Cromatografia líquida de alta eficiência - HPLC

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Universidade Federal de Mato Grosso 
Faculdade de Engenharia 
Campus Várzea Grande 
 
 
 
 
 
 
Matheus Henrique Sacomani Martins 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuiabá-MT 
2019 
 2 
Matheus Henrique Sacomani Martins 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
 
Trabalho teórico sobre a Cromatografia 
Líquida de Alta Eficiência e suas aplicações 
apresentado como requisito parcial para 
obtenção de aprovação na disciplina Análise 
Instrumental I, no Curso de Engenharia 
Química, na Universidade Federal de Mato 
Grosso. 
 
Prof. Dra. Daniele Caetano Da Silva 
Prof. Dr. Felipe Thomaz Aquino 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuiabá-MT 
2019 
 3 
RESUMO 
 
 A cromatografia é um método empregado de forma ampla e que permite a separação, 
identificação e determinação de componentes químicos em misturas complexas. Nenhum outro 
método de separação é tão poderoso e de aplicação tão generalizada. A Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência utiliza-se de altas pressões e é uma técnica físico-química indicada para 
separar e quantificar compostos de soluções líquidas. Além disso, é utilizada para fins analíticos 
ou para fins preparativos e em escala comercial. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo 
compreender os princípios e aplicações da HPLC, dada a sua grande importância e utilização 
como método instrumental de análise. 
 
Palavras-chave: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência; HPLC; Método de Análise. 
 4 
SUMÁRIO 
 
 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 5 
2. DESENVOLVIMENTO ................................................................................................... 6 
2.1. Objetivos ........................................................................................................................... 6 
2.2. A Cromatografia ............................................................................................................... 6 
2.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - HPLC .......................................................... 7 
2.3.1. Instrumentação ........................................................................................................ 9 
2.4. Aplicações na Engenharia Química ................................................................................ 10 
3. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 11 
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 12 
 
