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Fiel a sua missão de interiorizar o ensino superior no estado Ceará, a UECE, como uma instituição que participa do Sistema Universidade Aberta do Brasil, vem ampliando a oferta de cursos de graduação e pós-graduação na modalidade de educação a distância, e gerando experiências e possibili- dades inovadoras com uso das novas plataformas tecnológicas decorren- tes da popularização da internet, funcionamento do cinturão digital e massificação dos computadores pessoais. Comprometida com a formação de professores em todos os níveis e a qualificação dos servidores públicos para bem servir ao Estado, os cursos da UAB/UECE atendem aos padrões de qualidade estabelecidos pelos normativos legais do Governo Fede- ral e se articulam com as demandas de desenvolvi- mento das regiões do Ceará. Bi ot ec no lo gi a em D eb at e Ciências Biológicas Ciências Biológicas Álvaro Julio Pereira Biotecnologia em Debate U ni ve rs id ad e Es ta du al d o Ce ar á - U ni ve rs id ad e Ab er ta d o Br as il ComputaçãoQuímica Física Matemática PedagogiaArtes Plásticas Ciências Biológicas Geografia Educação Física História 9 12 3 Álvaro Julio Pereira Biotecnologia em Debate Ciências Biológicas ComputaçãoQuímica Física Matemática PedagogiaArtes Plásticas Ciências Biológicas Geografia Educação Física História 9 12 3 2ª edição Fortaleza - Ceará 2015 Copyright © 2015. Todos os direitos reservados desta edição à UAB/UECE. Nenhuma parte deste material poderá ser reproduzida, transmitida e gravada, por qualquer meio eletrônico, por fotocópia e outros, sem a prévia autori- zação, por escrito, dos autores. Presidenta da República Dilma Vana Rousseff Ministro da Educação Aloisio Mercadante Presidente da CAPES Carlos Afonso Nobre Diretor de Educação a Distância da CAPES Jean Marc Georges Mutzig Governador do Estado do Ceará Camilo Sobreira de Santana Reitor da Universidade Estadual do Ceará José Jackson Coelho Sampaio Vice-Reitor Hidelbrando dos Santos Soares Pró-Reitor de Pós-Graduação Jerffeson Teixeira de Souza Coordenador da SATE e UAB/UECE Francisco Fábio Castelo Branco Coordenadora Adjunta UAB/UECE Eloísa Maia Vidal Direção do CED/UECE José Albio Moreira de Sales Coordenação da Licenciatura em Ciências Biológicas Germana Costa Paixão Coordenação de Tutoria da Licenciatura em Ciências Biológicas Roselita Maria de Souza Mendes Editor da EdUECE Erasmo Miessa Ruiz Coordenadora Editorial Rocylânia Isidio de Oliveira Projeto Gráfico e Capa Roberto Santos Diagramador Francisco Oliveira Revisão Ortográfica Fernanda Ribeiro Conselho Editorial Antônio Luciano Pontes Eduardo Diatahy Bezerra de Menezes Emanuel Ângelo da Rocha Fragoso Francisco Horácio da Silva Frota Francisco Josênio Camelo Parente Gisafran Nazareno Mota Jucá José Ferreira Nunes Liduina Farias Almeida da Costa Lucili Grangeiro Cortez Luiz Cruz Lima Manfredo Ramos Marcelo Gurgel Carlos da Silva Marcony Silva Cunha Maria do Socorro Ferreira Osterne Maria Salete Bessa Jorge Silvia Maria Nóbrega-Therrien Conselho Consultivo Antônio Torres Montenegro (UFPE) Eliane P. Zamith Brito (FGV) Homero Santiago (USP) Ieda Maria Alves (USP) Manuel Domingos Neto (UFF) Maria do Socorro Silva Aragão (UFC) Maria Lírida Callou de Araújo e Mendonça (UNIFOR) Pierre Salama (Universidade de Paris VIII) Romeu Gomes (FIOCRUZ) Túlio Batista Franco (UFF) Editora Filiada à P436b Pereira, Álvaro Júlio. Biotecnologia em Debate / Álvaro Júlio Pereira. – 2. ed. – Fortaleza : EdUECE, 2015. 145 p. : il. (Ciências Biológicas) ISBN: 978-85-7826-343-0 1. Biotecnologia. I. Álvaro, Júlio Pereira. II. Título. CDD 620.8 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Sistema de Bibliotecas Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho Thelma Marylanda Silva de Melo – CRB-3 / 623 Bibliotecária Editora da Universidade Estadual do Ceará – EdUECE Av. Dr. Silas Munguba, 1700 – Campus do Itaperi – Reitoria – Fortaleza – Ceará CEP: 60714-903 – Fone: (85) 3101-9893 Internet: www.uece.br – E-mail: eduece@uece.br Secretaria de Apoio às Tecnologias Educacionais Fone: (85) 3101-9962 Sumário Apresentação .................................................................................................... 5 Capítulo 1 – Biotecnologia: histórico e desenvolvimento ........................ 7 1. Biotecnologia: presente e passado ................................................................. 9 2. Breve histórico da biotecnologia moderna .................................................... 11 3. O homem manipulando a natureza ...............................................................12 4. O homem manipulando o DNA ......................................................................13 Capítulo 2 – Organismos Geneticamente Modificados (OGMs): plantas e animais transgênicos ................................................................... 23 1. Os alimentos e os organismos geneticamente modificados (OGMs) ...............25 2. As plantas transgênicas ..................................................................................28 3. Técnicas de transformação gênica ...............................................................32 4. Aspectos de biossegurança e bioética ..........................................................34 5. Debatendo: vantagens e desvantagens dos transgênicos ..........................37 6. Os animais transgênicos ................................................................................38 Capítulo 3 – A Clonagem e a Terapia Gênica ............................................. 43 1. Reprodução e clonagem ................................................................................45 2. Terapia gênica ................................................................................................52 Capítulo 4 – DNA na identificação de pais e criminosos e na saúde .... 73 1. Identificação pelo DNA ..................................................................................75 2. Técnicas moleculares de identificação .........................................................78 3. Análise dos testes de DNA .............................................................................82 4. A biotecnologia e a saúde ..............................................................................85 Capítulo 5 – Biotecnologia e Meio Ambiente ..........................................107 1. Consumo ....................................................................................................... 110 2. Biodiversidade ............................................................................................... 112 3. Bioprocessos ................................................................................................121 4. Biodegradação ..............................................................................................123 5. Avaliação de riscos .......................................................................................124 6. Sustentabilidade ambiental ..........................................................................126 7. Metagenômica ..............................................................................................131 8. Bioplásticos ...................................................................................................132 9. Biocombustíveis ............................................................................................133 10. Tecnologia e meio ambiente no debate sobre os limites do crescimento ................................................................................................136 Sobre o autor .................................................................................................143 Apresentação A cada dia que passa novos e grandes avanços científicos e tecnológicos sur- gem com uso da biotecnologia, seja na agropecuária, na medicina, no meio ambiente e na indústria. Mas, como em qualquer campoda ciência, os produ- tos produzidos pela biotecnologia têm gerado muitas preocupações, dúvidas e debates, sobre a qual o governo, os pesquisadores e a população em geral apresentam opiniões muitas vezes divergentes. Um dos motivos pelos quais a biotecnologia tem fomentado discussões, debates acalorados e até mesmo resistências por parte de muitos, têm sido o seu envolvimento em assuntos polêmicos como os transgênicos ou Organis- mos Geneticamente Modificados (OGM), a clonagem de mamíferos, pesquisas com células-tronco e terapia gênica, dentre outros. Esta polêmica e debate já ultrapassaram os muros dos institutos e laboratórios de pesquisas das univer- sidades e empresas que estão desenvolvendo seus produtos, chegando até a sociedade que também, possui o direito de apropriar-se dos conhecimentos para que seja formado nesta, cidadãos com uma formação crítica. A falta de conhecimento científico e informações pelos formadores de opinião e da população em geral, podem provocar confusões sobre o que é ou não científico, gerar resistências aos novos produtos oriundos das novas tecnologias, assim como despertar opiniões e afirmações pouco consistentes em assuntos atuais como a liberação de soja, milho e feijão transgênico para o plantio e consumo, a clonagem animal e o uso de células-tronco e terapia gênica para fins terapêuticos. O ensino de biotecnologia deve contribuir na formação de cidadãos responsáveis, socialmente conscientes, pois os conhecimentos sobre essa ciência, não devem ficar confinados aos laboratórios e ou até mesmo às salas de aulas, mas devem ser disseminados para toda a sociedade. Portanto, ainda que de forma sucinta, este livro procura apresentar uma abordagem dos principais conceitos, aplicações e um pequeno deba- te ao final de cada capítulo dos aspectos éticos e perspectivas da biotec- nologia, a fim de que o leitor obtenha conhecimentos, diferentes modos de pensar, questionamentos, e consiga debater e agir que permitam o julga- mento de questões de forma consciente e científica em todos os assuntos referentes ao uso de tecnologias resultantes da manipulação do DNA. Os autores Capítulo 1 Biotecnologia: histórico e desenvolvimento Biotecnologia em Debate 9 Objetivos • Introduzir os alunos à evolução histórica da biotecnologia. • Propiciar aos alunos conhecimentos básicos sobre o surgimento da bio- tecnologia moderna. • Compreender os fundamentos da tecnologia do DNA recombinante. 