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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Mariana Sarkis Müller ESTUDO QUÍMICO, BIOLÓGICO E PADRONIZAÇÃO DAS PARTES AÉREAS E DO SOLO DE CULTIVO DE Portulaca pilosa L. (PORTULACACEAE) Belém 2012 Mariana Sarkis Müller ESTUDO QUÍMICO, BIOLÓGICO E PADRONIZAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS PARTES AÉREAS DE Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) Belém 2012 Defesa de tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química para obtenção do grau de Doutora em Química. Orientador Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva Mariana Sarkis Müller ESTUDO QUÍMICO, BIOLÓGICO E PADRONIZAÇÃO DAS PARTES AÉREAS E DO SOLO DE CULTIVO DE Portulaca pilosa L. (PORTULACACEAE) Data da aprovação: Banca Examinadora _________________________________ Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva Orientador ICEN-UFPA _______________________________ Profa. Dra. Regina Celi Sarkis Müller Co-orientadora ICEN-UFPA _________________________________ Profa. Dra. Mara Silvia Pinheiro Arruda Membro ICEN-UFPA _________________________________ Profa. Dra. Simone de Fátima P. Pereira Membro ICEN-UFPA __________________________________ Prof. Dr. Marcelo de Oliveira Lima Membro IEC-SAMAM ___________________________________ Prof. Dra. Gilmara de Nazareth Tavares Bastos Membro ICB-UFPA Defesa de tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química para obtenção do grau de Doutora em Química. Orientador Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva AGRADECIMENTOS À Deus pela vida e proteção diária. Ao meu filho amado, Gustavo, por ter me tornado a mulher mais feliz e completa do mundo, por me permitir sentir este amor inigualável. Te amo mais que tudo! Ao meu marido e amigo Carlos Jr pelo amor e companheirismo, principalmente pela compreensão nos momentos de dificuldade. Te amo muito!!! Aos meus pais e irmãos pelo amor e apoio incondicionais nesta etapa do trabalho. Amo muito vocês! Ao meu orientador Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva e co-orientadora Profa. Dra. Regina Celi Sarkis Müller, pela orientação, oportunidade e aprendizado. Aos amigos dos laboratórios LACQUAMA E LABCROL pela amizade e companheirismo, em especial a, Sônia Pamplona, Consuelo Yumiko e Silva, Ana Carolina dos Santos, Neuton Jr, Mikaylan Sousa, Lorena Mendes, Daniela Ferreira, Antônio da Luz, Antônio Silva, Vanessa Souza e Gabriel Pontes. Aos meus amigos mais do que especias, Joanne Moraes, Valéria Lima, Danila Valeriano e Victor Bechir, pela amizade, carinho e cumplicidade. Ao Prof. José Berredo pelo apoio incondicional e por ter se tornado uma pessoa tão especial em minha vida. Ao apoio do Museu Emilio Goeldi na execução de algumas análises, em especial a Profa. Dra. Cristine Amarantes. Aos profissionais e amigos do Instituto Evandro Chagas, em especial ao Prof. Dr. Marcelo Lima e Kelson Faial pela oportunidade, aprendizado e confiança. Muito obrigada! A Embrapa Amazônia Oriental (Herbário IAN) pela coleta e identificação da espécie. Á CAPES, pela bolsa concedida. MEMORIAL Trabalhos apresentados em Congresso: 1. Avaliação da composição mineral do chá das partes aéreas secas de Portulaca pilosa L. (Portulacaceae). II Congresso Brasileiro de Recursos Genéticos, setembro de 2012, Belém-Pa. 2. Caracterização físico-química do solo de cultivo da espécie Portulaca pilosa L. em diferentes períodos sazonais. II Congresso Brasileiro de Recursos Genéticos, setembro de 2012, Belém-Pa. 3. Análise físico-química das partes aéreas de Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) em diferentes períodos sazonais. II Congresso Brasileiro de Recursos Genéticos, setembro de 2012, Belém-Pa. Trabalhos de Conclusão de Curso: 1. Neuton Trindade Vasconcelos Júnior. Avaliação da composição mineral do chá da folha seca de Portulaca pilosa L. e caracterização físico- química do solo de cultivo em diferentes períodos sazonais. Instituto de Ciências Exatas e Naturais, 2011. 2. Mikaylan de Oliveira Sousa. Controle físico, físico-químico e microbiológico de partes aéreas de Portulaca pilosa L. (Portulacaceae). Instituto de Ciências Exatas e Naturais, 2013. SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT 1 - INTRODUÇÃO ........................................................................................... 20 2 - OBJETIVOS ............................................................................................... 24 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................... 25 3.1. A importância das plantas medicinais e o uso de chás caseiros ........... 25 3.2. Controle de qualidade de Plantas Medicinais ........................................ 31 3.3. A espécie Portulaca pilosa L. ................................................................ 36 3.3.1. Aspectos botânicos de Portulaca pilosa L. ...................................... 36 3.3.2. Considerações gerais sobre a família Portulacaceae e a espécie Portulaca pilosa L. ..................................................................................... 39 3.3.3. Composição química comprovada ................................................. 41 3.3.4 Farmacologia e atividade biológica cientificamente comprovada da espécie Portulaca pilosa L. ........................................................................ 41 3.4. A interação solo-planta, seus nutrientes e benefícios ao homem ......... 42 3.4.1. Magnésio ......................................................................................... 48 3.4.2. Cálcio .............................................................................................. 51 3.4.3. Cobre ............................................................................................... 54 3.4.4. Zinco ................................................................................................ 57 3.4.5. Manganês ........................................................................................ 59 3.4.6. Ferro ................................................................................................ 62 4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 65 4.1. Portulaca pilosa L. ................................................................................. 65 4.1.1. Coleta e Preparo do Material Vegetal .............................................. 65 4.1.2. Identificação Botânica ..................................................................... 66 4.1.3. Determinação da umidade/ perda por dessecação ......................... 67 4.1.4. Determinação granulométrica.......................................................... 67 4.1.5. Densidade Aparente ........................................................................ 69 4.1.6. Determinação do pH ........................................................................ 69 4.1.7. Determinação do teor de cinzas totais ............................................ 69 4.1.8. Determinação de cinzas insolúveis em ácido .................................. 69 4.1.9. Determinação da Condutividade Elétrica ........................................ 70 4.1.10. Determinação do teor de extrativos ............................................... 70 4.1.11. Análise Microbiológica da Droga Vegetal ...................................... 71 4.1.11.1. Preparo da amostra vegetal ................................................... 71 4.1.11.2. Contagem de Bactérias mesófilas, bolores e leveduras ........ 71 4.1.11.3. Pesquisa de Coliformes totais (CT) e Escherichia coli ........... 71 4.1.11.4. Pesquisa de Salmonellasp. ................................................... 72 4.1.12. Digestão do pó vegetal .................................................................. 73 4.1.13. Preparo das infusões (chás) .......................................................... 76 4.1.13.1. Avaliação da exatidão do método de infusão ......................... 76 4.1.14. Avaliação da atividade cicatrizante e anti-inflamatória do extrato etanólico das partes aéreas de Portulaca pilosa L. ................................... 80 4.1.14.1. Animais experimentais ........................................................... 80 4.1.14.2. Isquemia de Reperfusão ........................................................ 80 4.1.14.3. Análise Quantitativa da área da Lesão Isquêmica ................. 81 4.1.14.4. Tecido Necrótico .................................................................... 81 4.1.14.5. Avaliação da vasodilatação dos grupos experimentais e retirado do exsudato da região ............................................................. 81 4.1.14.6. Avaliações da Migração Celular ............................................. 81 4.1.14.7. Avaliações da produção de óxido nítrico a partir do exsudato 82 4.1.14.8. Histoquímica .......................................................................... 82 4.1.15. Avaliação do perfil químico do extrato etanólico das partes aéreas de Portulaca pilosa L. ................................................................................ 83 4.2. Solo de Cultivo ...................................................................................... 83 4.2.1. Coleta e Preparo do Solo de Cultivo ............................................... 83 4.2.2. Amostragem .................................................................................... 84 4.2.3. Secagem do Solo ............................................................................ 