Clonagem Molecular

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DNA RECOMBINANTE 
Oque é: Inserção de um fragmento de DNA 
em um vetor de clonagem que pode ser 
replicado numa bactéria (Ex: E. coli) 
Aplicação: 
• Estudos da expressão de genes 
• Modificação de organismos com a 
introdução de novos genes e novas 
características 
• Produção de proteínas 
• Facilita o estudos de doenças genéticas, 
tratamento e diagnóstico 
 
 
ETAPAS DA CLONAGEM: 
1. Isolamento do DNA do organismo 
2. Clivagem com enzima de restrição 
3. Clivar o vetor com a mesma enzima 
4. Ligar o DNA ao vetor 
5. Transformação bacteriana 
6. Seleção do clone recombinante 
contendo o gene de interesse 
 
Etapas isolamento do DNA 
1. Tecido é homogeneizado com tampão 
2. Amostra é tratara com proteinase K e 
detergente 
3. Solução saturada de NaCl é adicionada, 
depois agitada vigorosamente e incubada 
em gelo 
4. Centrifuga e remove o sobrenadante 
5. Adiciona isopropanol para precipitar o 
DNA 
6. DNA recuperado por centrifugação 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
(ENDONUCLEASES) 
• Enzimas presentes em bactérias que 
reconhecem sequencias especificas do 
DNA de dupla fita e clivam em bases 
específicas. Exemplo: EcoRI 
• A análise dos fragmentos de DNA pós 
clivagem é feita por eletroforese em gel 
de agarose 
VETOR DE CLONAGEM 
PLASMÍDEO 
• Molécula de DNA que possibilita a 
inserção do fragmento de DNA estranho 
• O plasmídeo pode se manter 
independente ou ser integrado ao 
cromossomo. 
• Características: 
1. Presença de ORI (origem de 
replicação)→ permite a repicação 
independente 
2. Marca de resistência à antibiótico → 
indicador de seleção 
3. Múltiplos sítios de clonagem (Polylinker) 
→ sítios para as enzimas de restrição 
4. Promotor → promove a expressão do 
gene 
OBS: essas são as regiões mais comuns, porém 
nem todo plasmídeo possui ORI, ou o marcador 
com o antibiótico 
 
FAGO LAMBDA 
• É outro exemplo de vetor. 
• A vantagem dele e que pode ser usado 
um segmento maior de DNA para a 
clonagem (25kb) 
COSMÍDEO 
• Junção do plasmídeo com o fago 
lambda. Possui o sítio Cos que permite o 
empacotamento do DNA na cabeça do 
fago. 
• Vantagens: Alta eficiência na 
transformação; fragmento de DNA 
maior (até 45kb) 
 
YAC 
• Cromossomo artificial da levedura 
• Carrega segmentos até 2Mb 
• Eficiência de transformação é baixa 
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA: 
São os métodos pelos quais o plasmídeo 
recombinado, ou o gene de interesse e vetor 
linearizado (no caso da recombinação in vivo) 
são inseridos na bactéria 
• Choque térmico e eletroporação: deixa 
a membrana da bactéria sensibilizada 
para a inserção do plasmídeo 
SELEÇÃO DO RECOMBINANTE