1. Biotecnologia: presente e passado 1.1 Biotecnologia e nosso dia a dia Humm, que delícia! Bem cedinho em nosso café da manhã, quando sabo- reamos uma fatia de pão com um pedaço de queijo, ou tomamos um copo de iogurte, nem nos damos conta que por trás da fabricação do pão, do quei- jo e do iogurte estão escondidas técnicas fermentativas usadas desde muito tempo atrás. Da mesma maneira, os transgênicos estão há mais de 25 anos fazendo parte do nosso dia-a-dia, seja quando consumimos um hambúrguer que contenha soja geneticamente modificada ou ao comprarmos uma calça jeans produzida com algodão transgênico. Vitaminas, anticorpos e remédios para combate à AIDS, kits para diag- nósticos de doenças, hormônio do crescimento (hGH) contra o nanismo, va- cina contra a Hepatite B, insulina contra o diabetes, são todos exemplos de produtos desenvolvidos pela engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante. O meio ambiente também entra nesta lista, com as lavouras transgênicas que promete pro- porcionar um manejo mais simples e com menos aplicações de agrotóxicos, e menor utilização de máquinas agrícolas, diminuin- do a emissão de poluentes e o consumo de água. 1.2 Homem: biotecnologia e meio ambiente Nós seres humanos de uma maneira bem diferente dos outros seres vivos da Terra, que procuram obter apenas o suficiente para sua sobrevivência, usamos diferentes meios e formas que vão além das nossas necessidades e consumo para a nossa sobrevivência, acarretando desta maneira vários problemas no meio ambiente em que vivemos. Figura 1.1 – A Biotecnologia e sua relação com outras Ciências fonte: GOOGLE, 2011 PEREIRA, A. J.10 Enquanto os micro-organismos, os animais e até mesmo as plantas mo- dificam-se apenas para adaptarem-se às várias mudanças ambientais, nós seres humanos, através do uso de nosso raciocínio, com um planejamento intelectual elaborado e aquisição de vários instrumentos ou ferramentas na execução deste planejamento, mudamos de forma intencional o ambiente a nossa volta, provocando problemas ambientais dos mais variados. Os instrumentos usados por nós, juntamente com os processos que supor- tam às nossas maneiras de transformação do mundo, são chamados de tecno- logias. Assim, as biotecnologias, nada mais são do que tecnologias, em que uti- lizamos seres vivos ou partes deles, como instrumentos para obtermos produtos com valor para a medicina e agricultura, por exemplo. A biotecnologia se relaciona interdisciplinarmente com a biologia molecular, bioquímica, microbiologia, enge- nharia bioquímica, fisiologia, imunologia, genética, engenharia química, ciências da computação e tecnologia industrial dentre outras (Figura 1.1). 1.3 Biotecnologia das fermentações A fim de manter a nossa sobrevivência, há milhares de anos, nossos ancestrais vêm obtendo, mesmo de forma inconsciente, alimentos e bebidas, como o queijo, iogur- te, cerveja, vinho e vinagre, com uso de métodos fermentativos. Há mais ou menos dez mil anos, nossos antepassados da re- gião do Oriente Médio, perceberam que podiam selecionar espécies selvagens de micro-organismos, plantas e animais para facilitarem seus usos na produção de ali- mentos e produção de bebidas. Por exemplo, na produção do vinho eles utilizavam os conhecidos fermentos, que nada mais são do que um fungo conhecido como levedura, que permite a transformação de açúcares em álcool e a modificação do suco ou mosto em vi- nho. Este processo é realizado por várias reações químicas que acontecem em série, e ao final geram moléculas responsáveis pelo gosto e aromas dos vinhos tão apreciados por todos nós. 1.4 Microbiologia e fermentação Com o uso de um microscópio rudimentar, Antony van Leeuwenhoek, conseguiu observar pela primeira vez bactérias e protozoários, para ele “pequenos animais”. Também percebeu que os micro-organismos pode- riam estar envolvidos de alguma forma na fermentação. Mas, somente no A cerveja, produzida e consumida há uns 6.000 anos por sumérios e babilônicos é obtida usando o fungo Saccharomyces cerevisae. Os pães fabricados e consumidos mais recentemente na história utilizam também Saccharomyces cerevisae em métodos fermentativos. Em seu crescimento, a massa do pão ficava exposta à ação de leveduras, que, ao consumirem o açúcar do amido, liberavam gás carbônico. Em seguida, pedaços de massa fermentada eram preservados para acelerar o processo no dia seguinte. Figura 1.2 – O fungo unicelular, a levedura Saccharomyces cerevisae, usado desde a antiguidade na produ- ção de pães, vinhos e cervejas fonte: GOOGLE, 2011 Existem fungos chamados de verdadeiros. Os citridiomicetos, aquáticos, com flagelo para natação nos gametas, como o Rhizidium braziliensis; os zigomicetos, não adaptados a ambientes aquáticos e com gametas sem flagelo, como Rhizopus stolonifer; os ascomicetos, com esporos compostos por estruturas chamadas ‘ascos’, como Saccharomyces cerevisae (Figura 1.2) e os basidiomicetos com esporos, formados em estruturas denominados ‘basídios’, como Agaricus campestris. Biotecnologia em Debate 11 século XIX, Louis Pasteur mostrou capacidade fermentativa dos micro- -organismos, através da ação do levedo sobre os açúcares simples como a glicose e a frutose produzindo álcool com a ação de enzimas. A partir disto, no final do século XIX, houve o desenvolvimento de vários processos industriais, obtendo-se o álcool etílico e butílico, ácido acético e acetona, e desenvolvidas metodologias para a compostagem de lixosólido e trata- mento de água e esgoto. Figura 1.3 – Personagens do desenvolvimento da microbiologia. John Tyndall, Robert Koch e Alexander Flemming fonte: www.google.com 2. Breve histórico da biotecnologia moderna 2.1 Principais descobertas Para compreendermos como se desenvolveu e estabeleceu a biotecnologia moderna, podemos dizer que eles aconteceram em três fases. Na primeira etapa que compreendeu o período de 1867 do século XIX até 1967 do século XX houve a descoberta da molécula do DNA e sua síntese em laboratório, além da comercialização da penicilina. Na segunda etapa que se inicia em 1971 e termina em 1982, compreende as bases da clonagem de genes reali- zadas por Cohen e Boyer em 1971. Foi iniciada a produção de insulina huma- na pela tecnologia do DNA recombinante e clonado o hormônio de crescimen- to hGH (do inglês: Human Growth Hormony). Na terceira fase foi possível fazer a transferência de genes e expres- sões de genes para resistência aos antibióticos em plantas, transferência de gene entre duas plantas e transferência de genes de leveduras para plantas. Foram clonados o TNF, o fator da necrose tumoral, para o trata- mento de câncer e o Fator VIII para tratamento da hemofilia, aprovação do TPA para dissolver coágulos sanguíneos, obtido por DNA recombinante, bem como o desenvolvimento de variedade de milho com elevado teor do aminoácido triptofano. Em 1874, William Roberts observou que bactérias não cresciam na presença do fungo Penicillium, um fungo do bolor do pão. Em 1875, o médico inglês John Tyndall verificou que a presença do Penicillium inibia o crescimento bacteriano em caldo de carne. Em 1882, Robert Koch demonstrou que as bactérias eram causadoras de doenças. E por fim, em 1928, Alexander Fleming ao cultivar bactérias, algumas regiões da placa onde as bactérias cresciam não se multiplicavam, devido à presença do Penicillium que produzia o antibiótico penicilina, que matava as bactérias nessas regiões. Esta descoberta salvou e continua salvando milhares de pessoas de várias doenças, tais como a meningite, pneumonia e doenças sexualmente transmissíveis como gonorreia e sífilis (Figura 1.3). PEREIRA, A. J.12 2.2 De Mendel ao primeiro transgênico Usando plantas de ervilhas, de fácil ger- minação e cresci- mento foi em 1865, que o monge Gregor Mendel estabeleceu a base para a moder- na biotecnologia, ao demonstrar a que a transmissão, de ge- ração a geração, de certas características de uma planta seguia um padrão estatístico, indicando a presença de unidades de hereditariedade, hoje conhecidos como genes (Figura 1.4a). Mas a relação entre o ácido desoxirribonucleico (DNA) e os genes só foi estabelecida em 1953, quando Francis Crick e James Watson descobriram como o DNA direciona o desenvolvimento e o crescimento de todos os organis- mos vivos (Figura 1.4b). A união das observações de Watson e Crick junto com a difração de raios-X obtidas por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins promoveu o modelo da estrutura do DNA. A partir daí, iniciaram-se trabalhos para transferir genes, ou pedaços de DNA de um organismo para outro, o que se tornou pos- sível nos anos 80, com o aprimoramento da tecnologia do DNA recombinante que permite obter fragmentos de DNA específicos e inseri-los em locais deter- minados do genoma. Essa tecnologia levou à obtenção das primeiras plantas, animais e micro-organismos geneticamente modificados. Conseguiu-se alterar o genoma de um organismo com a inserção de pedaços de DNA exógenos, ou seja, de outro organismo, surgindo um novo ser denominado transgênico. 