 
 5 
1. INTRODUÇÃO 
A química analítica é a ciência que estuda os princípios e métodos teóricos da análise 
química. A análise química consiste em um conjunto de técnicas que permite identificar quais 
os componentes que se encontram presentes em uma determinada amostra e sua quantidade 
(PASSOS, 2011). 
Esta é dividida em análise qualitativa e análise quantitativa. A análise qualitativa consiste 
em identificar os componentes de uma amostra. Já a análise quantitativa permite determinar a 
quantidade dos componentes de uma amostra. As substâncias identificadas e quantificadas são 
chamadas de analitos e os locais de onde foram retiradas estas amostras são chamados de matriz 
(PASSOS, 2011). 
Os métodos analíticos são classificados em clássicos ou instrumentais. Esta classificação 
é histórica, com os métodos clássicos precedendo os instrumentais por um século ou mais. Os 
métodos analíticos instrumentais consistem na medida das propriedades físicas do analito, tais 
como condutividade, potencial de eletrodo, absorção ou emissão de luz, razão massa/carga e 
fluorescência. Nestes métodos envolvem a utilização de equipamentos sofisticados, mas 
também pode envolver reações químicas em algumas etapas. Muitas vezes são menos precisas 
do que os métodos clássicos, embora sejam mais rápidos. São utilizados na quantificação e 
identificação dos constituintes minoritários (PASSOS, 2011). 
Os químicos começaram a explorar outros fenômenos relacionados com as propriedades 
dos analitos nos anos 30, mais precisamente na metade. A medida das propriedades físicas do 
analito começou a ser empregada para análise quantitativa de uma variedade de analitos 
orgânicos, inorgânicos e bioquímicos. Um pouco mais tarde, surgiram as técnicas 
cromatográficas que substituíram a destilação, extração e precipitação de componentes em 
misturas complexas, antes da determinação qualitativa ou quantitativa. Estes novos métodos 
para separação e determinação de espécies químicas são conhecidos em conjunto como 
Métodos Instrumentais de Análise (PASSOS, 2011). 
A cromatografia é um método empregado de forma ampla e que permite a separação, 
identificação e determinação de componentes químicos em misturas complexas. Nenhum outro 
método de separação é tão poderoso e de aplicação tão generalizada como a cromatografia 
(SKOOG, 2006). 
A cromatografia líquida, é um processo onde a separação de um composto ocorre pelo 
equilíbrio deste entre duas fases. Neste caso, entre uma fase estacionária sólida ou líquida e 
uma fase móvel líquida. Historicamente, a cromatografia líquida não necessita necessariamente 
de uma instrumentação adequada, bastando dispor de uma coluna recheada com a fase 
estacionária por onde passa a fase móvel. No entanto, devido os avanços tecnológicos, muito 
tem sido desenvolvido em relação a técnica cromatográfica, e não seria a Cromatografia Líquida 
a única a não experimentar esse desenvolvimento. Por isso, ela é conhecida normalmente como 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Este fato, por si só, torna a cromatografia líquida de 
 6 
alta eficiência o tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluição 
(PASSOS, 2011). 
2. DESENVOLVIMENTO 
2.1. Objetivos 
Compreender os princípios do método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, bem 
como as suas diferentes classificações, variáveis envolvidas e a instrumentação de um 
cromatógrafo. 
Além disso, tem-se como objetivo também, analisar as diferentes aplicações do método 
na Engenharia Química. 
2.2. A Cromatografia 
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída 
a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos 
de folhas. Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de 
vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o extrato, 
levou à separação dos componentes em faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo 
qual a técnica é conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar 
à errônea idéia de que o processo seja dependente da cor (DEGANI et al., 1998). 
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação 
com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as 
substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura (DEGANI et al., 
1998). 
Segundo Skoog (2006), existe uma grande dificuldade em se definir rigorosamente o 
termo cromatografia, uma vez que o nome tem sido aplicado a diversos sistemas e técnicas. 
Entretando, todos esses métodos apresentam em comum o uso de duas fases imiscíveis. 
Pode-se definir de forma bem simples e geral a cromatografia como um método físico-
químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma 
mistura, que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases, a fase móvel e a fase 
estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma 
técnica extremamente versátil e de grande aplicação (DEGANI et al., 1998). 
A partir das diferentes combinações entre fases sólidas, líquidas e gasosas torna-se 
possível a classificaçãodesta técnica em Cromatografi a Gasosa (CG), Cromatografia 
Líquida (CL) e Cromatografia com Fluído Supercrítico (CFS) (PASSOS, 2011). 
Além dessa classificação, muitas outras são possíveis, dependendo do suporte da fase 
estacionária (Planar ou Coluna), do tipo de interação dos compostos das amostras (adsorção, 
partição, exclusão, etc.), e ainda do fluxo da fase móvel, natureza da fase móvel (para 
 7 
Cromatografia Líquida), pressão, etc. Além disso, algumas técnicas afins, tais como a 
eletroforese, eletroforese capilar e a cromatografia Eletrocinética Micelar Capilar, permitem 
sua classificação dentro da cromatografia (PASSOS, 2011). Na Tabela 1 abaixo, estão descritos 
os tipos de cromatografia classificados de acordo com a natureza de suas fases: 
Tabela 1: Classificação da cromatografia conforme natureza das fases 
Cromatografia Fase Móvel Fase Estacionária 
Gasosa (CG) Gás 
Líquida 
Sólida 
Líquida (LC) Líquida 
Líquida 
Sólida 
Supercrítica (CFS) Fluido Supercrítico 
Líquida 
Sólida 
Fonte: PASSOS, 2011 
2.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – HPLC 
Desde o início da cromatografia líquida, em 1950, até os dias atuais, muitos avanços 
foram alcançados e todos eles foram impulsionados pelo desenvolvimento contínuo de novas 
partículas de fases estacionárias que fossem capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes 
e estáveis química e mecanicamente. Nos últimos 40 anos, a cromatografia líquida de alta 
eficiência tem sido a técnica analítica mais desenvolvida, difundida e empregada em 
laboratórios de análise de indústrias químicas e farmacêuticas, em áreas médicas e em muitos 
outros campos da ciência e até em órgãos governamentais (MALDANER et al., 2009). 
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica físico-química indicada para 
separar e quantificar compostos de soluções líquidas e é utilizada para fins analíticos ou para 
fins preparativos e em escala comercial. A amostra é injetada por intermédio de uma micro 
seringa na coluna (cromatografia analítica) ou através de uma válvula de injeção (sistemas 
preparativos) e é distribuída homogeneamente no topo da coluna. Os componentes dessa 
amostra são carreados continuamente pela fase móvel de modo a superar a resistência da coluna 
ao escoamento da fase móvel. No processo de percolação os componentes migram com 
velocidades diferentes e são identificados na saída da coluna por um detector, dispositivo que 
examina continuamente a composição do material analisado gerando um sinal de passagem de 
cada composto chamado cromatograma (ASSIS, 2015). 
HPLC também é o tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por 
eluição. Essa técnica é utilizada pelos químicos para separar e determinar espécies em uma 
grande variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. Na cromatografia líquida, a 
fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a amostra na forma de uma mistura de solutos. 
O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido pelo mecanismo de 
separação ou pelo tipo de fase estacionária (SKOOG, 2006). Na Tabela 2 abaixo, pode-se 
observar, de modo geral, as classificações da cromatografia líquida: 
 8 
Tabela 2: Classificação simplificada da cromatografia líquida 
Classificação Fase Estacionária Mecanismo de Separação 
Líquido-líquido ou partição 
Líquido Adsorvido em 