85 4.2.4. Destorroamento ............................................................................... 86 4.2.5. Peneiração ...................................................................................... 86 4.2.6. Umidade .......................................................................................... 87 4.2.7. Densidade Aparente ........................................................................ 87 4.2.8. Determinação do pH ........................................................................ 87 4.2.8.1. Com solução aquosa: .............................................................. 87 4.2.8.2. Com solução de KCl 1N: .......................................................... 88 4.2.9. Condutividade elétrica ..................................................................... 88 4.2.10. Determinação da acidez ................................................................ 88 4.2.11. Determinação da matéria orgânica pelo método de Walkley-Black Modificado ................................................................................................. 89 4.2.12. Digestão do solo de cultivo ............................................................ 90 4.2.13. Extração do solo: ........................................................................... 90 4.2.13.1. Avaliação da exatidão do método de extração do solo .......... 92 4.3. Instrumentos e acessórios ..................................................................... 95 4.4. Reagentes e Soluções: ......................................................................... 96 CAPÍTULO I .......................................................................................................... 98 AVALIAÇÃO FÍSICA, FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DAS PARTES AÉREAS DE Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) EM DIFERENTES PERÍODOS SAZONAIS. .................................................................................... 99 1. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 101 1.1. Determinação das propriedades físicas e físico-químicas das partes aéreas de P. pilosa ..................................................................................... 101 1.1.1. Determinação da umidade ou perda por dessecação: .................. 101 1.1.2. Determinação da granulometria do pó .......................................... 103 1.1.3. Determinação do teor de cinzas totais e insolúveis em ácido ....... 105 1.1.4. Determinação do pH ...................................................................... 107 1.1.5. Determinação da densidade .......................................................... 109 1.1.6. Determinação da condutividade elétrica ........................................ 110 1.1.7. Determinação do teor de extrativos ............................................... 112 1.2. Avaliação microbiológica do pó das partes aéreas de P. pilosa L. ...... 114 1.3. Correlação entre os parâmetros físicos e físico-químicos das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco ...................... 118 2. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 123 CAPÍTULO II ....................................................................................................... 124 AVALIAÇÃO FÍSICA E FÍSICO-QUÍMICA DO SOLO DE CULTIVO DA ESPÉCIE Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) EM DIFERENTES PERÍODOS SAZONAIS. ...................................................................................................... 125 1. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 127 1.1. Avaliação das propriedades físicas e físico-químicas do solo de cultivo da espécie Portulaca pilosa L. .................................................................... 127 1.1.1. Determinação da umidade ............................................................ 127 1.1.2. Determinação da densidade .......................................................... 130 1.1.3. Determinação do pH ...................................................................... 133 1.1.4. Determinação da acidez ................................................................ 136 1.1.5. Determinação da condutividade elétrica ........................................ 137 1.1.6. Determinação da matéria orgânica ................................................ 139 1.2. Correlação entre os parâmetros físicos e físico-químicos do solo de cultivo nos períodos chuvoso e seco .......................................................... 141 2. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 146 CAPÍTULO III ...................................................................................................... 147 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE E ANTI-INFLAMATÓRIA E ANÁLISE DO PERFIL QUÍMICO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS PARTES AÉREAS DE Portulaca pilosa L. .................................................................... 148 1. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 150 1.1. Avaliação da atividade cicatrizante e anti-inflamatória do extrato etanólico das partes aéreas de Portulaca pilosa L. .................................... 150 1.2. Avaliação da Área Necrótica ............................................................... 151 1.3. Avaliação do Volume de Exsudato ...................................................... 152 1.4. Avaliação da Migração Celular ............................................................ 153 1.5. Avaliação do Corte Histológico ............................................................ 154 2. Análise do perfil químico do extrato etanólico das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco ......................................... 156 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 160 CAPÍTULO IV ......................................................................................................161 AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MINERAL DO CHÁ DAS PARTES AÉREAS SECAS DE Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) E DO SOLO DE CULTIVO POR ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO ÓTICA POR PLASMA ACOPLADO INDUTIVAMENTE (ICP-OES) .......................................................................... 162 1. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 164 1.1. Determinação mineral na digestão do solo de cultivo de Portulaca pilosa L. ................................................................................................................ 164 1.2. Análise da concentração dos metais no pó vegetal e nas infusões (chás) ................................................................................................................... 167 1.3. Análise da concentração dos metais em uma xícara de chá padrão de 200 mL ....................................................................................................... 169 2. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 173 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 174 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Portulaca pilosa L. Fonte: A autora. ...................................................... 36 Figura 2: Portulaca oleraceae L ........................................................................... 38 Figura 3: Estruturas das substâncias isoladas das partes aéreas e raízes de Portulaca pilosa L. ................................................................................................. 41 Figura 4: Partes aéreas de Portulaca pilosa L. coletadas em Ananindeua. Foto: A autora. ................................................................................................................... 66 Figura 5: (A) Higienização das partes aéreas; (B) Secagem em estufa a 45ºC; (C) Partes aéreas secas; (D) Pulverização em moinho de facas. Fotos: A autora. ..... 66 Figura 6: Exsicata da espécie Portulaca pilosa L. ................................................ 67 Figura 7: Pontos de coleta do solo de cultivo da espécie Portulaca pilosa L., localizado em Ananindeua. Foto: A autora. ........................................................... 84 Figura 8: (A) Coleta do solo na profundidade de 0,1 metros; (B) e (C) Coleta das amostras de solo nos diferentes pontos da horta, armazenadas em saco plástico; (D) Nove amostras coletadas em cada período. Fotos: A autora. ......................... 85 Figura 9: Homogeneização das amostras de solo em caixa de papelão. Foto: A autora. ................................................................................................................... 86 Figura 10: Destorroamento do solo seco com pontos endurecidos. Foto: A autora. .............................................................................................................................. 86 Figura 11: Peneiração do solo. Foto: A autora. .................................................... 87 Figura 12: Inserção da placa de aço na região dorsal da costa do rato macho adulto. ................................................................................................................. 150 Figura 13: Esquema dos ciclos de reperfusão, lesão isquêmica e tratamento do tecido necrosado. ................................................................................................ 151 Figura 14: Comparação dos cortes histológicos dos tecidos tratados com extrato de Portulaca pilosa L. e com o fármaco Dersani. ................................................ 