3. O homem manipulando a natureza 3.1 Domesticação de plantas Nós seres humanos dependemos dos produtos da natureza para obtermos os nutrientes e nos mantermos vivos. Por esta razão, os nossos antepassados nômades, comiam frutas silvestres, nozes, raízes e a carne dos animais que obtinham quando saiam para caçar. Estes coletores e caçadores consumiam apenas aquilo que era possível extrair da natureza, sem destruir ou modifi- car de forma significativa o meio ambiente quando as incertezas das secas (a) (b) Figura 1.4 – (a) Gregor Mendel fazendo cruzamentos com ervi- lhas estabeleceu as bases da hereditariedade; b) James Wat- son e Francis Crick descreveram o modelo da molécula do DNA fonte: GOOGLE, 2011 e cheias significavam a diferença entre a fome e a sobrevivência. Mas, com o início da agricultura há mais ou menos 12 mil anos, até mesmo nas mais rudimentares sociedades, as possibilidades de sobrevivência começaram a mudar de maneira fenomenal. Nossos ancestrais começaram a domesticar os animais e a cultivarem plantas, começaram a se fixar em suas terras e deram início à produção de alimentos, em pequenas quantidades, para suprir suas necessidades básicas. Esses pioneiros identificaram e selecionaram plantas, semeando e colhendo sementes de espécies selvagens para produzir colheitas mais abundantes e de melhor qualidade para a produção de alimentos. 3.2 Domesticação de animais Com o desenvolvimento de terras aráveis do Oriente Médio ou “Crescente Fértil”, uma área que vai da Palestina ao Irã ocidental, há mais ou menos oito mil anos atrás, surgiu uma dependência do homem pelos cereais silvestres disponíveis nas redondezas, além de um suprimento de animais adequado a domesticação. O animal ideal para a domesticação teria que ser dócil, com movimen- tos lentos, fácil de capturar, tolerante ao confinamento e que se reproduzisse em cativeiro sem problemas. Também ajudava se ele não fosse muito enjoado para comida e que tivesse o instinto de seguir um líder. Assim os criadores do Crescente Fértil, encontraram três animais com essas características: a ovelha, a cabra e a vaca. 4. O homem manipulando o DNA 4.1 A engenharia genética Entre nossos amigos e familiares podemos encontrar pessoas com diabetes que precisam obter insulina e aplicá-la em seus corpos para reduzir os níveis de glicose em sua circulação sanguínea. Antigamente, a insulina era extraída dos órgãos internos de animais, mas com o advento da tecnologia do DNA recombi- nante, esse hormônio pode ser produzido em grandes quantidades e usado de forma segura e eficaz através da tecnologia do DNA recombinante. Ao falarmos de engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante, é importante saber que o seu desenvolvimento só foi possível após o esclarecimen- to da estrutura do DNA, e com a compreensão do código genético em que cada códon corresponde a um só aminoácido, mesmo que diferentes códons possam especificar o mesmo aminoácido; e que os dois primeiros nucleotídeos sejam em geral, suficientes para especificar um aminoácido determinado; ou seja, códons com sequências semelhantes e que especificam os mesmos aminoácidos. Durante mais de 10 mil anos, após a última era glacial, o processo denominado domesticação, que compreende várias práticas receberam o nome de melhoramento genético clássico. O processo desenvolveu-se de uma forma independente nas regiões da Mesoamérica, do sul dos Andes, do Oriente Médio, da África, do Sudeste Asiático e da China. Essas práticas envolveram a seleção nos diversos estágios de crescimento, de mutações genéticas espontâneas que ocorriam no estado selvagem. Além disto, em todas as gerações dos organismos que estavam a sua disposição, deveria ser permitida a reprodução daqueles que apresentavam as características mais adequadas ao interesse humano, tais como: aumento na produtividade dos grãos e mudanças de cor, tamanho, gosto e textura dos frutos. Para melhorar as espécies selvagens animais e vegetais, utilizamos a variância genética já existente nesses organismos para aumentar seu número com características úteis para nós e descartar os organismos menos interessantes para nossos objetivos. Por fim, selecionam-se variedades homogêneas entre si e as diferentes uma das outras, já que cada uma é adaptada para uma função diferente. Duranteo processo de domesticação do cão, por exemplo, foram obtidas raças muito diferentes utilizadas para várias finalidades, tais como a caça, a guarda e o pastoreio de outros animais. Isto também ocorreu com os bovinos, com a cabra e com o cavalo. Biotecnologia em Debate 13 e cheias significavam a diferença entre a fome e a sobrevivência. Mas, com o início da agricultura há mais ou menos 12 mil anos, até mesmo nas mais rudimentares sociedades, as possibilidades de sobrevivência começaram a mudar de maneira fenomenal. Nossos ancestrais começaram a domesticar os animais e a cultivarem plantas, começaram a se fixar em suas terras e deram início à produção de alimentos, em pequenas quantidades, para suprir suas necessidades básicas. Esses pioneiros identificaram e selecionaram plantas, semeando e colhendo sementes de espécies selvagens para produzir colheitas mais abundantes e de melhor qualidade para a produção de alimentos. 3.2 Domesticação de animais Com o desenvolvimento de terras aráveis do Oriente Médio ou “Crescente Fértil”, uma área que vai da Palestina ao Irã ocidental, há mais ou menos oito mil anos atrás, surgiu uma dependência do homem pelos cereais silvestres disponíveis nas redondezas, além de um suprimento de animais adequado a domesticação. O animal ideal para a domesticação teria que ser dócil, com movimen- tos lentos, fácil de capturar, tolerante ao confinamento e que se reproduzisse em cativeiro sem problemas. Também ajudava se ele não fosse muito enjoado para comida e que tivesse o instinto de seguir um líder. Assim os criadores do Crescente Fértil, encontraram três animais com essas características: a ovelha, a cabra e a vaca. 4. O homem manipulando o DNA 4.1 A engenharia genética Entre nossos amigos e familiares podemos encontrar pessoas com diabetes que precisam obter insulina e aplicá-la em seus corpos para reduzir os níveis de glicose em sua circulação sanguínea. Antigamente, a insulina era extraída dos órgãos internos de animais, mas com o advento da tecnologia do DNA recombi- nante, esse hormônio pode ser produzido em grandes quantidades e usado de forma segura e eficaz através da tecnologia do DNA recombinante. Ao falarmos de engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante, é importante saber que o seu desenvolvimento só foi possível após o esclarecimen- to da estrutura do DNA, e com a compreensão do código genético em que cada códon corresponde a um só aminoácido, mesmo que diferentes códons possam especificar o mesmo aminoácido; e que os dois primeiros nucleotídeos sejam em geral, suficientes para especificar um aminoácido determinado; ou seja, códons com sequências semelhantes e que especificam os mesmos aminoácidos. Durante mais de 10 mil anos, após a última era glacial, o processo denominado domesticação, que compreende várias práticas receberam o nome de melhoramento genético clássico. O processo desenvolveu-se de uma forma independente nas regiões da Mesoamérica, do sul dos Andes, do Oriente Médio, da África, do Sudeste Asiático e da China. Essas práticas envolveram a seleção nos diversos estágios de crescimento, de mutações genéticas espontâneas que ocorriam no estado selvagem. Além disto, em todas as gerações dos organismos que estavam a sua disposição, deveria ser permitida a reprodução daqueles que apresentavam as características mais adequadas ao interesse humano, tais como: aumento na produtividade dos grãos e mudanças de cor, tamanho, gosto e textura dos frutos. Para melhorar as espécies selvagens animais e vegetais, utilizamos a variância genética já existente nesses organismos para aumentar seu número com características úteis para nós e descartar os organismos menos interessantes para nossos objetivos. Por fim, selecionam-se variedades homogêneas entre si e as diferentes uma das outras, já que cada uma é adaptada para uma função diferente. Durante o processo de domesticação do cão, por exemplo, foram obtidas raças muito diferentes utilizadas para várias finalidades, tais como a caça, a guarda e o pastoreio de outros animais. Isto também ocorreu com os bovinos, com a cabra e com o cavalo. PEREIRA, A. J.14 O código genético é praticamente universal, sendo o mesmo em quase todos os seres vivos e a alta capacidade de adaptação do código genético a alte- rações ambientais, permitem que um ser vivo realize a leitura do códon conforme lhe seja conveniente. Importante também é saber que as mutações podem ocor- rer em um gene codificador de uma proteína essencial ao ser vivo e que se este gene mutado estiver presente numa única cópia no genoma, ele poderá ser letal. As técnicas envolvidas na tecnologia de DNA recombinante começa- ram a serem definidas no início do ano de 1970, com a utilização de vetores de clonagem, em geral, os plasmídeos e genomas virais, e uso das chamadas enzimas de restrição que permitem cortar o DNA em pontos específicos, iso- lando-se pedaços de ácido nucleico que podem ser introduzidos no genoma de outro organismo com moléculas idênticas de DNA. É a chamada clonagem molecular, em que, se corta a molécula do ácido nucleico de uma célula de interesse e, numa fase posterior, se insere o fragmen- to do DNA no ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Quando esta se divide, ela duplica a molécula do fragmento de DNA inserido. A primeira experiência de clonagem de DNA ocorreu em 1972 por um grupo de pesquisa- dores chefiados por Paul Berg, que recebeu o prêmio Nobel em 1980. A partir de então, o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinan- te cresceu de forma exponencial. Com o aparecimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) em 1987, tornou-se possível amplificar determinado gene a partir de pequenas quantidades de DNA. 4.2 Técnicas da Engenharia Genética a) PCR: Reação em Cadeia da Polimerase O princípio