um sólido 
Partição entre líquidos 
imiscíveis 
Líquido-sólido ou adsorção Sólido Adsorção 
Troca iônica Resina de troca iônica Troca Iônica 
Exclusão por tamanho Gel polimérico Filtração 
Afinidade Sólido Ligante de afinidade 
Quiral Agente de resolução 
quiral 
Complexação 
Fonte: PASSOS, 2011 
Sendo Passos (2011), a classificação da comatografia líquida de alta eficiência de partição 
ainda pode ser ampliada com base nas polaridades relativas das fases estacionária e móvel. 
Dessa forma, temos: Cromatografia de fase normal, onde a fase estacionária é polar e a fase 
móvel é apolar e, a Cromatografia em fase reversa, onde a fase estacionária é apolar e a fase 
móvel é polar. 
O tipo de HPLC mais utilizado é a cromatografia por partição, na qual a fase estacionária 
é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel. A cromatografia por partição 
pode ser subdividida em cromatografia líquido-líquido e cromatografia líquida com fase ligada. 
A diferença entre as duas está na forma com a qual a fase estacionária é imobilizada nas 
partículas de suporte do recheio. O líquido é imobilizado por adsorção física em cromatografia 
líquido-líquido, enquanto é retido por meio de ligações químicas na cromatografia líquida com 
fase ligada. Inicialmente a cromatografia por partição era exclusivamente do tipo líquido-
líquido; atualmente, contudo, os métodos de fase ligada predominam por causa de sua maior 
estabilidade. Os recheios do tipo líquido-líquido estão hoje em dia relegados a certas aplicações 
especiais (SKOOG, 2006). 
A cromatografia líquida de alta eficiência é distinguida por usar a fase móvel à alta 
pressão. O uso de pressões elevadas permite uma redução no diâmetro das partículas da fase 
estacionária, localizada no interior da coluna cromatográfica (FRANCO, 2015). 
Dessa forma, o uso de partículas menores (na ordem de 5,0 µm) no recheio da coluna 
resulta em uma área superficial (sítio de adsorção) maior, promovendo então uma separação 
mais eficiente dos componentes da amostra. Essa "miniaturização" das partículas da coluna 
torna possível o uso de colunas menores, volumes menores de amostras e um gasto menor de 
fase móvel. Assim sendo, em cromatografia líquida de alta eficiência é possível trabalhar na 
faixa dos microlitros (µL) (FRANCO, 2015). 
Com a evolução dos métodos analíticos, muita pesquisa tem sido realizada para melhorar 
ainda mais os métodos utilizados, sendo assim, hoje em dia são oferecidos também 
equipamentos chamados Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC), que trabalham 
 9 
com partículas de colunas ainda menores (até 0,01 µm) e pressões ultraelevadas (da ordem de 
15.000 psi). A utilização de suportes com partículas diminutas são os responsáveis pela alta 
eficiência desse método de cromatografia (FRANCO, 2015). 
O processo físico-químico envolvido na separação das substâncias em uma amostra é o 
mesmo para a HPLC e UPLC. A fase móvel (líquida) movimenta-se continuamente através da 
coluna contendo a fase estacionária (sólida). O soluto (substâncias contidas na amostra) interage 
com a fase estacionária e móvel por adsorção, partição, exclusão molecular, troca iônica. As 
separações podem se dar por adsorção (separação sólido líquido), partição (separação líquido 
líquido) ou ambos. O detector mais utilizado para análises por HPLC e UPLC é o detector de 
ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, 
eletroquímicos, entre outros (DEGANI et al., 1998). 
2.3.1. Instrumentação 
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é um tipo de cromatografia que emprega uma 
fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida. Por esta razão, o método requer 
o uso de equipamentos sofisticados capazes de suportar altas pressões (PASSOS, 2011). 
Basicamente, um cromatógrafo líquido pode ser dividido em seis partes: Reservatório e 
sistema de tratamento de solventes; Sistema de bombeamento; Injetor; Coluna, Detector 
e Registrador, como podem ser observadas na Figura 1 a seguir: 
Figura 1: Equipamento básico de HPLC a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de 
injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador 
 