155 Figura 15: Cromatograma com o perfil químico comparativo entre a 1º coleta (cor azul) e 2º coleta (cor vermelha) a um comprimento de onda de 320 nm. ........... 157 Figura 16: Cromatograma com o perfil químico comparativo entre a 3º coleta (cor preta) e 4º coleta (cor azul) a um comprimento de onda de 320 nm. .................. 157 Figura 17: Cromatograma com o perfil químico comparativo entre a 1º coleta (cor preta) e 2º coleta (cor vermelha) a um comprimento de onda de 294 nm. .......... 158 Figura 18: Cromatograma com o perfil químico comparativo entre a 3º coleta (cor preta) e 4º coleta (cor azul) a um comprimento de onda de 294 nm. .................. 158 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Classificação dos pós vegetais quanto a granulometria. ...................... 68 Tabela 2: Limites microbiológicos para produtos de origem vegetal, mineral e/ou animal. ................................................................................................................... 73 Tabela 3: LDs e LQs para os metais analisados na digestão do pó vegetal. ........ 74 Tabela 4: Amostras certificadas e recuperações utilizadas para validação da metodologia de digestão das partes aéreas de Portulaca pilosa L. ...................... 75 Tabela 5: Recuperações e equações da reta das adições padrões para a infusão. .............................................................................................................................. 77 Tabela 6: LDs e LQs para os metais analisados na digestão do solo. .................. 91 Tabela 7: Amostras certificadas e recuperações utilizadas para validação da metodologia de digestão do solo de cultivo de P. pilosa. ...................................... 92 Tabela 8: Recuperações e equações da reta das adições padrões para o solo. .. 93 Tabela 9: Condições do equipamento e comprimentos de onda utilizados no ICP- OES. ...................................................................................................................... 96 Tabela 10: Parâmetros físico-químicos das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ............................................................................. 103 Tabela 11: Análise da granulometria do pó das partes aéreas de Portulaca pilosa L. ......................................................................................................................... 104 Tabela 12: Resultado da avaliação da qualidade microbiológica das partes aéreas de Portulaca pilosa L. segundo a Farmacopéia Brasileira, 2005......................... 117 Tabela 13: Correlação, equação da reta e R2 (%) dos parâmetros analisados nas partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ................... 119 Tabela 14: Teores de umidade em diferentes períodos para o solo de cultivo de Portulaca pilosa L. ............................................................................................... 128 Tabela 15: Parâmetros físicos e físico-químicos do solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. .............................................................. 132 Tabela 16: Correlação, equação da reta e R2 (%) dos parâmetros analisados no solo de cultivo nos períodos chuvoso e seco. ..................................................... 143 Tabela 17: Teores totais e biodisponíveis dos metais analisados no solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ......................................... 164 Tabela 18: Parâmetros físico-químicos analisados para as amostras de solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco ............................... 167 Tabela 19: Teores dos metais presentes no pó vegetal e na infusão das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ............................. 169 Tabela 20: Massas (mg) calculadas dos metais para uma xícara de chá padrão (200mL) a partir das concentrações obtidas nas infusões em comparação com valores de referência. .......................................................................................... 171 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Adição padrão infusão (Fe). .................................................................78 Gráfico 2: Adição padrão infusão (Mn). ................................................................ 78 Gráfico 3: Adição padrão infusão (Sr). ................................................................. 78 Gráfico 4: Adição padrão infusão (Zn). ................................................................. 78 Gráfico 5: Adição padrão infusão (Ba). ................................................................ 78 Gráfico 6: Adição padrão infusão (Al). .................................................................. 78 Gráfico 7: Adição padrão infusão (Mg). ................................................................ 79 Gráfico 8: Adição padrão infusão (K). .................................................................. 79 Gráfico 9: Adição padrão infusão (Zn). ................................................................. 79 Gráfico 10: Adição padrão infusão (Cu). .............................................................. 79 Gráfico 11: Adição padrão infusão (Cr). ............................................................... 79 Gráfico 12: Adição padrão infusão (Ni). ............................................................... 79 Gráfico 13: Adição padrão solo (Ni). .................................................................... 93 Gráfico 14: Adição padrão solo (Fe). .................................................................... 93 Gráfico 15: Adição padrão solo (Mn). ................................................................... 94 Gráfico 16: Adição padrão solo (Al). ..................................................................... 94 Gráfico 17: Adição padrão solo (Ba). ................................................................... 94 Gráfico 18: Adição padrão solo (Zn). .................................................................... 94 Gráfico 19: Adição padrão solo (Cu). ................................................................... 94 Gráfico 20: Adição padrão solo (Cr). .................................................................... 94 Gráfico 21: Adição padrão solo (Sr). .................................................................... 95 Gráfico 22: Adição padrão solo (K). ..................................................................... 95 Gráfico 23: Adição padrão solo (Ca). ................................................................... 95 Gráfico 24: Adição padrão solo (Mg). ................................................................... 95 Gráfico 25: Teor de umidade (%) das partes aéreas de P. pilosa nos períodos chuvoso e seco. .................................................................................................. 102 Gráfico 26: Correlação entre cinzas totais e insolúveis em ácido (%) das partes aéreas de P. pilosa nos diferentes períodos sazonais. ....................................... 107 Gráfico 27: Valores de pH das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco ................................................................................................... 108 Gráfico 28: Variação sazonal da densidade do pó das partes aéreas de P. pilosa. ............................................................................................................................ 110 Gráfico 29: Valores de condutividade elétrica das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. .............................................................. 112 Gráfico 30: Valores do teor de extrativos das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ............................................................................. 114 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155533 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155534 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155535 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155536 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155537 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155538 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155539 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155540 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155541 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155542 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155543 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155544 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155545 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155546 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155547 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155548 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155549 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155550 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155551 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155552 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155553 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155554 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155555 file:///C:/Documents%20and%20Settings/Júnior/Meus%20documentos/Nana_Doutorado/QUALIFICAÇÃO/QUALIFICAÇÃO%20DEFINITIVA_MARIANA.docx%23_Toc384155556 Gráfico 31: Correlação entre os parâmetros analisados nas partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. .............................................. 