da PCR baseia-se nas propriedades de desnaturação e renatura- ção da molécula de DNA quando submetida a elevadas temperaturas. Assim, em temperaturas próximas dos 95ºC, as duas cadeias de DNA separam-se, voltando depois a ligar-se após o abaixamento da temperatura. A ideia chave na amplificação do DNA em tubo de ensaio é a adição de pequenas sequên- cias chamadas iniciadores ou primers, que margeiam a região que se pre- tende estudar e, de uma DNA polimerase termoestável, capaz de resistir às elevadas temperaturas alcançadas a Taq, foi encontrada num organismo que vive em fontes termais (Thermus aquaticus). Uma reação de PCR é constituída por três passos, que se repetem cicli- camente durante algumas horas (Figura 1.5). O primeiro passo corresponde à desnaturação do DNA conseguida a uma elevada temperatura, o segundo passo à ligação dos primers às cadeias de DNA simples, e o terceiro passo à extensão, ou seja, à incorporação dos diferentes nucleotídeos (A, T, G e C) presentes no Biotecnologia em Debate 15 tubo de ensaio pela ação da Taq, reproduzindo-se, assim, a porção da sequência de DNA que se situa entre os dois primers. Estes três passos são depois repeti- dos um determinado número de vezes (tipicamente 30 a 35 vezes), resultando em cada ciclo na duplicação da quantidade de DNA da sequência pretendida. Desta forma, o número de cópias dessa sequência é tão elevado no final da reação de PCR que pode considerar-se o conteúdo do tubo como uma solução purificada da porção pretendida do DNA do organismo em estudo. Figura 1.5 – PCR (Reação em cadeia da polimerase): (a) molécula de DNA. (b) duas cadeias de DNA com os respectivos primers; (c) desnaturação e renaturação da mo- lécula de DNA em função de temperatura e tempo; (d) moléculas de DNA amplifica- das depois de vários ciclos. Fonte: www.google.com. b) As enzimas de restrição e ligases A participação das enzimas ou endonucleases de restrição é essencial para a técnica do DNA recombinante. Cada enzima possui um padrão específico de corte da molécula de DNA, resultando vários fragmentos genômicos que podem ser isolados,clonados e sequenciados. Tão importantes quanto às en- zimas de restrição são as ligases, enzimas que possuem a capacidade de ligar, covalentemente, as extremidades livres dos fragmentos de DNA, o que pode ocorrer tanto in vivo como in vitro. Realmente estas enzimas não fazem mais do que catalisar a formação de uma ligação fosfodiester entre o terminal hidroxila 3’ e o terminal fosfato 5’ de dois nucleotídeos adjacentes, restabelecendo a continuidade estrutural do DNA. A reação de ligação do DNA in vitro reduz a susceptibilidade do ácido nucléico à degradação nucleolítica intracelular, preserva os terminais coesivos gerados pelas enzimas de restrição e permite obterem-se moléculas de DNA recombinates circulares ou lineares. Existem vários vetores de clonagem. Os plasmídeos são moléculas de DNA extra-cromossômico, encontrados em bactérias e algumas leveduras com capacidade de duplicar de forma autônoma. Possuem geralmente genes que lhes conferem resistência a antibióticos, como a ampicilina e a tetraciclina. São estes genes que permitem fazer distinção entre células hospedeiras com DNA recombinante das células que não o possuem. Outros vetores de clonagem são os bacteriófagos, que enxertados com DNA recombinante, podem ser introduzidos por infecção na célula hospedeira. Existem também cosmídeos que são vetores mistos, com um gene que confere resistência a antibióticos. PEREIRA, A. J.16 4.3 Construindo uma molécula de DNA recombinante Como já referimos, a manipulação genética compreende quatro fases: escolha do fragmento de DNA a ser utilizado, corte deste fragmento, sua transferência e inserção no genoma de determinada célula e, finalmente, seleção das células que possuem as moléculas do clone desejado. Esta última fase é a que oferece maior dificuldade, por ser muito demorada, dependendo da utilização dos cha- mados bancos de DNA. Um banco de DNA possui todas as moléculas de DNA geradas pela inserção do ácido nucleico da fonte de interesse num determinado vetor, o que significa poderem existir vários tipos de bancos, conforme a nature- za da inserção e o tipo de vetor utilizado. Assim, o tipo de banco a ser preparado vai depender do tipo de pesqui- sa em curso. Os elementos que formam os bancos genômicos são clones de DNA do genoma de determinado ser vivo, clones estes, obtidos com ve- tores, como por exemplo, bacteriófagos, que aceitam inserções de grandes tamanhos. Estas inserções têm a vantagem de permitir a obtenção de todo o genoma em um número reduzido de clones, ou, por vezes, do gene intacto em um único clone (Figura 1.6). Figura 1.6 – Construção do DNA recombinante. fonte: www.google.com 4.4 A clonagem molecular Após o advento da engenharia genética, a palavra clone passou a ser usada também para fragmentos de DNA inseridos no interior de uma bactéria e pro- pagados de forma assexuada. Na biologia molecular de micro-organismos, uma colônia de bactérias é conhecida como um clone. A clonagem mole- cular consiste na propagação de moléculas de DNA idênticas e baseia-se na propagação natural de células ou indivíduos geneticamente idênticos ao Além dos bancos de DNA, recorre-se, muitas vezes, a bancos de DNA complementar DNAc de muito menor complexidade, uma vez que contêm somente as sequências codificadoras de determinada proteína expressa no tipo célula que está sendo usado. Neste caso a identificação do clone é de muito mais simples execução. O primeiro passo para construir um banco de DNAc consiste em isolar o RNA mensageiro; em seguida este é transformado em um híbrido DNA:RNA, o que se consegue usando a transcriptase reserva; com o auxílio de uma outra enzima, a polimerase I, o RNA daquele híbrido é substituído por DNA, e só então esta fita dupla DNA:DNA é inserida num vetor e introduzida na célula hospedeira. Continua... ▸ Continuação A identificação do clone pode ser feita por hibridização de sondas de DNA ou RNA marcadas radioativamente, com as bases complementares do clone, sendo a localização feita por autoradiografia. Quando um fragmento de ADN clonado é transcrito e traduzido in vivo, a proteína resultante pode ser identificada imunologicamente, desde que se possua o anticorpo específico, em geral, marcado com I125. Trata- se de outro processo de identificação. Com a possibilidade hoje existente de utilizar sintetizadores automáticos, a síntese de oligonucleotídeos e oligopeptideos tornou-se uma tarefa laboratorial altamente simplificada. O DNA pode ser sintetizado sob a forma de fita simples, tanto de pequeno tamanho, quanto de tamanho maior. Usando as fitas de pequeno tamanho pode introduzir- se mutações em genes. As fitas de DNA de grande tamanho (200pb) usam- se tanto como sondas, como para construir genes sintéticos que têm a enorme vantagem de possuir sítios de clivagem para as endonucleases de restrição, que não se encontram nos genes naturais, o que torna a manipulação daqueles muito mais facilitada. Biotecnologia em Debate 17 4.3 Construindo uma molécula de DNA recombinante Como já referimos, a manipulação genética compreende quatro fases: escolha do fragmento de DNA a ser utilizado, corte deste fragmento, sua transferência e inserção no genoma de determinada célula e, finalmente, seleção das células que possuem as moléculas do clone desejado. Esta última fase é a que oferece maior dificuldade, por ser muito demorada, dependendo da utilização dos cha- mados bancos de DNA. Um banco de DNA possui todas as moléculas de DNA geradas pela inserção do ácido nucleico da fonte de interesse num determinado vetor, o que significa poderem existir vários tipos de bancos, conforme a nature- za da inserção e o tipo de vetor utilizado. Assim, o tipo de banco a ser preparado vai depender do tipo de pesqui- sa em curso. Os elementos que formam os bancos genômicos são clones de DNA do genoma de determinado ser vivo, clones estes, obtidos com ve- tores, como por exemplo, bacteriófagos, que aceitam inserções de grandes tamanhos. Estas inserções têm a vantagem de permitir a obtenção de todo o genoma em um número reduzido de clones, ou, por vezes, do gene intacto em um único clone (Figura 1.6). Figura 1.6 – Construção do DNA recombinante. fonte: www.google.com 4.4 A clonagem molecular Após o advento da engenharia genética, a palavra clone passou a ser usada também para fragmentos de DNA inseridos no interior de uma bactéria e pro- pagados de forma assexuada. Na biologia molecular de micro-organismos, uma colônia de bactérias é conhecida como um clone. A clonagem mole- cular consiste na propagação de moléculas de DNA idênticas e baseia-se na propagação natural de células ou indivíduos geneticamente idênticos ao Além dos bancos de DNA, recorre-se, muitas vezes, a bancos de DNA complementar DNAc de muito menor complexidade, uma vez que contêm somente as sequências codificadoras de determinada proteína expressa no tipo célula que está sendo usado. Neste caso a identificação do clone é de muito mais simples execução. O primeiro passo para construir um banco de DNAc consiste em isolar o RNA mensageiro; em seguida este é transformado em um híbrido DNA:RNA, o que se consegue usando a transcriptase reserva; com o auxílio de uma outra enzima, a polimerase I, o RNA daquele híbrido é substituído por DNA, e só então esta fita dupla DNA:DNA é inserida num vetor e introduzida na célula hospedeira. Continua... ▸ Continuação A identificação do clone pode ser feita por hibridização de sondas de DNA ou RNA marcadas radioativamente, com as bases complementares do clone, sendo a localização feita por autoradiografia. Quando um fragmento de ADN clonado é transcrito e traduzido in vivo, a proteína resultante pode ser identificada imunologicamente, desde que se possua o anticorpo específico, em geral, marcado com I125. Trata- se de outro processo de identificação. Com a possibilidade hoje existente de utilizar sintetizadoresautomáticos, a síntese de oligonucleotídeos e oligopeptideos tornou-se uma tarefa laboratorial altamente simplificada. O DNA pode ser sintetizado sob a forma de fita simples, tanto de pequeno tamanho, quanto de tamanho maior. Usando as fitas de pequeno tamanho pode introduzir- se mutações em genes. As fitas de DNA de grande tamanho (200pb) usam- se tanto como sondas, como para construir genes sintéticos que têm a enorme vantagem de possuir sítios de clivagem para as endonucleases de restrição, que não se encontram nos genes naturais, o que torna a manipulação daqueles muito mais facilitada. inicial. O experimento de clonagem gênica consiste em introduzir o gene de interesse dentro de células bacterianas e posteriormente fazer o isolamento delas em colônias. As células de cada colônia são idênticas entre si. A clonagem molecu- lar consiste em fazer a ligação entre um fragmento de DNA, chamado inser- to, contendo o gene de interesse com outra molécula de DNA, o vetor, para formar uma quimera ou molécula de DNA recombinante. Após, a molécula de DNA recombinante é transportada para dentro de uma célula hospedeira, em geral uma bactéria, ocorrendo o processo de transformação. A célula que recebeu o DNA recombinante é chamada célula transformada, a qual sofre muitos ciclos de divisão, produzindo várias cópias do DNA recombinante. 4.5 Debatendo: vantagens e desvantagens da tecnologia do DNA recombinante Vez por outra, alguns críticos manifestam-se, alegando que os riscos não compensam alguns benefícios obtidos pela tecnologia do DNA recombinante. Seus argumentos são: o que aconteceria com bactérias Streptococcus que recebessem um plasmídeo possuidor de um gene codificador da resistência à penicilina não encontrada nas diversas cepas daquela bactéria. Doenças como escarlatina, reumatismos e doenças renais, controlados por este an- tibiótico, passariam a ampliar o contingente das doenças resistente ao anti- biótico. A este respeito vale lembrar que a Natureza, talvez até com a ajuda do próprio homem, parece ter tomado a iniciativa, criando a oportunidade de aparecimento de uma mutação, que teria tornado um subgrupo dos estrepto- cocos resistentes à penicilina. Membros deste subgrupo poderiam ser os responsáveis pela síndrome do choque tóxico, que preocupa os centros de controle das doenças infeccio- sas. Outro exemplo refere-se à possibilidade de cepas de E.coli, que fazem parte da flora intestinal humana adquirir a capacidade de sintetizar toxina bo- tulínica, ou determinado hormônio, situações que resultariam em óbvios resul- tados desastrosos. Mais um exemplo, é o caso da implantação, em cepas de E. coli, de um gene de um vírus que ocasiona tumores malignos em animais de laboratório, de que poderia resultar o desenvolvimento de tumores no homem, cujo intes- tino é habitat natural daquela bactéria. Todos estes exemplos, ou pelo menos alguns deles, parecem não le- var em consideração que é necessário o atendimento a um certo número de situações como multiplicação e sobrevivência no hospedeiro, transmissão de animal a animal, e resistência aos mecanismos de defesas do hospedeiro. Mesmo com a aceitação das desvantagens de alto risco, não é muito difí- PEREIRA, A. J.18 cil vislumbrar as possibilidades benéficas da técnica do DNA recombinante como insulina a baixo custo, estudos de regulação da síntese de um RNA mensageiro, ou, ainda, as pesquisas in vitro da mutagenese dirigida. Confrontando-se os benefícios com os riscos das técnicas do DNA re- combinante são sempre sujeitos a discussão: uns preferirão argumentos a favor, a outros argumentos contrários. Os próprios cientistas do DNA recombinante alertaram sobre os possíveis riscos inerentes. Mas até agora, ao contrário do que muitas vezes acontece na sociedade em geral, sabem comportar-se com a necessária responsabilidade. Naturalmente o processo não irá desenvolver-se sem contrariedades. E a ciência moderna sabe muito bem o que lhe é permitido e o que lhe é vedado. A dialética que usa é de método crítico de suas experiên- cias, o que lhe confere autoridade para saber que o seu domínio da Natureza é suficientemente utilizável na melhoria da condição humana. As primeiras cidades foram surgindo e por consequência houve o aumento do consumo de alimentos. Neste tempo, começou a haver os desmatamentos para que houvesse campo para o desenvolvimento da monocultura, com péssimas consequências para o meio ambiente. 4.6 Debatendo: desvantagens da monocultura agrícola A monocultura baseia-se no plantio extensivo de um único vegetal. Ela traz desvantagens tanto ambientais porque esgota o solo com o tempo e reduz a biodiversidade, quanto sociais, porque reduz o uso da mão de obra no cam- po e faz com que populações rurais migrem para as cidades. A monocultura agrícola esteve ligada no início com a produção de cana de açúcar escravista no período colonial. Na atualidade, ela está ligada à modernização e industria- lização da agricultura. As principais vantagens da produção de um só produto são os altos ganhos de escala e uniformização da produção que permite a mecanização e a vinculação com mercados internacionais. Os problemas associados à mo- nocultura são o uso da terra em extensão e esquece-se a fertilidade natural e a estrutura do solo, e não se leva em consideração a paisagem, a biodiver- sidade e a vida social dos territórios, onde o fator ambiental é tratado como recurso, reduzido ao uso extensivo da terra. A monocultura carece do uso de agrotóxicos, que quando utilizados em grande quantidade e em grandes extensões de terra gera grande risco am- biental. Além disso, a disseminação de uma única espécie vegetal, seja uma variedade melhorada convencionalmente ou um organismo geneticamente modificado, baseia-se na uniformização e igualdade de espécie, raça e linha- gem. Os riscos da monocultura estão ligados à ocorrência de pragas e doen- ças ou problemas climáticos que podem afetar toda a produção. O DNA por ser uma molécula muito pequena, com apenas 2 nm (namômetros) de comprimento (1 nm = 1 milionésimo do mm), impossível de ser visto a olho nu e muito mais difícil de ser manipulado, pois não podemos enxergar moléculas individuais de DNA, mas podemos multiplicar várias moléculas dele até se tornar visível. Uma das tecnologias usadas com este objetivo é a PCR, que permite a multiplicação de um gene específico em uma pequena amostra de DNA. Com esta técnica podemos obter milhares de cópias de um gene e depois purificar o DNA do gene isolado ou detectar a presença de um gene em uma amostra. As enzimas são utilizadas em muitos segmentos industriais, como o de alimentos e bebidas, de detergentes, têxtil, couro, celulose e papel, química fina, medicamentos e cosméticos e, ainda, em metodologia analítica e em biologia molecular. Amilases, glicose oxidase, pectinases, invertase, renina, naraginase, lipases, proteases, celulases e peroxidases são os biocatalisadores mais utilizados. Enzimas são também empregadas como medicamento, como por exemplo, a asparaginase utilizada no tratamento de leucemia (PEREIRA JR.; SILVA BOM; FERRARO, 2008). Biotecnologia em Debate 19 Texto complementar O vinho e a obesidade Duas taças pequenas de vinho tinto por dia. Essa é a receita para prevenir a hiper- tensão, uma doença que ataca de forma silenciosa 30 milhões de brasileiros e pode causar derrames cerebrais, infartos e insuficiência renal. Recomenda-se aos adultos beberem as duas taças de vinho acompanhadas nas refeições, para ajudar a reduzir a absorção dos alimentos. Além disso, a comida impede o efeito inebriante do álcool. O suco de uva pode substituir o vinho, porém o consumo de dois copos diários poderia gerar outro problema: a obesidade. fonte: Adaptado da Revista Ciência Hoje, Seção Medicina, Instituto Ciência Hoje, SBPC, v. 37, p. 59, ago. 2005. Iluminada criação O vinho sempre esteve associado ao lado mais espiritual do homem e, muitasvezes, à loucura. Inspirador, quando tomado na medida certa, pode ser também o responsável por momentos menos construtivos. É capaz de potencializar a criação quando inunda uma alma apaixonada ou tornar insuportável a vida de outras. A embriaguez conduz cada indivíduo a diferentes caminhos. Uma mente confusa pode não se beneficiar dos lados mais iluminadores do vinho, ao mesmo tempo, que outras personalidades usam essa mesma luz para grandes processos criativos. De uma maneira ou de outra, ele nos modifica e permite novas percepções. O que nasce a partir de seus efeitos pode parecer loucura, mas é sempre o resultado exacerbado de mentes férteis e criativas que nos entregam o mais íntimo e profundo de si. Resta-nos tomar uma taça e tentar decifrá-las. “Beba vinho.” Fonte: CORVO (2011). Síntese do Capítulo Neste capítulo foi relatada a evolução histórica dos principais eventos ocorri- dos no desenvolvimento da biotecnologia. Primeiramente destacou-se a bio- tecnologia das fermentações usada há milênios pelos povos da antiguidade na produção de pães, vinhos, queijos, passando pelos experimentos de Men- del sobre as leis dos caracteres adquiridos e a descoberta da estrutura da molécula do DNA, por Watson e Crick, descobertas estas que, em conjunto, possibilitaram avanços para o surgimento da biotecnologia moderna, a Tecno- logia do DNA Recombinante. Em seguida foram relatadas as técnicas de domesticação de plantas e animais usados pelo homem para diversas finalidades e apresentadas as van- tagens e desvantagens da tecnologia do DNA recombinante e desvantagens da monocultura agrícola. PEREIRA, A. J.20 Leituras, filmes e sites @ CIB-CONSELHO DE INFORMAÇÕES SOBRE BIOTECNOLOGIA. O que você precisa saber sobre transgênicos. 2010. Disponível em < www.cib. org.br/pdf/guia_transgenicos_maio09.pdf OLIVEIRA, T. H. G.; SANTOS, N.F.; BELTRAMINI, L. M. O DNA: uma sinop- se histórica. Revista Brasileira de Ensino de Bioquímica e Biologia Mole- cular, v.1, 2004. Disponível em: <http://www.sbbq.org.br/revista/viewpdf.php? artigoid=110> BORÉM, A. A história da biotecnologia. A ciência que está surpreendendo até os mais otimistas. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, n 34, p. 10- 12, jan.-jun. 2005. FREIRE-MAIA, N. Gregor Mendel: vida e obra. São Paulo: Queiroz Editor, 1995. FREITAS, L. B.; BERED, F. Genética e evolução vegetal. Porto Alegre: Edi- tora da UFRGS, 2003. SALZANO, F. M. DNA e eu com isso? São Paulo: Oficina de Textos, 2005. WATSON, J. D.; BERRY, A. DNA: o segredo da vida. São Paulo: Editora Companhia das Letras, 2005. Filmes http://tvescola.mec.gov.br/index.php?option=com_zoo&view=item&item_ id=4619 (história dos alimentos) http://www.youtube.com/watch?v=zFm-G7geqPQ (fermentação) (Série de Olho na Ciência (A Revolução da Biotecnologia-episódios 1-6) http://www.youtube.com/watch?v=vUex0mGuv-s&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=INoAPaIOyiI&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=a2v2hiGhFGg&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=99U0NESBJEQ&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=-xdUMxRccEU&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=m3QoqPY1sMU&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=0wa7Ujk8ygU Biotecnologia em Debate 21 Sites http://www.cib.org.br/ http://www.mct.gov.br/index.php/content/view/6515.html Textos, atividades online e para sala de aula http://www.odnavaiaescola.com.br/ Pão, vinho e fungos. http://chc.cienciahoje.uol.com.br/revsta/revista-chc-2003/138/pao-vinho-e- -fungos-em-acao/o-pao-o-vinho-e-fungos-em-acao-0 Debate sobre monocultura agrícola http://www.cienciamao.usp.br/dados/rec/_monoculturavoceecontraouafavor- rosiclermartinsrodr.arquivo.pdf Atividades de avaliação 1. O que se entende por biotecnologia das fermentações? 2. Por que a domesticação de plantas e animais foi importante para o desen- volvimento da biotecnologia? 3. Pesquise sobre a vida e contribuição de Rosalind Franklin para a descober- ta da estrutura da molécula de DNA. 4. Pesquise sobre as principais contribuições de Robert Koch para a bio- tecnologia. 5. Faça uma pesquisa na internet sobre os problemas éticos relacionados com a manipulação do DNA pelo homem. Referências ARAGÃO, F. J. L. Organismos transgênicos: explicando e discutindo a tec- nologia. Barueri-SP: Manole, 2003. AYDON, C. A história do homem: uma introdução a 150 mil anos de história humana. Rio de Janeiro: Editora Record, 2011. BUIATTI, M. Biotecnologias: a engenharia genética entre biologia, ética e mercado. 1 ed. São Paulo: Edições Loyola, Edições Paulinas, 2004. CORVO, A. Iluminada criação. Revista da Cultura. 49 ed., Publicação da Livraria Cultura, ago. 2011. PEREIRA, A. J.22 GANDER, E. S.; MARCELLINO, L. H.; ZUMSTEIN, P. Biotecnologia para pedestres. Brasília: EMBRAPA- SPI, 1996. GASSEN, H. G. Biotecnologia para países em desenvolvimento. Cadernos Adenauer: biotecnologia em discussão. São Paulo: Fundação Konrad Ade- nauer, v. 8, 2000. KREUZER, H.; MASSEY, A. Engenharia genética e biotecnologia. 2 ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. PEREIRA J. R., N.; SILVA BOM, E.; FERRARO, M. A. Tecnologia de biopro- cessos. Rio de Janeiro: Escola de Química/UFRJ, 2008. 62 p. il. - (Séries em Biotecnologia, v. 1). SALLES FILHO, S. L. M. Fundamentos para um programa de biotecnologia na área alimentar. Caderno Difusão Tecnológica, Brasília, v. 3, n.3, p. 379- 405, 1986. Capítulo 2 Organismos Geneticamente Modificados (OGM): plantas e animais transgênicos Biotecnologia em Debate 25 Objetivos • Introduzir conceitos básicos e conhecimentos sobre os Organismos Ge- neticamente Modificados, técnicas e processos de obtenção de plantas e animais transgênicos. • Caracterizar a biossegurança, bioética e legislação vigente relacionada às plantas e animais transgênicos. • Discutir sobre as vantagens e desvantagens dos produtos geneticamente modificados. 1. Os alimentos e os organismos geneticamente modificados (OGM) Várias crianças, adultos, homens e mulheres, perambulam pelas ruas das nos- sas cidades em busca de um simples prato de comida. Muitos destes famintos reviram o lixo contido em recipientes nas calçadas, na esperança de encontrar restos de comida que algum morador porventura tenha jogado fora (Figura 2.1). Uma triste realidade que cresce a cada dia diante de nossos olhos, de- vido ao aumento da população humana e principalmente da má distribuição de renda e outros fatores sociais e econômicos. Devemos ter em mente que é um fato a fome ter se agravado no planeta, mas a produção de alimentos tem sido realizada desde a chamada Revolução Verde no século passado, e mais recentemente com a chamada Revolução Biotecnológica com a grande produção de plantas transgênicas. Entretanto, muitas promessas feitas pelos defensores dos alimentos transgênicos de acabar com a fome na Terra tem sido intangíveis. Poucas empresas controlam o essencial da comercialização de or- ganismos geneticamente modificados (OGMs).Poucos países, dentre eles, os Estados Unidos, Argentina, Canadá e China cultivam os OGMs e ape- nas as plantas OGMs de soja, algodão, canola e milho se destacam entre as que apresentam características herbicidas e inseticidas. Ao contrário do que é propagado pela mídia, os OGMs ainda não “dominaram” a agricultura mundial, pois a tecnologia é recente com aplicação em poucas plantas, que são cultivadas em poucos países e produzidas por poucas empresas. Figura 2.1 – Uma criança se ali- mentando de sobras de alimentos. Fonte: www.google.com. PEREIRA, A. J.26 1.1 Transformação gênica Muitas vezes nos lugares mais inesperados encontramos pessoas que nos ajudam a darmos uma guinada em nossas vidas e firmando ótimas parcerias. Pois, foi exatamente isto que aconteceu em 1972 no Havaí, quando dois bio- químicos americanos Stanley Cohen e Herbert Boyer estavam participando de um encontro sobre plasmídeos e, resolveram unir seus conhecimentos sobre plasmídeos e enzimas de restrição para desenvolverem a tecnologiado DNA recombinante, ou engenharia genética (Figura 2.2). Eles isolaram o gene que codifica o RNA ribossômico (rRNA) de uma molécula do DNA de uma rã africana e depois inseriram esse gene no DNA da bactéria Esche- richia coli. A bactéria durante o processo de transcrição, produziu o rRNA da rã, que foi o primeiro ser vivo alterado geneticamente. Este momento foi muito importante, pois permitiu que houvesse a quebra da barreira biológica que separavam os seres vivos, com a transferên- cia de características de uma espécie para outra. Figura 2.2 – Stanley Cohen e Herbert Boyer, os primei- ros engenheiros genéticos do mundo. Fonte: www.google.com. Figura 2.3 – Célula de Escherichia. coli com seu cromossomo e plasmí- deo, e as estruturas que formam um plasmídeo. Fonte: www.google.com. Plasmídeos são pequenos cromossomos circulares encontrados em bactérias que costumam conter genes de resistência a antibióticos. Eles se replicam independentemente do cromossomo principal da célula e podem ser transmitidos de uma bactéria para outra (Figura 2.3). Biotecnologia em Debate 27 Até o momento, a engenharia genética gerou vários Organismos Gene- ticamente Modificados (OGMs) que permitiram avanços e vários impactos na sociedade humana, tanto na produção de novos medicamentos, quanto na produção de alimentos com melhor qualidade nutricional. Da lista de OGMs fazem parte bactérias que são usadas como fábri- cas sintetizadoras de insulina humana, o hormônio de crescimento (hGH) e substâncias anticancerígenas. Além da área médica e farmacêutica, a bio- engenharia também possibilitou a produção de produtos agrícolas contendo resistência a pragas ou com maior quantidade de nutrientes. São exemplos destes produtos, a variedade de tomate ‘Flavr Savr’, a soja transgênica Roun- dup Ready e o milho Bt, dentre outros. 1.2 Como se faz um transgênico Para se construir um transgênico é necessário: o DNA de um organismo euca- riótico contendo o gene de interesse isolá-lo pelo corte com enzimas de res- trição; o DNA de um vetor de clonagem, um plasmídeo, por exemplo, cortado pela enzima de restrição. Após é necessário produzir um plasmídeo híbrido com os fragmentos do DNA do organismo e do vetor com uso da enzima liga- se, que mantêm as extremidades dos fragmentos do DNA unidas. As células hospedeiras, geralmente E. coli, captam o plasmídeo híbrido; e por meio da clonagem gênica a célula hospedeira é transformada, gerando várias clones do gene de interesse cada vez que a bactéria se reproduz, desta maneira o plasmídeo se reproduz junto com a multiplicação celular. Uma tria- gem é realizada para separar as células que receberam o gene de interesse das células que não contem o vetor com o gene de interesse. Por fim, essas células se tornam capazes de transcrever e traduzir o gene de interesse na síntese da proteína codificada por este gene. Em uma modificação ge- nética, o transgene é incorporado no genoma de um organismo através de um vetor que contém muitos outros genes promotores, “terminators” e marcadores da resistência antibiótica cuja ação poderá contribuir no efeito global (Figura 2.4). a) b) Figura 2.4 – Primeiros passos para obtenção de um transgênico. a) seleção do gene de interesse, b) isolamento do gene in vitro. Fonte: www.google.com Os Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) ou transgênicos abrangem todo animal, planta ou microrganismo em que seu material genético, DNA ou RNA, tenha sido modificado pela inserção de um ou mais genes em seu genoma por qualquer técnica de engenharia genética. Estes genes inseridos visam melhorar uma determinada característica ou produzir uma proteína que não seria