGG 
GCGGTCCTTCTCCTAGGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAG 
ACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCGTGA 
GTGGATGCCTTCTCCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACAGCCAATG 
CCCGTCCTTCCCCTGCAGAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGC 
CCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGA 
CCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGGTGAGGGTGGCGCCAGGGGTCCCCAAT 
CCTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTAGAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCAGGCCC 
TGACCCAAGAGAACTCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCCAGGCCTTTCTCTACACCCTGA 
AGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAACAGTACCCAAGCGCTTGGCCTCTCCTTCTC 
TTCCTTCACTTTGCAGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGC 
AAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGA 
AGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTT 
CTAGCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCA 
GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGA 
 (Sequência codificadora do Growth Hormone presente no cromossomo 17) 
 
 
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3 CONAGEM DO GENE GH NO VETOR pGEMT 
 
 Em primeira ordem precisa-se fazer uma cultura de células humanas, afim de se 
ter o meio de obtenção do gene percussor do GH, a partir das células será extraído o DNA 
genomico, para ser utilizado como molde em reações de PCR. No protocolo de extração 
de DNA usa-se de proteases (enzimas que quebram as ligações peptídicas que unem os 
aminoácidos na formação de uma proteína), para desnaturar assim as proteínas que 
compõem o envoltório nuclear e também as que condensam o DNA (histonas). 
 
 
 
 
 Obtendo o DNA das células que foram cultivadas, faz-se PCR afim de 
amplificar o gene em questão. A partir disso precisa-se clonar o mesmo usando de um 
plasmídeo denominado pGEMT (Plasmídeo ao qual clona fragmentos de DNA 
provenientes de PCR), e com isso replica-lo, permitindo por fim o sequenciamento do 
gene que deseja-se expressar, sendo este o produtor do GH. Para a liberação do gene GH 
do pGEMT usando-se enzima de restrição EcoRI a qual libera o gene em questão sem 
prejudicar sua sequência de DNA, afim de clonar o mesmo no vetor de expressão 
denominado PSF-TEF1-COOH-3C-6HIS-C-TERMINAL 6 HIS TAG YEAST ( Sigma). 
 
 
 
 
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 Os Plasmídeos se baseiam em estruturas circulares de DNA extracromossômico, 
aos quais são capazes de se replicar independente da replicação cromossomal. Entre as 
estruturas presentes em um vetor molecular como esse, encontra-se uma região 
promotora, uma marca de seleção, e o sítio de policlonagem sendo esta última o local 
onde se insere o gene de interesse. 
 
 O plasmídeo utilizado como vetor para a expressão do gene do hormônio GH 
neste trabalho é denominado de PSF-TEF1-COOH-3C-6HIS-C-TERMINAL 6 HIS TAG 
YEAST, vetor esse usado para leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae. 
 
 O gene de interesse será ligado no sítio de EcoRI do vector PSF-TEF1-COOH-3C-
6HIS-C-TERMINAL 6 HIS TAG YEAST pela técnica do DNA recombinante, o mesmo 
é introduzido em leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae (URA3-) por meio da 
técnica de eletroporação, a partir disso as mesmas são levadas a um meio de cultura 
próprio para leveduras denominado WLN sem uracila onde as mesmas formarão colônias, 
as quais muitas produziram a proteína percussora do Growth Hormone. 
 
 
 
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4 PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DA PROTEINA 
 A partir da identificação das leveduras que absorveram e produziram a proteína, 
passa se para a última etapa denominada de purificação. Neste caso sendo a cromatografia 
de afinidade a escolha deste projeto. 
 A cromatografia de Afinidade é um processo de separação usado para refinar 
moléculas ou um grupo de moléculas que estão em uma mistura bioquímica contendo 
substâncias que tenham afinidadeas proteínas que deseja se separar. Emprega-se a esse 
método duas fases; uma fase estacionária e uma fase móvel. 
 Nesta metodologia a cromatografia de afinidade utilizada, consiste na utilização 
de uma coluna níquel, composta de uma solução rica em moléculas de níquel que 
entraram em afinidade com as proteínas GH separando-as do restante das moléculas, isso 
é garantido pelo fato das proteínas percussoras do GH possuírem uma cauda de Histidina 
garantida pelo emprego do plasmídeo PSF-TEF1-COOH-3C-6HIS-C-TERMINAL 6 
HIS TAG YEAST PLASMID. 
 
 
 
5 RESULTADOS ESPERADOS 
 A partir da técnica do DNA recombinante (técnica baseada na escolha de um gene, 
onde busca-se expressar o mesmo em outros organismos a fim de estabelecer diversos 
fins), torna-se de melhor alcance à produção e comercialização do Growth Hormone, 
substância essa de grande importância a todo o organismo. Sendo assim torna-se de suma 
importância metodologias como essa que ofereçam um aumento na produção deste 
hormônio, afim de proporcionar maior alcance a medicamentos derivados do GH, sendo 
esses agrupados no tratamento de doenças como o Hipopituitarismo.e a síndrome de 
tuner. 
 
 
 
 
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6 BIBLIOGRAFIA 
Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto 
Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 
NEBcutterV2.0, labtool. Disponível em:<http:.labtools.us/nebcutter-v2-0/>Acesso 
em:04 de Julho de 2019. 
Promega Disponível em: <https://www.promega.com.br/resources/protocols/technical-
manuals/0/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-systems-protocol/> Acesso em:04 de Julho 
de 2019. 
Sigma Aldrich Disponível em:< 
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ogs1923?lang=pt&region=BR> 
Acesso em:04 de Julho de 2019. 
Faculdade de ciências em Lisboa, Aula engenharia Genética Disponível em: < 
http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/Eng%20Genetica/aulas/Clonagem%20de%20expressao.p
df> Acesso em 04 de Julho de 2019. 
Mundo Educação Disponível em:< 
http://mundoeducacao.bol.uol.com.br/biologia/plasmideos.htm> Acesso em 04 de Julho 
de 2019. 
Elisete Márcia, Tese de Doutorado. Disponível em:< 
https://repositorio.ufscar.br/bitstream/handle/ufscar/5372/TeseEMC.pdf?sequence=> 
Acesso em 04 de Julho de 2019. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/Eng%20Genetica/aulas/Clonagem%20de%20expressao.pdf
http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/Eng%20Genetica/aulas/Clonagem%20de%20expressao.pdf
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https://repositorio.ufscar.br/bitstream/handle/ufscar/5372/TeseEMC.pdf?sequence