118 Gráfico 32: Correlação entre condutividade elétrica e perda por dessecação das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco .................... 120 Gráfico 33: Correlação entre condutividade elétrica e perda por dessecação das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ................... 121 Gráfico 34: Correlação entre teor de extrativos e condutividade elétrica das partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ............................. 121 Gráfico 35: Teores de umidade para o solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco.....................................................................................130 Gráfico 36: Valores de densidade do solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco..................................................................................... 133 Gráfico 37: Valores de pH do solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. .................................................................................................. 135 Gráfico 38: Valores de acidez no solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco..................................................................................... 137 Gráfico 39: Variação sazonal da condutividade elétrica no solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. .............................................. 139 Gráfico 40: Teores de matéria orgânica do solo de cultivo de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco. ............................................................................. 141 Gráfico 41: Correlação entre os parâmetros analisados nas partes aéreas de Portulaca pilosa L. nos períodos chuvoso e seco ............................................... 142 Gráfico 42: Correlação entre condutividade elétrica e umidade do solo de cultivo nos períodos chuvoso e seco. ............................................................................. 144 Gráfico 43: Correlação entre pH KCl e condutividade elétrica do solo de cultivo nos períodos chuvoso e seco. ............................................................................. 145 Gráfico 44: Avaliação da área necrótica após tratamento. ................................. 152 Gráfico 45: Avaliação do volume de exsudato após tratamento. ........................ 153 Gráfico 46: Avaliação da migração celular após tratamento. ............................. 154 LISTA DE ABREVIATURAS ABA - Ácido Abscísico ADP - Adenosina Difosfato AIA - Ácido Indolacético ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC - American Type Colection Culture ATP - Adenosina Trifosfato cmolc kg-1 - centimolc por kilograma CF - Coliformes Fecais CL - Caldo Lactosado CT - Coliformes Totais CTC - Capacidade de troca catiônica DNA - Ácido Desoxirribonucleico Ds - Densidade EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária g - grama g kg-1 - grama por quilograma g L-1 - grama por litro g mL-1 - grama por mililitro IAN - Instituto Agronômico de Norte ICP-OES - Espectrômetro de emissão ótica com plasma acoplado indutivamente IDC - Impressão digital cromatográfica LACQUAMA - Laboratório de Controle de Qualidade e Meio Ambiente LD - Limite de detecção LQ - Limite de quantificação m - massa mm - milímetro mg - miligrama mL - mililitro mol L-1 - mol por litro mS cm-1 - milisiemens por centímetro μg L-1 - micrograma por litro μL - microlitro μm - micrômetro μM - micromol N - Normal NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato NMP - Número mais provável OMS - Organização Mundial de Saúde p - peso pH - potencial hidrogeniônico R - recuperação RDA - Recommended Dietary Allowances RDC - Resolução da Diretoria Colegiada RNA - Ácido Ribonucleico rpm - rotações por minuto T - temperatura Teste T - Teste de Tukey TP - Terra preta TPA - Terra preta arqueológica UFC - Unidade formadora de colônia UFC g-1 - unidade formadora de colônia por grama UL - Tolerable Upper Intake Level v - volume VB - Caldo verde brilhante RESUMO Os produtos fitoterápicos são livres e amplamente comercializados em todo o Brasil como um importante recurso terapêutico, porém reconhece-se um quadro de frequentes adulterações, contaminações e falsificações. Assim, torna-se importante o estabelecimento de protocolos padronizados de controle de qualidade de plantas e do solo de cultivo, levando-se em consideração a sua influência direta na disponibilidade de nutrientes essenciais e tóxicos quando em altas concentrações, para os vegetais. A Portulaca pilosa L., conhecida popularmente como amor crescido, é uma espécie encontrada em larga escala na região amazônica, sendo muito utilizada no tratamento de diversas enfermidades, na forma de chás, emplastos ou sumo. Baseado nestas informações, este trabalho teve como objetivo a padronização das partes aéreas e do solo de cultivo de Portulaca pilosa L., e a determinação da composição mineral biodisponível no solo e no chá medicinal, bem como a avaliação da atividade cicatrizante e anti- inflamatória e análise do perfil químico nos diferentes períodos de coleta. Os parâmetros físico-químicos analisados tanto para a espécie em estudo quanto para o solo de cultivo estiveram dentro dos limites permitidos para que se tenha uma amostra vegetal de qualidade e um solo cultivável. A composição mineral total do solo foi bastante elevada, entretanto os metais biodisponíveis estiveram em concentrações bem mais baixas. O chá das partes aéreas de Portulaca pilosa L. apresentou teores de minerais dentro dos limites permitidos, considerando-se o consumo máximo de duas xícaras de 200 mL por dia, tendo como referência o teor de alumínio, um metal tóxico, que atinge valores muito próximos dos preconizados pela Organização Mundial de Saúde (0,2 g kg-1). O extrato etanólico obtido na primeira coleta (período chuvoso) não apresentou atividade cicatrizante e anti-inflamatória, entretanto de acordo com o perfil químico observou-se que a quarta coleta (período seco) foi a única que apresentou um perfil diferente, sendo necessária a avaliação destas atividades para esta coleta posteriormente. Palavras-chave: Portulaca pilosa L.;controle de qualidade; metais; atividade. ABSTRACT Herbal products are free and widely sold throughout Brazil as an important therapeutic resource, but a framework of frequent adulteration, contamination and counterfeiting is recognized. Thus, it becomes important to establish standardized protocols for quality control of plants and soil cultivation, taking into account its direct influence on the availability of essential nutrients and toxic when high concentrations to plants. The Portulaca pilosa L., popularly known as “amor crescido”, is a species found in large scale in the Amazon region, commonly used in the treatment of various diseases in the form of teas, poultices or juice. Based on this information, this study aimed to standardize the aerial parts and soil cultivation Portulaca pilosa L., and the determination of bioavailable mineral composition of soil and herbal tea, as well as evaluating the healing and anti- inflammatory activity and analysis chemical profile of the different collection periods. Physicochemical parameters, both for the species under study, as for soil cultivation, were within the allowable limits in order to have a plant sample quality and an arable soil. The total mineral content of the soil was very high, however the bioavailable metals were in much lower concentrations. The tea from the aerial parts of Portulaca pilosa L. showed mineral content within permitted limits, considering the maximum consumption of two cups of 200 ml per day, with reference to the content of aluminum, a toxic metal, which reaches values very close those recommended by the World Health Organization (0.2 g kg-1). The ethanol extract obtained in the first sampling (rainy season) showed no healing and anti-inflammatory activity, however, according to the chemical profile, it was observed that the fourth harvest (dry season) was only presented a different profile, being necessary to evaluate these activities to this collection later. Palavras-chave: Portulaca pilosa L.; quality control; metals; activity. 