Fonte: DEGANI et al., 1998 
Segundo Skoog (2006), os componentes básicos de um cromatógrafo líquido podem ser 
definidos da seguinte forma: 
 
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Reservatório e Sistema de Tratamento de Solventes: o reservatório consiste em um ou 
mais recipiente onde o solvente utilizado como fase móvel é armazenado e o sistema de 
tratamento consiste em um aparelho degaseificador, que retira os gases dissolvidos na fase 
móvel.Quando apenas um solvente é utilizado ou quando dois ou mais solventes são utilizados 
em proporções fixas durante toda a separação, esta é chamada de eluição isocrática. Quando a 
mistura de solventes varia durante a análise, é chamada de eluição gradiente. 
Sistema de Bombeamento: É um sistema de uma ou mais bombas que geram altas 
pressões, com boa reprodutibilidade de vazão, resistência à corrosão, etc. Há três tipos básicos 
de bombas utilizadas em cromatografia líquida de alta eficiência: a de seringa acionada por 
rosca; a bomba recíproca e a bomba pneumática de pressão constante. 
Injetor: O método mais empregado em cromatografia líquida de alta eficiência para 
introdução da amostra é baseado em um sistema de alça de amostragem, onde um determinado 
volume é colocado na alça e depois liberado para a coluna através da mudança da direção do 
fluxo da fase móvel. Esse sistema de alça também é empregado mesmo quando o equipamento 
dispõe de auto-amostrador. 
Coluna: Assim como na cromatografia gasosa, existe uma variedade imensa de colunas 
para cromatografia líquida. Estas colunas consistem de um tubo de aço inoxidável recheado 
com a fase estacionária. Por esta razão, varia em comprimento, diâmetro, tamanho de partícula 
e tipo de fase estacionária, dependendo da aplicação. Uma coluna analítica típica para 
cromatografia liquida de alta eficiência tem entre 10 e 30 cm de comprimento, 0,4 – 1,0 cm de 
diâmetro e tamanho de partícula 3-5 μm. Já as colunas preparativas são mais robustas, com 
diâmetro que pode chegar a 5 cm. As fases estacionária mais utilizadas em cromatografia em 
fase reversa são as de sílica ligada a cadeias carbônicas de 18 ou 8 átomos e em fase normal a 
de sílica. 
Detector: Um detector ideal deve ser sensível a pequenas concentrações de todos os 
analitos, fornecer uma resposta linear e não causar alargamento dos picos eluídos. Além disso, 
ele deve ser insensível às variações de temperatura e composição do solvente. Os tipos de 
detectores mais utilizados em cromatografia líquida são os de índice de refração, muito utilizado 
na determinação de açucares; fluorescência, para determinação de compostos aromáticos e 
arranjo de fotodiodo, que vem substituindo o UV-VIS, na determinação de compostos que 
absorvem a radiação ultravioleta ou visível. 
2.4. Aplicações na Engenharia Química 
A cromatografia é um método empregado de forma ampla e que permite a separação, 
identificação e determinação de componentes químicos em misturas complexas. Nenhum outro 
método é tão eficaz e de aplicação tão generalizada quanto à cromatografia. Ela permite que 
sejam determinados diversos compostos em uma única análise. É muito utilizada na indústria 
alimentícia, no controle de qualidade de seus produtos, na indústria farmacêutica, para 
separação de princípios ativos. É também utilizada para o monitoramento ambiental e em 
 11 
indústria de petróleo. Enfim, é infindável o número de possíveis aplicações da cromatografia, 
e este número continua crescendo (PASSOS, 2011). 
A seguir são apresentadas algumas pesquisas desenvolvidas na área de Engenharia 
Química, nas quais a cromatografia líquida é utilizada, reafirmando portanto, o quão ampla é a 
sua aplicação e a sua importância como método de análise. 
• Aplicações de cromatografia líquida de alta eficiência para o estudo de poluentes 
orgânicos emergentes (SILVA, C. G. A. da et al., 2011); 
• Avaliação do equilíbrio de adsorção e projeto de condições de separação de 
praziquantel por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (FARIAS, B. V., 2013); 
• Caracterização físico-química de resíduos oleosos do saneamento e dos óleos e graxas 
extraídos visando a conversão em biocombustíveis (OLIVEIRA, J. P. et al., 2014); 
• Contributo para a determinação simultânea, por cromatografia líquida de alta resolução, 
de carotenoides, vitamina A e vitamina E em amostras compostas por diferentes matrizes 
alimentares (SILVA, M. A. M. M., 2014); 
• Desenvolvimento e a validação de um método de cromatografia líquida de alta 
eficiência para determinação de Alquilbenzeno Linear Sulfonado (LAS) em amostras de águas 
provenientes de reatores anaeróbios (DUARTE, I. et al., 2006); 
• Determinação de compostos fenólicos por HPLC (SILVA, P. D., 2012); 
• Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar 
(GOUVEIA, E. R. et al., 2009); 
• Validação de um Método de Cromatografia de Alta Eficiência para Determinação de 
Conservantes em Géneros Alimentícios (COSTA, J. C. D., 2015). 
3. CONCLUSÃO 
A partir desse trabalho foi possível concluir que mesmo a cromatografia líquida de alta 
eficiência sendo uma técnica recente, ela já é uma das técnicas mais utilizadas em análises de 
rotina em diversas áreas. Esta rápida difusão do método está relacionada principalmente ao 
desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta 
eficiência, sua grande aplicabilidade a uma variedade de amostras, assim como a 
disponibilidade da instrumentação totalmente desenvolvida. 
Conclui-se também que o método tem uma importância muito grande no setor industrial, 
principalmente nas indústrias químicas, uma vez que é imprescindível a análise de compostos 
e produtos, principalmente no controle de qualidade, na separação de compostos e no controle 
de poluição ambiental. 
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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
ASSIS, R. M. Cromatografia: Importância e Aplicações. BetaEQ, 2015. Disponível em: 
<https://betaeq.com.br/index.php/2015/10/25/cromatografia-importancia-e-aplicacoes/>. 
Acesso em: 13 de março de 2019. 
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um breve ensaio. Química 
nova na escola, v. 7, n. 1, 1998. 
FRANCO, L. G. Cromatografia Verde. 2015. 
MALDANER, L. et al. O estado da arte da cromatografia líquida de ultra eficiência. 
Química Nova, 2009. 
PASSOS, E.A. Métodos instrumentais de análise – São Cristóvão: Universidade Federal de 
Sergipe, CESAD, 2011. 
SILVA, C. G. A. da et al. Aplicações de cromatografia líquida de alta eficiência para o 
estudo de poluentes orgânicos emergentes. Química Nova, 2011. 
SKOOG, D. A. et al. Fundamentos de Química Analítica, 8ª edição. São Paulo, SP: Thomson 
Learning, 2006. 
 
https://betaeq.com.br/index.php/2015/10/25/cromatografia-importancia-e-aplicacoes/
	1. INTRODUÇÃO
	2. DESENVOLVIMENTO
	2.1. Objetivos
	2.2. A Cromatografia
	2.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – HPLC
	3. CONCLUSÃO
	4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS