Cromatografia - 18 de setembro

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA 
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
	
	COMPONENTE CURRICULAR: Fitoquímica
	
	PROFESSOR: Harley da Silva Alves
	
	ALUNO: Anna Júlia de Souza Freitas
Exercício de avaliação
1. Em um estudo de uma amostra vegetal foi utilizado cromatografia em camada delgada com eluição em gradiente para tentar identificar a presença de uma determinada substância na amostra A, sendo que na amostra P é utilizado um composto conhecido puro. Cite exemplos de fase móvel que podem ter sido utilizados na ordem de eluição. Observando a imagem abaixo, o que você tem a dizer comparando A com P? Numere as substâncias como quiser e explique quem tem menor Rf e qual a mais lipofílica.
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1
Fase móvel: hexano ou ácido acético.
		Os componentes que formam a amostra (A) eluem de forma ascendente em diferentes velocidades e se separam devido às interações com a fase móvel e com a fase estacionária. O padrão (P) corresponde a uma substância química pura vinculada a apenas uma mancha. A amostra é composta por, no mínimo, três substâncias, e uma delas possivelmente é a mesma substância do padrão utilizado, uma vez que a segunda mancha da amostra tem a mesma altura de eluição em relação a mancha do padrão.
		Tendo em vista que o fator de retenção (Rf) é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente, a ordem de Rf é A3>A2>A1, sendo o P semelhante em Rf ao A2, então provavelmente são a mesma substância. 
	A A3 é a substância mais lipofílica. A fase móvel é composta por solventes apolares, portanto lipofílicos, e a substância A3 está sendo carregada devido a sua afinidade pela fase móvel apolar, apresentando, então, a mesma característica. 
2. Liste duas fases estacionárias comuns usadas em cromatografia em coluna. Qual(is) fase(s) móvel(is) pode(m) ser usada(s)?
	Duas fases estacionárias comuns são a sílica e a alumina. Em relação à fase móvel, podem ser utilizados compostos em sua maioria orgânicos, como clorofórmio, éter de petróleo, hexano, etanol e acetona. Em alguns casos, a água também é utilizada.
3. Qual o principal pré-requisito de uma amostra para uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência?
	A amostra deve ser solúvel na fase móvel. 
4. Explique o que é cromatografia de fase normal e de fase reversa. Qual a diferença na eluição dos componentes?
	Cromatografia de fase normal: a fase estacionária está ligada a grupos polares, logo, é mais polar que a fase móvel. O solvente mais polar tem força eluente maior.
	Cromatografia de fase reversa: a fase estacionária contém grupos apolares ligados, sendo menos polar que a fase móvel. O solvente menos polar tem força eluente menor.
5. Cromatografia de fase normal: fase estacionária mais polar que a fase móvel. 
6. • Cromatografia de fase reversa: fase estacionária menos polar que a fase móvel. 
5. Quais as principais características da fase móvel em CLAE?
	A fase móvel utilizada nesse tipo de cromatografia devem dissolver a amostra sem qualquer interação química entre ambas, possuir alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). Além disso, a fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. 
6. Explique a diferença de eluição isocrática e por gradiente de solvente em uma análise de CLAE.
	A eluição isocrática é uma eluição com fase móvel formada por um único solvente ou por uma mistura de solventes de composição constante. Já a eluição por gradiente é uma eluição com fase móvel formada por uma mistura de solventes, com composição variável ao longo da separação. 
7. Na imagem abaixo existe uma representação de um cromatógrafo líquido de alta eficiência. Fale sobre os componentes e os principais cuidados que o analista deve ter para preservar a vida útil deste equipamento.
	Reservatório de fase móvel: Recipiente contendo fase móvel que será bombeada dentro do sistema analítico. É imprescindível que a fase móvel possua alto grau de pureza ou seja de fácil purificação, para que não cause danos a bomba, ademais, deve haver filtração antes do armazenamento da fase móvel no reservatório, e a escolha do filtro se dá de acordo com a natureza na fase móvel, usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5 m).
	Sistema de bombeamento de fase móvel: Sistema de bombeamento para que a fase móvel consiga migrar com vazão constante para a fase estacionária, uma vez que é fundamental que a vazão seja constante para separações por CLAE. A bomba não deve ser corroída pelas fases móveis empregadas, portanto, materiais nobres são utilizados para a construção da mesma, como sede de safira e esfera de rubi.
Sistema de injeção: Realiza a injeção da amostra no sistema com precisão e exatidão adequada, devido a válvulas especiais que permitem introdução de volumes de maneira bastante precisa. 
Coluna cromatográfica: O equipamento usa colunas de aço de material polimérico, com um comprimento de 5 a 30 cm e um diâmetro interno de 1 a 5 mm. Essas colunas têm custo elevado e se degradam com facilidade pela ação de poeira ou de partículas sólidas presentes na amostra e no solvente e pela adsorção irreversível de impurezas, também provenientes da amostra ou do solvente. A entrada da coluna principal é protegida por uma pequena pré-coluna contendo a mesma fase estacionária presente na coluna principal.  O dispositivo de alocação da coluna é termostatizado. 
Detector: O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico, gerando um cromatograma, cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado. Há vários tipos de sistemas de detecção, como ultravioletas, índice de refração, eletroquímico, evaporativo com espalhamento de luz, espectrometria de massa, dentre outros. 
Sistema de aquisição e registro de dados: O sinal do detector é recebido e registrado por um computador que processa, armazena, e reproduz dados. Atualmente utilizam-se softwares que permitem, além do processamento dos dados de cromatograma, controlar a composição da fase móvel e a vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna, entre outras funcionalidades.
	A fim de prolongar a vida útil do equipamento, deve-se ater ao uso de materiais e substâncias com as características adequadas, como já citado; evitar ação de impurezas ou partículas impróprias ao sistema; as manutenções devem ser frequentes e realizadas de maneira preventiva, e o analista deve estar qualificado a usar o equipamento.
8. Por que a cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas e qual sua principal limitação?
		Por possuir alto poder de resolução, permitindo a análise de muitos componentes de uma única amostra, inclusive a partir de pequenas quantidades de amostra. Sua utilização, no entanto, é limitada a separação e análise de misturas cujos constituintes sejam substâncias voláteis e estáveis termicamente.
9. Em cromatografia gasosa, explique a função do gás de arraste e quais as características desse gás para uma separação adequada.
O gás de arraste é utilizado para transportar a amostra através da coluna da cromatografia gasosa. O gás deve ser inerte, para que não reaja com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento, sendo os gases mais utilizados o hélio, o nitrogênio, argônio e o hidrogênio. Ele também deve ser compatível com o detector e possuir alto grau de pureza.
10. arâmetros para a seleção: Não interagir com a fase estacionária nem com a amostra 
11. Cite as principais características das amostras utilizáveis em cromatografia gasosa e fale como ocorre a separação cromatográfica em um cromatógrafo a gás.
	Geralmente as amostras utilizáveis são gasese misturas cujos constituintes sejam volatilizáveis, ou seja, que não degradem em altas temperaturas. 
	A amostra, por injeção, é introduzida em uma coluna contendo a fase estacionária. A injeção pode ser feita com ou sem divisão da amostra que está sendo injetada. O uso de temperaturas no local da injeção da amostra e na coluna permite a vaporização dessas substâncias e, de acordo com suas propriedades físico-químicas e as propriedades da fase estacionária, são retidas em diferentes tempos, chegando ao final da coluna e atingindo o detector. A separação é feita em uma coluna, contendo a fase estacionária, que pode ser sólida ou líquida, e que por ela passa um fluxo contínuo de gás inerte (fase móvel) em um forno com temperatura controlada. Quando a amostra é inserida no injetor, cada componente da amostra presente na fase móvel e na estacionária é direcionado para o detector, pois estes são transportados por essa corrente de gás. As substâncias presentes na amostra são separadas e quando atingem o detector geram um sinal para um sistema de registro e tratamento de dados.
12. Em uma análise de uma amostra por cromatografia gasosa foi observado a presença de cinco picos, como podemos observar no cromatograma abaixo:
Explique como o ajuste da temperatura do forno pode melhorar a separação cromatográfica.
	O tempo que o analito leva para percorrer a coluna depende da temperatura. O aumento de temperatura aumenta a pressão de vapor e a velocidade de migração das moléculas, e o analito passa a eluir mais rapidamente. Ao se aumentar a temperatura, os picos têm um tempo de retenção menor, devido a maior volatilização. Se o forno é configurado a uma temperatura muito alta, pode haver sobreposição dos picos, dificultando a identificação de cada amostra, pois o ideal para análise é que os picos estejam separados e bem definidos. A programação de temperatura do forno pode ser feita de maneira a variar linearmente, iniciando a baixas temperaturas (isotermicamente por determinado intervalo de tempo) e aumentar aos poucos, para que os compostos sejam volatilizados gradativamente, e dessa forma, os picos sejam organizados. 
12 - Durante a caracterização de compostos fenólicos presentes no pó da erva mate, um pesquisador obteve um cromatograma com sete compostos identificados (Tabela 2). O mesmo realizou as análises com Alíquotas (10 μL/amostra), as quais foram injetadas em cromatógrafo líquido (Shimadzu LC- 10), equipado com coluna de fase reversa (Shim-pack C18, 4,6 mm x 250 mm, 5μm), termo-estabilizada a 40°C, detector UV-visível (Shimadzu SPD 10A, λ = 280 nm) e sistema com processador de dados. Como fase móvel, uma solução de água:ácido acético:η-butanol (350:1:10, v/v/v) foi utilizada com fluxo de 0,8 mL/min (VIEIRA et al., 2009). Diante da análise do método utilizado e correlacionando com os dados da tabela 2, indique quais os compostos com maior e menor polaridade (de acordo com o tempo de retenção)? E justifique o uso da coluna de fase reversa para tal análise.
 
Componentes organizados dos mais polares aos menos polares: ácido gálico, ácido clorogênico, ácido p-cumárico, ácido siríngico, ácido caféico (3,4 dihidroxicinâmico), ácido ferúlico, ácido 4,5 dicafeoilquínico.
Utilizou-se a fase reversa por ser um método rápido, no qual há o equilíbrio do sistema e a eluição de diversos compostos (hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias lipofílicas). O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente apolar à fase móvel e diminui com a introdução de solventes hidrofóbicos.