20 1 - INTRODUÇÃO As plantas representam um alto valor para o ser humano, não somente por suas propriedades medicinais, como também pelo contingente de informações e esclarecimentosque vêm oferecendo às ciências, sendo no passado o principal meio terapêutico conhecido para tratamento de enfermidades. Entretanto, é necessário um conhecimento prévio de seus componentes químicos, pois a presença de substâncias nelas contidas podem produzir efeitos que desconhecemos principalmente se ingerida em longo tempo, podendo assumir natureza tóxica (BOTSARIS & MACHADO, 1999). É necessário, portanto, um engajamento dos pesquisadores brasileiros no sentido de investigar as plantas medicinais, não somente com o objetivo de isolar seus componentes químicos como também, interagir com farmacólogos, verificar suas propriedades tóxicas e comprovar seus efeitos medicinais, além de buscar outras atividades biológicas ainda não comprovadas cientificamente. A qualidade dos produtos à base de plantas medicinais, comercializados no Brasil, é cada vez mais preocupante. Pesquisas científicas têm apontado à presença de diversas irregularidades que comprometem a eficácia e põem em risco a saúde do consumidor. Uma das causas para esse panorama tem sido o fato das indústrias responsáveis pela fabricação desses produtos serem basicamente constituídas por empresas de pequeno porte que funcionam precariamente (ZUCCOLOTTO et al.,1999) Os parâmetros de controle de qualidade de drogas vegetais variam de espécie para espécie e podem ser encontrados nas monografias contidas nas farmacopéias. A padronização de um produto envolve várias etapas que vão desde a obtenção da matéria-prima, passando por todo o processo produtivo, culminando com a análise do produto final (BACCHI, 1996; FARIAS, 2001). Outro fator que se deve dar uma atenção especial é o hábito da automedicação pelas populações menos esclarecidas, que se dá através dos famosos chás, que são definidos pela ANVISA como sendo: “o produto constituído de uma ou mais partes de espécies vegetais inteiras, fragmentadas ou moídas, com ou sem fermentação, tostadas ou não, constantes de Regulamento técnico de 21 espécies Vegetais para o Preparo de Chás. O produto pode ser adicionado de aroma e ou especiaria para conferir aroma e ou sabor”. A presença de elementos traço nos diversos chás de ervas ocorre, geralmente, em conseqüência da contaminação do solo por fertilizantes ou pela água de esgotos poluídos pela ação industrial ou de mineração, pelo ar atmosférico contaminado, pela emissão de resíduos das grandes indústrias poluidoras ou durante a etapa de processamento dos chás, quando as espécies vegetais ficam em contato com os utensílios industriais (HAN et al., 2005; SOMERS, 1974). Um vegetal é um ser vivo e está sujeito às influências do ambiente que podem afetar de diferentes formas seu metabolismo. É indiscutível a importância do solo transferindo água, sais minerais, nutrientes e, sob determinadas condições, elementos não benéficos como metais pesados (FREIRE, 2005). Por este motivo, faz-se necessário determinar as características físicas, físico- químicas e minerais dos solos, para se garantir um cultivo favorável. A etnobotânica aplicada ao estudo de plantas medicinais trabalha em estreita cumplicidade com a etnofarmacologia, que consiste na exploração científica interdisciplinar de agentes biologicamente ativos, tradicionalmente empregados ou observados por determinado agrupamento humano. A etnobotânica é citada na literatura como sendo um dos caminhos alternativos que mais evoluiu nos últimos anos para a descoberta de produtos naturais bioativos (NUNES et al., 2003). As plantas apresentam diversas vias metabólicas secundárias que levam à formação de compostos, cuja distribuição é restrita a algumas famílias, gêneros ou mesmo espécies. O conjunto de compostos secundários nas plantas é resultado do balanço entre a formação e eliminação desses compostos durante o crescimento da planta, sendo que esse equilíbrio é influenciado por fatores genéticos (que são fixos) e ambientais como luz, temperatura, tipo de solo, água, além de outros, que são variáveis (GOBBO-NETO & LÓPES, 2007). Esses compostos possuem importantes funções nos vegetais, já que são constituídos de substâncias que agem na preservação da integridade das plantas. 22 Por outro lado, essas substâncias, ao serem incorporadas ao organismo animal, produzem variados efeitos e, quando benéficos, caracterizam as plantas que os possuem. Muitos desses compostos ou grupos deles podem provocar reações nos organismos, esses são os princípios ativos. Algumas dessas substâncias podem ou não ser tóxicas, isto depende muito da dosagem em que venham a ser utilizadas. Assim, planta medicinal é aquela que contém um ou mais de um princípio ativo que lhe confere atividade terapêutica (LORENZI & MATOS, 2002). Neste trabalho, foi selecionada a espécie medicinal Portulaca pilosa L., conhecida popularmente como “amor crescido”, cultivada em uma horta localizada em Ananindeua (município, localizado em Belém-PA). Este local foi escolhido, devido ser um dos grandes fornecedores da espécie medicinal para diversas farmácias de manipulação da região metropolitana de Belém, comunidade local e para a Farmácia Escola da Universidade Federal do Pará, a qual dispensa medicamentos para a Farmácia Universitária - UFPA. A espécie em estudo constitui uma planta medicinal encontrada em abundância na região amazônica, sendo seu uso empírico difundido entre seus habitantes, utilizado, principalmente, nas formas de chás, emplastos ou sumo. O macerado das folhas em água é usado externamente contra qualquer tipo de ferida (DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002). Possui em sua composição algumas substâncias medicinais cientificamente comprovadas, como por exemplo “diterpenos” e algumas vitaminas como A, B1, B2 e C, entretanto a literatura a seu respeito ainda é bastante pobre, necessitando de estudos maiores e bem planejados, que justifique sua utilização popular (ALBUQUERQUE, 1989; OHSAKI et al., 1999). O controle de qualidade de plantas medicinais é de extrema importância para o consumo seguro de matérias-primas vegetais que apresentam potencial terapêutico. Esta necessidade despertou o interesse em se padronizar a espécie Portulaca pilosa L., já que não apresenta nenhum estudo na literatura. A partir destas considerações, este trabalho teve como objetivo a padronização das partes aéreas e do solo de cultivo de Portulaca pilosa L., avaliação da composição mineral do solo, e chá medicinal, investigação de 23 atividades biológicas de importância para a medicina popular e análise comparativa do perfil químico do extrato etanólico nas diferentes coletas realizadas. Em todos os parâmetros determinados, foi avaliada a influência da sazonalidade. 24 2 - OBJETIVOS Geral Este trabalho tem como objetivo realizar a padronização das partes aéreas e do solo de cultivo de Portulaca pilosa L., ensaios de atividade biológica, bem como o perfil químico e a composição mineral do solo de cultivo e do chá medicinal em períodos sazonais distintos. Específicos: - Analisar os parâmetros físicos, físico-químicos e microbiológicos das partes aéreas da espécie Portulaca pilosa L. em períodos sazonais distintos; - Determinar o melhor período de cultivo da espécie P. pilosa a partir da análise dos parâmetros físicos e físico-químicos do seu solo de cultivo; - Analisar os metais totais e biodisponíveis presentes no solo de cultivo, por Espectrometria de Emissão Atômica por PIasma Acoplado Indutivamente ICP-OES; - Analisar os metais presentes no pó vegetal e no chá medicinal de P. pilosa por (ICP-OES); - Ensaio de atividade biológica no extrato etanólico de Portulaca pilosa L. - Verificar o perfil químico nas quatro coletas através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC); - Analisar os dadosobtidos nos diferentes períodos sazonais através de matrizes de correlação e Teste T. 25 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. A importância das plantas medicinais e o uso de chás caseiros Pode-se considerar como planta medicinal aquela planta administrada sob qualquer forma e por alguma via ao homem, exercendo algum tipo de ação farmacológica. As plantas podem ser classificadas de acordo com sua ordem de importância, iniciando-se pelas plantas empregadas diretamente na terapêutica, seguidas daquelas que constituem matéria-prima para manipulação e, por último, as empregadas na indústria para obtenção de princípios ativos ou como precursores em semi-síntese. As plantas medicinais têm sido utilizadas tradicionalmente para o tratamento de várias enfermidades. Sua aplicação é vasta e abrange desde o combate ao câncer até os microorganismos patogênicos (SILVA & CARVALHO, 2004; CALIXTO, 2000). A utilização das plantas medicinais como fonte de medicamentos no tratamento de enfermidades que acometem a espécie humana remonta a idade antiga, sendo que representaram, por muito tempo, a única fonte de agentes terapêuticos para o homem (CALIXTO, 2000; HARVEY, 2000). As informações sobre o uso de plantas medicinais e suas virtudes terapêuticas foram sendo acumuladas durante séculos e muito desse conhecimento empírico encontra-se disponível atualmente (DI STASI, 1996). No início do século XIX, com o desenvolvimento da química farmacêutica, as plantas constituíram a primeira fonte de substâncias no desenvolvimento de medicamentos (VIEGAS et al., 2006). Estima-se que aproximadamente 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica moderna foram desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de produtos naturais, sendo que 25% destas são oriundos de plantas (CALIXTO, 2000). No entanto, durante os últimos 20 anos, os fármacos de origem natural que apareceram no mercado são quase que na totalidade, oriundos das pesquisas científicas de países como China, Coréia e Japão, sendo que a contribuição dos outros países é bem menor (YUNES & CALIXTO, 2001). A produção de fármacos via síntese química, o crescimento do poder econômico das indústrias farmacêuticas e a ausência de comprovações científicas 26 de eficácia das substâncias de origem vegetal aliada às dificuldades de controle químico, físico-químico, farmacológico e toxicológico dos extratos vegetais até então utilizados, impulsionaram a substituição destes por fármacos sintéticos (RATES, 2001). Após a década de 1960, observou-se, então, um desinteresse das indústrias farmacêuticas e dos institutos de pesquisa pela busca de novas substâncias de origem vegetal, por se acreditar que já haviam sido isoladas as principais substâncias ativas das drogas vegetais conhecidas, bem como já haviam sido realizadas todas as possíveis modificações químicas de interesse destas substâncias (SCHENKEL et al., 2000). Outro fator foi devido o estudo com plantas na descoberta de novas drogas ser complexo, sendo atualmente necessários de sete a dez anos para o desenvolvimento completo. O volume de recursos envolvidos nesses estudos explica a concentração da pesquisa e desenvolvimento destes novos fármacos nos países ditos do primeiro mundo, detentores de tecnologia e recursos (MONTARI, 1995). A partir dos anos 80, os avanços técnicos e o desenvolvimento de novos métodos de isolamento de substâncias ativas a partir de fontes naturais, permitiram maior rapidez na identificação de substâncias em amostras complexas, como os extratos vegetais, ressurgindo o interesse pela pesquisa destas substâncias, como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos a partir de plantas medicinais que, segundo CARVALHO et al. (2004), são as plantas selecionadas e utilizadas popularmente como remédio no tratamento de doenças, e que é definido pela OMS (1978) como sendo toda e qualquer planta que, aplicada sob determinada forma e por alguma via ao ser humano, é capaz de provocar um efeito farmacológico. Grande parte das plantas nativas brasileiras ainda não tem estudos para permitir a elaboração de monografias completas e modernas. Muitas espécies são usadas empiricamente, sem respaldo cientifico quanto à eficácia e segurança, o que demonstra que em um país como o Brasil, com enorme biodiversidade, existe uma enorme lacuna entre a oferta de plantas e as poucas pesquisas. Desta forma, considera-se este um fator de grande incentivo ao estudo com plantas, visando 27 sua utilização como fonte de recursos terapêuticos, pois o reino vegetal representa, em virtude da pouca quantidade de espécies estudadas, um vasto celeiro de moléculas a serem descobertas (FOGLIO et al., 2006). Várias empresas nacionais têm empregado matéria-prima vegetal diretamente na elaboração de fitomedicamentos. No Brasil, 20% da população são responsáveis por 63% do consumo dos medicamentos disponíveis; o restante encontra nos produtos de origem natural, especialmente as plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos. Essa alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos (HOSTETTMANN et al., 2003). Hoje em dia existem várias metodologias para a obtenção de fármacos, dentre elas a abordagem biotecnológica e as correspondentes técnicas genéticas, que possibilitaram identificar e preparar diversas proteínas; a química combinatória, que permitiu o desenvolvimento de técnicas de triagem em larga escala como o HTS (High-troughput screening) que permitem que até 100 mil compostos sejam testados num único dia em relação a sua atividade biológica e a química computacional que correlaciona a estrutura molecular com a atividade biológica (YUNES & CALIXTO, 2001). A pesquisa fitoquímica tem por objetivo conhecer os constituintes químicos de espécies vegetais ou avaliar sua presença. Quando não se dispõe de estudos químicos sobre as espécies de interesse, a análise fitoquímica preliminar pode indicar o grupo de metabólitos secundários relevantes da mesma. Caso o interesse esteja restrito a uma classe específica de constituintes ou às substâncias com atividade biológica, a investigação deverá ser direcionada para o isolamento e a elucidação estrutural da mesma (SIMÕES et al., 1999). Dentro deste aspecto, cabe ressaltar a necessidade de uma atuação multidisciplinar que o estudo com as plantas exige, incluindo desde o ponto de vista fitoquímico, até estudos abordando os aspectos agrotecnológico, microbiológico, farmacológico e biotecnológico, de tal forma que esta integração possa propiciar uma ampliação nas possibilidades na busca de novas moléculas ativas. Apesar de contar com uma enorme biodiversidade, o Brasil dispõe de uma 28 infra-estrutura que deve ser melhorada para adequar a produção e a extração racional das espécies. Para o fitoquímico, todas estas especialidades têm papel importante na pesquisa com plantas medicinais. Qualquer profissional ou instituição que deseja trabalhar com plantas medicinais esbarra na dificuldade em produzi-las ou adquiri-las com confiabilidade na identificação botânica ou mesmo em obter informações sobre em quais condições à espécie foi cultivada. A área agrotecnológica, por sua vez, pode auxiliar o pesquisador através das técnicas de micropropagação vegetativa, cultivo em larga escala e estudos de aclimatação, visando a disseminação da espécie e sua sustentabilidade e aliando a produção com a otimização do teor do(s) princípio(s) ativo(s), possibilitando a adequação da espécie às condições climáticas locais (FOGLIO et al., 2006). As plantas não são unicamente uma fonte potencial de princípios ativos quimicamente definidos. O uso de extratos é também possível e, para isto, a atividade farmacológica deve estar definida, assim como os compostos responsáveis por esta atividade (HOSTETTMANNet al., 2003). Do ponto de vista farmacológico é imprescindível a avaliação da atividade em diversos modelos como o antiulcerogênico, antiinflamatório, anticâncer em cultura de células tumorais humanas e em modelos experimentais utilizando animais de laboratório, anticolvulsivante, analgésico e outros, bem como avaliação toxicológica (citotoxicidade, toxicidade aguda, toxicidade em doses repetidas (toxicidade crônica), irritação dérmica primária e cumulativa, irritação ocular, sensibilidade cutânea e fototoxicidade) (FOGLIO et al., 2006). O reino vegetal representa, em virtude da pouca quantidade de espécies estudadas, um vasto celeiro de moléculas a serem descobertas. Além disto, pela necessidade da pesquisa multidisciplinar, deveriam ser criados mais centros de pesquisa especializados, com incentivos e subsídios fiscais governamentais, como um caminho a ser priorizado para agregar valores ao panorama brasileiro na pesquisa com plantas medicinais, pois se tornam imprescindíveis, cada vez mais, o apoio e o suporte à realização de projetos de pesquisa tecnológica e industrial de forma integrada, procurando atender à demanda do setor produtivo e de órgãos 29 governamentais, um incentivo institucional de interface com o setor produtivo e com a sociedade (FOGLIO et al., 2006). Apesar da popularização sofrida pela medicina ocidental (alopática), diversas comunidades ainda continuam crendo e utilizando as plantas medicinais como um aliado contra as eventuais enfermidades, muitas vezes tal fato ocorre, devido aos altos custos dos medicamentos alopáticos ou talvez movido pelo medo de que os mesmos possam apresentar efeitos colaterais bem mais sérios (COSTA et al., 1998; YUNES et al., 2001). Nesse contexto destaca-se o hábito da automedicação, prática bastante difundida entre as populações menos esclarecidas que de forma indiscriminada e aleatória tornam-se os principais consumidores dos famosos chás, fazendo disto o principal fator de risco para o uso de plantas potencialmente medicinais (GRÜN et al, 1993). Os vegetais, não são fábricas de remédios prontos para curar cada doença da humanidade, como muitos acreditam, e sim complexos conjuntos de inúmeras substâncias, muitas vezes desconhecidas e tóxicas (EHRLICH, 1993; BRAZ FILHO, 1994; GOTTLIEB & KAPLAN, 1996, GOTTLIEB et al, 1996). Entre os eventuais riscos decorrentes da automedicação, podemos citar a utilização equivocada de uma espécie no lugar de outra, o manejo inadequado no plantio com o descuido no armazenamento e transporte. Desse modo, ao tomar um chá que deveria trazer benefícios estaríamos tomando um veneno. Isto sem considerar que todo esse processo afeta o equilíbrio químico do vegetal. Uma planta não é um medicamento e sim uma possível fonte para se obtê-lo, portanto, o plantio de espécies vegetais com objetivos medicinais deve ser extremamente criterioso (FREIRE, 2005). No Brasil, as feiras livres e os mercados surgiram em 1841, como uma solução para o abastecimento regional de produtos, substituindo as bancas de pescados (GORBERG & FRIDMAN, 2003). Nestas feiras e mercados instituídos pelo governo, eram vendidos apenas certos artigos, em lugares específicos e com taxas estabelecidas pelo poder municipal. Os primeiros decretos já manifestavam preocupações com: a higiene dos feirantes; o respeito ao público; informações 30 sobre os preços dos produtos e ainda com a formação ética profissional (SAREM/SEPLAN-RR, 1982). Esta comercialização de plantas vem sendo estimulada nas últimas décadas, pela necessidade de uma crescente população que busca maior diversidade e quantidade de plantas para serem utilizadas no cuidado da saúde (GORBERG & FRIDMAN, 2003). No Brasil há crescente interesse e busca pela medicina tradicional e pela Fitoterapia (ALMEIDA, 2003), que ocorre devido a vigente carência de recursos dos órgãos públicos de saúde e incessantes aumentos de preços nos medicamentos alopáticos, outro fator que contribui para tal crescimento, são os efeitos colaterais apresentados por alguns destes medicamentos (PARENTE & ROSA, 2001). As informações sobre o uso e as virtudes terapêuticas das plantas medicinais foram sendo acumuladas através dos séculos e a utilização de suas propriedades representa uma forma de tratamento e cura das doenças. Apesar do uso de plantas medicinais ter sua propagação associada ao conhecimento popular empírico, gradativamente vem sendo reconhecido e incorporado ao saber científico (DANTAS & GUIMARÃES, 2007). A legislação brasileira, segundo a ANVISA, define chá, como sendo: “o produto constituído de uma ou mais partes de espécies vegetais inteiras, fragmentadas ou moídas, com ou sem fermentação, tostadas ou não, constantes de Regulamento Técnico de Espécies Vegetais para o Preparo de Chás. O produto pode ser adicionado de aroma e ou especiaria para conferir aroma e ou sabor” (BRASIL, 2005). A ANVISA estabeleceu, também, as características sensoriais, físico- químicas, microscópicas e microbiológicas, assim como os aditivos intencionais, contaminantes, ingredientes e coadjuvantes de tecnologia permitidos, e ainda a higiene, o acondicionamento, pesos e medidas além da rotulagem indicada para os chás (BRASIL, 1998). Segundo Rohmer (1986), o chá chegou ao Brasil trazido por imigrantes chineses para os Estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais. A cultura 31 brasileira popularizou outras plantas, chamadas de chá de ervas, como chás caseiros. No interior do País, quase todos os habitantes têm uma horta com plantas consagradas pela cultura popular, como medicinais; a camomila para cólica de bebê, hortelã, capim limão ou capim cidreira como calmantes, entre outras (ROHMER, 1986). A Resolução da Diretoria Colegiada da ANVISA (RDC) n° 10, de 2010, que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais- plantas medicinais ou suas partes, que contenham as substâncias ou classes de substâncias, responsáveis pela ação terapêutica, após processos de coleta ou colheita, estabilização, secagem, podendo ser íntegra, rasurada ou triturada traz regras específicas para a comercialização das mesmas. O fabricante deve garantir a integridade de seu produto, a começar pela embalagem, a qual necessita proteger a droga vegetal de qualquer contaminação e efeitos da luz e umidade. Deve apresentar também, o lacre de segurança, que garante um produto inviolado e na embalagem todas as informações necessárias para o consumidor, a fim de se evitar enganos. Inclui-se nestas informações o nome comercial e nomenclatura botânica, nome do responsável pelo produto, fabricante, lote, data de fabricação, prazo de validade, entre outros. Os princípios ativos que constituem o chá podem se transformar em substâncias prejudiciais à saúde, por meio de reações químicas, após 24 horas do preparo. Desta forma é indicado que seu consumo seja feito em no máximo 24 horas (REIA, 2009). 3.2. Controle de qualidade de Plantas Medicinais O mercado de produtos cosméticos e farmacêuticos com componentes de origem vegetal ou mineral tem crescido muito nos últimos anos. De acordo com Farnsworth (1997), a correlação entre o uso de uma planta na medicina tradicional e a presença de princípios farmacologicamente ativos com alguma ação 32 terapêutica é altamente positiva. Estima-se que 74% dos medicamentos convencionais da atualidade tenham sido descobertos com base no seu uso tradicional. Por este motivo, a procura de compostos bioativos em produtos naturais tem causado grande repercussão internacional (O’ NEILL & LEWIS, 1993). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 70% da população dos países em desenvolvimento utilizam produtos de origem natural. No entanto, a retomada da fitoterapia como recurso terapêutico não vem sendo acompanhada pelo desenvolvimento de métodos de controle para verificaçãode sua qualidade, segurança e eficácia. Desse modo, o uso inadequado de plantas medicinais tem sido responsável por cerca de 7% dos casos de intoxicação (OLIVEIRA et al., 1991). Existe uma grande variação no teor de princípios ativos de espécies vegetais diferentes conhecidas com um mesmo nome e também a presença de contaminantes capazes de alterar as propriedades medicinais da planta (SHARAPIN, 1996). Muitas plantas vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos, sendo que a grande maioria não possui dados científicos que comprovem a sua eficácia e seu espectro toxicológico no homem, assim como a garantia de qualidade do produto ou de sua produção. Apesar de três ou quatro décadas de estudos, pode-se dizer que até esta data não houve um processo coordenado de todos os atores do processo (indústria, farmacólogos, fitoquímicos, químicos de síntese, toxicólogos, investigadores clínicos, etc.) visando o desenvolvimento de drogas a partir de plantas (FARIAS, 2001). O aumento no número de medicamentos disponíveis à população não é proporcional à qualidade dos mesmos. Os parâmetros de controle de qualidade variam de espécie para espécie e podem ser encontrados nas monografias contidas nas Farmacopéias (FARIAS, 2001). O que dificulta o trabalho é a ausência de padrões para muitas plantas e de monografias farmacopeicas (NASCIMENTO et. al., 2005). O controle de qualidade de um produto envolve várias etapas que vão desde a obtenção da matéria-prima, passando por todo o processo de produção, 33 culminando com a análise do produto final (BACCHI, 1996; FARIAS, 2001). Segundo Farias (2001), a qualidade da matéria-prima não garante a eficácia do produto, mas é fator determinante da mesma. No controle de qualidade devem-se considerar aspectos botânicos, químicos, farmacológicos e de pureza (BRASIL, 2000). A má qualidade de produtos a base de plantas medicinais no Brasil, representada principalmente pelas frequentes adulterações, contaminações e falsificações, é um fato conhecido, mesmo após regulamentação dos procedimentos para o registro desses produtos desde 1995, e mais recentemente pela resolução RDC n° 48, de 16 de março de 2004 (ARAÚJO & OHARA, 2000). A atividade de farmacovigilância no país é praticamente inexistente para estes produtos, reforçando a necessidade urgente de um controle mais rigoroso que vise assegurar a qualidade, a segurança e a eficácia desses produtos (SANTOS et. al., 1995; ZAUPA et. al., 2000). Vale ressaltar que o amplo uso de fitoterápicos na atualidade ainda está bastante relacionado com as tradições e com o fato de ser uma alternativa terapêutica de menor custo para a população. Porém, sem a qualidade adequada, tais produtos podem não promover a ação desejada e, ainda, atuar como agente lesivo (KNEIFEL et al., 2002). Para garantir a qualidade no desenvolvimento de um produto é necessário o monitoramento da constituição química para que se possa garantir a ação farmacológica, durante todo o processamento. Para tanto, frequentemente se utiliza a substância ou o grupo de substâncias responsáveis pela atividade farmacológica. Podem ainda ser utilizadas substâncias referência, ou grupo delas, que sejam as mais típicas possíveis (majoritárias) para a droga vegetal, providas ou não de ação farmacológica e que sejam extraídas no extrato primário. Neste caso, a identidade da matéria-prima vegetal deve ser inequivocamente assegurada (MELO, 1989; PAULA, 1997). Várias técnicas experimentais e métodos cromatográficos são recomendados para determinar a impressão digital destes produtos. Neste perfil cromatográfico um número e/ou concentrações de constituintes quimicamente característicos não devem ser similares em diferentes amostras. Como resultado, 34 para obter uma impressão digital cromatográfica (IDC) quimicamente fidedigna não é um trabalho trivial. O desempenho de uma IDC é rigorosamente dependente do grau de separação cromatográfico e da distribuição de todos os componentes químicos da planta medicinal investigada (DE ALMEIDA, 2006). Dentre as técnicas de controle do processo extrativo encontram-se as técnicas cromatográficas, com as quais se torna possível realizar avaliações tanto qualitativas quanto quantitativas. A análise da composição da droga vegetal e de preparações extrativas derivadas pode ser direta, através de cromatografia líquida de alta eficiência ou cromatografia gasosa, ou indireta, com o emprego de cromatografia em camada delgada ou cromatografia em papel, seguidas de extração do componente e determinação por análise química quantitativa ou físico-química tais como térmicas, volumetria, espectrofotometria, fotocolorimetria ou densitometria (ARAGÃO et al., 2001; ARAGÃO et al., 2002). Além destas técnicas, faz-se necessário realizar um estudo farmacognóstico para o controle de qualidade da matéria-prima vegetal, visando estabelecer parâmetros de qualidade e padronização desta planta medicinal, atestando a sua pureza, autenticidade, melhor época de colheita, avaliação dos processos de secagem, determinação da umidade, teor de extrativos, teor de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido, teor de constituintes químicos, dentre outros estudos (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010; ALBERTON et al., 2001). Várias pesquisas vêm constatando que as plantas medicinais possuem alta carga microbiana, com microrganismos provenientes do solo, bem como da superfície dos vegetais ou até mesmo provenientes de más condições de manipulação e armazenamento (ZARONI et al., 2004). Os microrganismos são potencialmente perigosos, pois, podem contaminar os vegetais durante a pré- colheita e pós-colheita (ARAÚJO & OHARA, 2000; BRANDÃO, et al., 2004). No primeiro caso, destacam-se como principais focos de contaminação: o solo, os adubos não compostados de forma adequada, a água de irrigação contaminada, a água utilizada na aplicação de fungicidas e inseticidas, a poeira, os insetos, os animais domésticos e silvestres e a manipulação humana. As fontes de contaminação pós-colheita incluem manipulação humana, limpeza inadequada 35 ou insuficiente de equipamentos de colheita, embalagens de transporte contaminadas, animais, insetos, poeira, água contaminada usada para lavagem, veículos de transporte e contaminação de equipamentos utilizados nos processamentos pós-colheita, secagem e armazenamento, realizados de forma inadequada (BRACKETT, 1999; BEUCHAT, 2002; KALKASLIEF et al., 2009; SATOMI et al., 2005). Em relação às condições de comercialização, Dourado et al (2005) avaliaram as plantas medicinais comercializadas por “raizeiros” no município de Anápolis, localizado no estado de Goiás e constataram que cerca de 70% dos estabelecimentos examinados estavam próximos a fontes contaminantes, como poeira e fumaça de veículos, e em 30% dos estabelecimentos haviam indícios de deterioração dos produtos (mofos, alteração de cor), indicando que os mesmos não tinham recebido um tratamento adequado após a coleta ou foram armazenados de forma inadequada. A população microbiana presente nas plantas contaminadas é, predominantemente, formada por bactérias formadoras de esporos como Bacillus cereus e Clostridium perfringens, embora outros patógenos como Escherichia coli e Salmonella estejam muitas vezes presentes. Além disso, bolores causados por Fusarium spp., Aspergillus spp. e Penicillium spp também fazem parte dessa microbiota. Contagens elevadas de fungos constituem um risco, em virtude da possibilidade desses organismos causarem intoxicações por si só ou ainda de serem produtores de micotoxinas (ABOU-ARAB et al., 1999; ZARONI et al., 2004). Uma das razões para os altos níveis de contaminação que ultimamente vêm sendo relatado, é o fato de que muitos agricultores e produtores desconhecem os cuidados essenciais que devem ser tomados nas diversas etapas da produção e pós-colheitapara a obtenção de matérias-primas ou quando sabem, julgam irrelevantes. Tais produtores, na maioria dos casos, não contam com a orientação e acompanhamento de profissionais capacitados (ZARONI et al., 2004). Além disso, a falta de regulamentação do setor e o aumento da demanda pela fitoterapia afeta negativamente a qualidade das plantas medicinais que são oferecidas à população (AMARAL et al., 2002). 36 3.3. A espécie Portulaca pilosa L. 3.3.1. Aspectos botânicos de Portulaca pilosa L. Portulaca pilosa L. (Figura 1 - pág. 36) é uma espécie rasteira pertencente ao gênero Portulaca, família Portulacaceae, tem distribuição principalmente pantropical, em regiões tropicais e subtropicais da África, havendo também algumas espécies na Austrália, Europa e Ásia. As plantas constituintes desta família possuem hábito herbáceo e arbustivo na maioria das vezes suculentas e comumente apresentam mucilagem nas células paraquemáticas do caule e das folhas (METCALFE & CHALK 1985; COELHO & GIULIETTI, 2010). O gênero Portulaca inclui plantas herbáceas, carnosas, anuais ou perenes, com folhas alternas, inflorescência em cimeira, 2 sépalas, 4-5 pétalas livres, estames geralmente numerosos, ovário ínfero e fruto cápsula com deiscência longitudinal ou transversal (COELHO & GIULIETTI, 2010). Figura 1 - Portulaca pilosa L. Fonte: A autora. De acordo com Coelho & Giulietti (2010), a espécie Portulaca pilosa L. apresenta caule geralmente prostrado, ramos 5-15 cm de comprimento, verdes, muito ramificado, tricomas axilares com. 4 mm de comprimento, multisseriados, interaxilares, conspícuos, lanosos, esbranquiçados. Folhas com pecíolo 1,5-2 mm, 37 cilíndrico; limbo 12-24 x 1-2 mm, linear-lanceolado, subglobosos, nervura central não evidente; base atenuada; ápice agudo; margem inteira sem bordo esbranquiçado; glabras; persistentes; folhas involucrais 5-10 por inflorescência, 15-20 x 1-2 mm, linear-lanceolada; base arredondada; ápice agudo; margem inteira sem bordo esbranquiçado; glabras. Inflorescência com 3-7 flores, cada uma abrindo de uma vez. Flores sésseis com 0,4-0,8 cm de diâmetro; sépalas 5-7 mm de comprimento, glabra, dorso côncavo, ápices agudos; com 5 pétalas, purpúreas; lâmina obcordada com 4-8 mm, ápice emarginado; estames 15-20; filetes 2-3 mm de comprimento., anteras 0,8-1 mm de comprimento; estilete com 1,5-3 mm de comprimento, ramos estigmáticos com 4-5, 1,5-2,0 mm de comprimento. Pixídio 3-5 mm compr., pedicelado, pedicelo 0,5 mm, opérculo cônico 1-2 mm de altura, 10-15 sementes por fruto, negras, opacas, 0,5–0,7 mm. A espécie em estudo foi descrita por Linnaeus (1753), o qual diferenciou a espécie Portulaca pilosa L. da Portulaca oleraceae L, através da presença de tricomas axilares evidentes em Portulaca pilosa e não evidente em Portulaca oleracea (Figura 2 - pág. 38). A espécie é caracterizada por apresentar tricomas axilares conspícuos, interaxilares e folhas lineares. Apesar de alguns autores relacionarem a mesma com Portulaca elatior, as diferenças estão principalmente no hábito prostrado e flores purpúreas em Portulaca pilosa. As espécies do gênero Portulaca apresentam a seguinte posição taxonômica: Reino: Plantae Divisão: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Ordem: Caryophyllales Família: Portulacaceae Gênero: Portulaca Principais Espécies: Portulaca pilosa L.; Portulaca oleraceae L., Portulaca grandiflora H.; Portulaca hirsutissima C. 38 Figura 2: Portulaca oleracea L. 36. Hábito; 37. Folha; 38. Pixídio; Portulaca pilosa L. 39. Hábito; 40-41. Folhas; 42. Pixídio (COELHO & GIULIETTI, 2010). 39 3.3.2. Considerações gerais sobre a família Portulacaceae e a espécie Portulaca pilosa L. A família Portulacaceae abrange cerca de 30 gêneros e 500 espécies, que estão distribuídas na sua grande maioria no Oeste da América do Norte, América do Sul e África, tendo alguns poucos representantes na Europa e Ásia. Os gêneros mais representativos incluem: Portulaca contando com cerca de 100 espécies, Calandrinia com cerca de 150 espécies e Talinum com mais de 50 espécies (CAROLIN, 1993). Segundo Rohrbach (1872), na flora brasileira há a ocorrência de dez espécies distribuídas em dois gêneros: Talinum e Portulaca, sendo este último abrangendo oito espécies. O número de espécies pertencentes ao gênero Portulaca que são mencionados na literatura varia de acordo com diversos autores: desde 40 em Geesink (1969) a mais de 100 em Legrand (1958) ou 200 em Willis (1966). Recentes trabalhos afirmam haver por volta de 115 espécies, entre tais trabalhos destacam-se: Carolin (1993) e Eggli & Ford-Werntz (2002), porém, o trabalho mais abrangente feito acerca do gênero, foi realizado por Legrand (1962), onde este reconheceu 62 espécies presente no continente americano, onde 21 destas espécies localizavam-se no Brasil (COELHO & GIULIETTI, 2010). Há poucos estudos acerca da família Portulacaceae, principalmente sobre o gênero Portulaca, o fundamento taxonômico referente ao gênero no país ainda é o tratamento feito por Rohrbach (1872), onde este reconheceu oito espécies, após este estudo, outros levantamentos de cunho regional foram feitos, como exemplo: os trabalhos de Teixeira (1959) para a cidade do Rio de Janeiro; Mattos (1961) para o município de São Joaquim (RS); Lima & Lima (1968) para o estado de Pernambuco; Rodrigues & Furlan (2002) para o estado de São Paulo e Coelho & Giulietti (2006), para o estado da Bahia (COELHO & GIULIETTI, 2010). Entre as espécies mais conhecidas desta família, destacam-se Portulaca oleraceae, com propriedades medicinais, e Portulaca grandiflora, com emprego ornamental (LORENZI & MATOS, 2002). 40 A espécie Portulaca oleracea (beldroega) é considerada uma planta daninha com grande aplicação na olericultura, tida como a principal planta daninha nas regiões produtoras de alface dos Estados Unidos, fato ocorrido na última década, pode ser encontrada em todo território brasileiro, bem como, nas principais regiões agrícolas do mundo (HAAR & FENNIMORE, 2003). A espécie Portulaca grandiflora, possui alta eficácia contra hepatite B, além de possuir efeito antimutagênico sobre a mutação induzida por alfatoxin B1, além disso, há relatos que as partes áreas desta espécie contêm vários diterpenoides, entre estes, destacam-se: portulal, portulenol, entre outros (JAIN & BASHIR, 2010). Entre tantas espécies do gênero Portulaca pode-se citar também: Portulaca amilis, Portulaca elatior, Portulaca frieseana, Portulaca minensis, entre outras (COELHO & GIULIETTI, 2010). A Portulaca pilosa L., é comumente conhecida pelos amazônidas como amor- crescido, podendo também ser identificada como Beldroega, Caaponga, Perrexi e Alecrim-de-são-josé (STASI & LIMA, 2002), pertence à família Portulacaceae, apresentando um caule prostrado de forma cilíndrica, base atenuada, ápice agudo, glabros e suculentos, onde se originam folhas alternas, lanceoladas, pequenas, pilosas; flores amarelas, roxas ou avermelhadas dispostas em fascículos no ápice de cada um dos ramos (COELHO & GIULIETTI, 2010 ; STASI & LIMA, 2002). É popularmente utilizada para fins medicinais como diurético, antiinflamatório, cicatrizante, analgésico, abortivo, tratamento de traumatismo, bem como, para fins cosméticos. O decocto preparado a partir das partes áreas desta planta é largamente usado para combater erisipelas e febres. Quando suas folhas são maceradas em água, pode ser usada de forma externa no combate contra qualquer tipo de ferida (STASI & LIMA, 2002). Segundo Corrêa (1984), esta planta é considerada tônica, amarga, estomáquica, diurética, emoliente, vulnerária, cicatrizante externa, emenagoga e eficaz contra erisipela. 41 3.3.3. Composição química comprovada Foram isolados
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