naturalmente expressa pelo organismo nativo. Por exemplo, a produção no leite de cabra do hormônio insulina usada pelos diabéticos ou a resistência do milho a um determinado vírus, herbicida ou insetos. Sementes de um determinado tipo de planta transgênica geradas pela tecnologia conhecida como “Terminator”, exterminador em inglês, são controladas por grandes empresas. Essas sementes são resultantes de modificações genéticas feitas nas plantas para produzir sementes estéreis, ou seja, que não se reproduzem. Existe um controle do uso desta técnica, pois a semente guardada da colheita, de uma variedade com tecnologia ‘Terminator’, não poderá ser usada para plantio na safra seguinte, pois esta não germinará, ela está morta (Figura 2.5). PEREIRA, A. J.28 Figura 2.5 – A sequência do DNA a ser transferida deve conter um gene selecionado, por exemplo, o gene Bt de resistência a inseto, dois promotores eucarióticos ativos na planta, um para o gene selecionado e um para o gene marcador e, dois terminadores, um para gene selecionado e outro para o gene marcador. Fonte: www.google.com. Considerando que o DNA nem sempre se decompõe no trânsito alimen- tar dos animais e homem, fragmentos funcionais do gene marcador de resis- tência a um antibiótico poderão sobreviver e ser absorvidos por uma bactéria intestinal que contribuirá, assim, a difundir a resistência a esse antibiótico. É deste modo que uma parte de um plasmídeo geneticamente modificado so- breviveu aos efeitos da exposição à saliva humana durante uma hora e con- seguiu transformar bactérias da boca. A saliva contém determinados fatores que aceleram a transformação de bactérias pelo DNA nu. Figura 2.6 – Construção gênica com a inserção do novo gene no plasmídeo vetor Fonte: www.google.com. 2. As plantas transgênicas Chamam-se plantas geneticamente modificadas ou transgênicas, aquelas em que novos genes, responsáveis por características desejáveis são, após prévia identificação e isolamento a partir de diversos organismos, nelas in- corporados e expressos de modo estável. Entre vários genes com interesse agronômico destacam-se os que conferem resistência a diversos patógenos, vírus, bactérias, fungos e nematoides ou a insetos nocivos, bem como tolerân- O primeiro transgênico criado foi a bactéria Escherichia coli, que sofreu adição de genes humanos para a produção de insulina na década de 1980. Em 1983 foi obtida a primeira planta transgênica: uma planta de tabaco resistente a um tipo de antibiótico. As plantas geneticamente modificadas resistentes a insetos, vírus e bactérias foram testadas em campo pela primeira vez em 1985. Depois vieram outras plantas e animais transgênicos, inclusive ratos, macacos, gado e cabras. Enzimas de restrição: são enzimas bacterianas que são capazes de reconhecer, ligar-se e cortar pequenas sequencias de DNA entre nucleotídeos específicos. Vetor: é um agente usado para carregar o gene de interesse para outra célula. Os vetores mais usados são os vírus, leveduras e plasmídeos. Biotecnologia em Debate 29 cia a herbicidas. Os OGMs cultivados são, em 99% dos casos, de dois tipos: “OGMs herbicidas” e “OGMs inseticidas”. Os primeiros são plantas geneticamente modificadas para metabolizar um herbicida. Os segundos são geneticamente modificados para produzir, ao longo de todo o seu ciclo e em todas as suas células, um inseticida. Há uma terceira categoria de OGMs, minoritária, que é resistente a um ataque de vírus. Há uma preocupação de que o “promotor” usado em alimentos transgê- nicos possa se transferir para bactérias ou órgãos internos humanos. Promo- tores permanentemente ativam os genes que, de outra forma, poderiam estar desativados. Cientistas acreditam que isso possa criar efeitos imprevisíveis à saúde, incluindo crescimento celular pré-cancerígeno, encontrado nos estu- dos de alimentação animal. 2.1 Plantas transgênicas com resistência aos herbicidas As primeiras plantas transgênicas produzidas têm genes para resistência a herbicidas, devido à facilidade de manipulação. O fumo tolerante a um herbici- da foi a primeira cultura transgênica a obter aprovação para comercialização, antes mesmo do tomate “Flavr Savr”. A resistência aos herbicidas pode ser obtida portrês mecanismos diferentes: • Através da produção excessiva do alvo bioquímico sensível ao herbicida; • De uma alteração estrutural, resultando em uma afinidade reduzida ou in- sensibilidade ao herbicida; • Da degradação do herbicida antes de atingir o alvo dentro da célula. Teoricamente é possível a introdução de tolerância a qualquer herbi- cida em qualquer planta, desde que os herbicidas apresentem dentre outros aspectos, largo espectro de atuação, elevada atividade unitária, rápida inati- vação, mínima volatibilidade e mobilidade no solo, toxicidade seletiva para as plantas, e mínima ou não toxicidade para espécies animais aquáticos, aves e para o Homem. Também deve ser considerado um baixo potencial de resis- tência a herbicida pelas plantas daninhas. A tolerância aos herbicidas obtida por meio da transgênese não resulta em tolerância a todos os herbicidas, mas somente ao herbicida ou classe de herbicidas contra o(s) qual (is) o mecanismo foi desenvolvido. Existe um risco de um possível fluxo do gene de resistência ao herbicida da planta transgê- nica cultivada para as plantas daninhas. Para minimizar o fluxo do transgene para outras plantas, podem ser usadas práticas culturais em que o plane- jamento de ensaios de campo inclua bordaduras de campo com linhas de plantas com macho-esterilidade ou androestéreis, não polinizadoras; divisão de parcelas e rotação de culturas em conjunto com as culturas existentes nas plantações vizinhas. Pesquisadores de Harvard nos Estados Unidos conseguiram desenvolver um rato transgênico para ser utilizado em pesquisas sobre câncer. Para tal fim, eles juntaram um pedaço pequeno do plasmídeo bacteriano com um oncogene obtido anteriormente de um rato em que foi injetado um gene estranho que produziu este oncogene. Após o oncogene junto com o plasmídeo bacteriano foram injetados em óvulos fertilizados do rato e implantados em uma fêmea. Por fim, alguns filhotes apresentaram em seus cromossomos o oncogene introduzido artificialmente e foram estimulados a se cruzarem entre si para produção de ratos portadores dos oncogenes. Oncogene é um proto- oncogene de ocorrência normal que induz a atividade da telomerase, estimula a proliferação celular e aumenta o suprimento de sangue. Neste proto-oncogene pode ocorrer uma mutação de ganho de função, por exemplo, uma função reguladora em um gene de fator de crescimento, resultando na expressão aumentada ou na secreção de um produto (Fonte: WESTMAN, 2006). PEREIRA, A. J.30 Muitos consideram que a comercialização destas plantas promove um aumento no uso de herbicidas, enquanto outros dizem que é possível que elas provoquem uma redução ou substituição por herbicidas ambientalmente inócuos. Assim, nas plantas transgênicas com resistência a herbicidas devem ser avalia- das com cautela caso a caso, seus riscos, custos e benefícios (Figura 2.7). Figura 2.7 – Transformação do DNA para obtenção de uma planta transgênica resis- tente à herbicida através de cultura de tecidos. Fonte: Adaptado de http://www.clinicaq.com.br. 2.2 A soja resistente ao glifosato Várias plantas transgênicas de fumo, tomate, algodão, linho e batata, resis- tentes ao herbicida glifosato foram obtidas, ou pela introdução de uma enzima insensível ao herbicida, ou pela superprodução da enzima 5- enolpiruvatoshi- quimato 3-fosfato sintase (EPSPS). A enzima EPSPS está presente na rota de síntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano e é o sitio de ação do glifosato. Se o herbicida glifosato for aplicado na plantação de soja, tanto as plan- tas daninhas, quanto as plantas de soja morreriam. Procurando evitar a mor- te das plantas de soja devido ao uso de herbicidas foi desenvolvida a soja transgênica resistente ao herbicida glifosato. A soja resistente ao herbicida glifosato foi obtida pela introdução no genoma da planta do gene que codifica Quando se faz um plantio de uma cultura de soja, por exemplo, várias plantas conhecidas como ervas daninhas começam a crescer junto com a soja, disputando água, adubo e luz etc. Os herbicidas são agrotóxicos aplicados na área de cultivo para eliminar essas ervas daninhas a fim de se obter uma ótima produtividade de soja. Em geral, esses agrotóxicos matam as plantas porque inativam alguma enzima essencial no interior das células. Essas enzimas participam de reações químicas que resultam na produção de moléculas vitais para a planta, como os aminoácidos formadores das proteínas. Assim, quando se aplica o herbicida sobre as ervas daninhas, elas morrem por falta de compostos vitais. Biotecnologia em Debate 31 a EPSPS, isolado da bactéria Agrobacterium tumefaciens estirpe CP4. A soja geneticamente modificada é capaz de metabolizar o glifosato, tornando-se imune aos efeitos destrutivos e letais do herbicida glifosato. 2.3 Plantas transgênicas resistentes a insetos Com estudos nas plantas sobre a biossíntese e a regulação de compostos quí- micos, associados a um certo grau de resistência destas plantas a insetos, re- velou-se que esses elementos químicos encontrados nos tecidos vegetais são antibióticos, alcaloides, terpenos e proteínas. Entre as proteínas, estão incluídas enzimas quitinases, lectinas e os inibidores de enzimas digestivas. Atualmente, genes que conferem resistência a insetos podem ser introduzidos em plantas de interesse para reduzir sua suscetibilidade. Esses genes podem ser obtidos de plantas, bactérias ou de outra origem. Com base nisso, as plantas transgênicas expressando genes com atividade inseticida, representam uma nova alternativa de controle visando minimizar os danos causados por insetos-praga. A grande maioria das plantas transgênicas resistentes a insetos expres- sa genes derivados da bactéria Bacillus. thuringiensis. Atualmente diversas culturas, tais como milho, algodão, soja, arroz e canola, dentre outras, têm sido modificadas geneticamente para expressar proteínas derivadas de Bt. As pró-toxinas Cry, quando ingeridas pelas borboletas, por exemplo, são solubilizadas pelo pH alcalino do trato intestinal da borboleta-alvo e cli- vadas pelas proteases intestinais, tornam-se peptídeos de menor tamanho. Estes são colhidos por receptores específicos encontrados no epitélio, e ini- ciam um processo de destruição tecidual, que colabora para a paralisação muscular, levando o inseto à morte. Esta também pode ocorrer em função de uma segunda causa associada à primeira, que é a multiplicação bacteriana na hemolinfa, determinando um processo septicêmico. Segundo alguns pesquisadores existem vantagens do uso de plantas transgênicas com Bt, como: • Independência do controle das pragas em relação ao clima, seja chuvoso para aplicações terrestres ou ventos e chuvas para aéreas; • Proteção de parte das plantas que são difíceis de serem atingidas com as aplicações; • Controle permanente livrando o agricultor de vistorias e aplicações eventu- ais, além de eliminar os insetos tão logo comece a se alimentar; • Em função dos elevados preços dos inseticidas químicos e dos custos das aplicações sucessivas, como nas culturas de algodão e tomate, as plantas transgênicas podem ser uma alternativa mais viável e econômica para o produtor. Além disso, pode-se ter ainda redução na aplicação de insetici- das, principalmente os de largo espectro. Bacillus. thuringiensis é uma bactéria que habita naturalmente o solo e tem sido empregada há muitos anos como um inseticida microbiano por diversos agricultores, e mais recentemente vem sendo utilizado como uma nova ferramenta para o controle de pragas através da sua expressão nas plantas transgênicas. A atividade entomopatogênica desse microrganismo deve-se à presença de uma inclusão cristalina produzida durante a esporulação, as pró- toxinas. O cristal, composto por proteínas denominadas δ-endotoxina ou proteínas cristal (Cry), apresenta ação extremamente tóxica a altamente específica para larvas deinsetos de três ordens: Lepidoptera, Diptera e Coleoptera, dependendo da proteína. Existem mais de 120 diferentes genes cry e as proteínas Cry estão agrupadas em 22 classes. PEREIRA, A. J.32 2.4 Plantas transgênicas resistentes a vírus Em diversas plantas de interesse agrícola, o controle genético de doenças é feito com o uso de variedades de plantas resistentes. Este método de controle é o preferido pelos produtores por ser mais barato e de fácil utilização. Mas, como a maioria das plantas atacadas por doenças virais não contêm resistência natural, a produção de plantas transgênicas resistentes a vírus tem sido buscada. Essa resistência tem sido obtida principalmente através da introdução de sequências do genoma do próprio vírus, um tipo de resistência derivada do patógeno. Uma das primeiras plantas transgênicas resistente a viroses li- beradas para plantio comercial é o mamoeiro resistente ao vírus da mancha anelar (PRSV) no Havaí. Esse mamoeiro transgênico obteve resistência com a introdução de partes do gene que codifica a capa proteica do vírus PRSV. Várias outras plantas já foram aprovadas para comercialização, como abóbo- ras resistentes a três vírus e batatas resistentes a três vírus. 3. Técnicas de transformação gênica 3.1 Transformação mediada por agrobactérias do gênero Agrobacterium As bactérias Agrobacterium tumefaciens causam tumores e crescimento ce- lular descontrolado em diferentes tipos de plantas. Os tumores do colo cau- sados por estas bactérias são formados acima do nível do solo, na região do colo da planta. Isto é feito pelos plasmídios indutores do tumor, plasmídios Ti, responsáveis pela formação do tumor após a infecção da planta por A. tume- faciens. Os plasmídios-Ti, funcionam como vetores capazes de transferir seu DNA para o genoma do hospedeiro (Figura 2.8). Esta técnica tem sido usada em transformação de soja, tomate, ervilha, algodão de gramíneas. Em determinados experimentos em tomates e alface transgênicos se realiza a inclusão de genes capazes de expressar certas pro- teínas, que ao serem ingeridas, ativam o sistema imunológico do consumidor e funciona como vacinas contra um determinado agente infeccioso, para to- lerância a herbicidas, resistência a pragas e doenças, qualidade nutricional como na retenção de ferro e produção de pró-vitamina A no arroz. Lectinas são proteínas multivalentes com capacidade de ligar-se a carboidratos de forma a aglutiná-los, inclusive àqueles provenientes de superfícies celulares. São encontradas em tecidos de plantas, em leguminosas, como raízes, folhas, frutos e sementes. Elas têm sido identificadas como compostos inseticidas, exercendo função protetora no interior de sementes exemplificadas pelas lectinas de soja e do feijão alado. A toxicidade deste tipo de proteína em mamíferos e pássaros tem sido bem documentada, sendo registrada sua toxicidade a insetos. O mecanismo de ação seria de que a lectina ingerida causaria ruptura das células epiteliais do mesêntero, o que levaria à paralisação no transporte de nutrientes e, também facilitaria a absorção de substâncias nocivas. No entanto, o exato mecanismo de ação das lectinas ainda não está claro. Biotecnologia em Debate 33 Figura 2.8 – Planta transgênica originada pela transformação pó Agrobacterium tumefaciens. Fonte: Adaptado de http://transgeniaemvegetais.blogspot.com. 3.2 Transformação por bombardeamento de micropartículas Esta técnica conhecida também, como bombardeio de microprojéteis ou bio- balística (biológico + balística), o DNA inicialmente ocorre a aceleração de uma macropartícula carregada de milhões de microesferas de tungstênio ou ouro, a micropartícula. A macropartícula é propelida em direção das células-alvo em alta velocidade, porém é retida, após pequena distância, por uma malha de aço, de forma que apenas as micropartículas continuam em direção ao alvo. Uma vez dentro das células, o DNA que reveste as micropartículas se solubiliza e pode ser integrado aos cromossomos das células atingidas. A maioria das varieda- des transgênicas comerciais hoje disponíveis foi de- senvolvida com o uso da biobalísti- ca (Figuras 2.9 e 2.10). Figura 2.9 – Pro- dução de plantas transgênicas com uso de Agrobacte- rium e bombardea- mento com micro- projéteis. Fonte: www.google.com Na produção de plantas transgênicas pela transferência mediada por Agrobacterium, também são utilizados discos foliares com pequeno diâmetro infectados com A. tumefaciens, portadora de plasmídios contendo o transgene. Após aproximadamente um mês de incubação em meio de cultura, plantas são regeneradas dos discos foliares. Por meio de seleção, os indivíduos transgênicos são identificados em fumo, tomate, soja, beterraba e algodão etc. PEREIRA, A. J.34 Figura 2.10. – Técnica de bombardeamento mostrando o tecido a ser bombardeado, bombeador, cultivo de tecidos e regeneração da planta. Fonte: http://biotecnologiaegenetica.blogspot.com/ 2011/09/plantas-transgenicas.html 3.3 Transformação por microinjeção Esta técnica foi desenvolvida para transformação gênica em animais e, depois foi aplicada às plantas. Nesta técnica, agulhas microcapilares são utilizadas na introdução de DNA. Cada célula a ser transformada precisa ser manipu- lada individualmente. Uma das vantagens deste método é que a quantidade de DNA injetado pode ser otimizada. Resultados positivos já foram obtidos em diversas espécies vegetais: milho, trigo, soja, fumo, arroz etc., bem como em animais: salmão, bovinos e suínos. 3.4 Transformação direta A transformação por métodos diretos utilizam protoplastos, células sem pare- de celular, que servem como alvo para introdução do transgene. Ele consis- te em adicionar grandes quantidades de plasmídios quiméricos à cultura de células sem parede celular, Uma pequena proporção das células assimila os plasmídios, cuja frequência de assimilação pode ser elevada com a adição de polietileno glicol (PEG) ou com o uso de uma descarga elétrica (eletroporação). Nenhuma barreira à transformação direta tem sido detectada, indican- do que este método pode ser utilizado praticamente em qualquer espécie. A maior dificuldade encontrada neste método é a dificuldade de regeneração de planta completa a partir de células sem parede celular. 4. Aspectos de biossegurança e bioética Com o surgimento das técnicas de transgenia surgiram algumas preocupações com a biossegurança e a bioética. A biossegurança tem por finalidade prevenir os riscos potenciais à saúde humana, animal e ao meio ambiente, quanto a utilização de OGMss. É unânime entre melhoristas de plantas, ambientalistas, pesquisadores e a sociedade em geral a necessidade da regulamentação em Biotecnologia em Debate 35 nível das atividades desenvolvidas, os testes e a própria liberação comercial de um organismo transgênico. A regulamentação do uso da engenharia genética e a liberação para cultivo de OGMss, já foi estabelecida em vários países, inclusi- ve o Brasil. Os ensaios de biossegurança acontecem em 4 fases: • Caracterização molecular quando se determinam onde os genes foram integrados e como são transmitidos para a próxima geração; • Caracterização agronômica: onde é feita a comparação das variedades geneticamente modificadas com as variedades convencionais. É feita tam- bém uma busca por diferenças entre as duas, além da característica dese- jada. É importante ressaltar que só teremos um produto se nessa fase não for identificada nenhuma característica indesejada; • Análise de segurança alimentar, quando são analisadas as diferenças na composição das duas variedades e seus fatores nutricionais. Também acontecem experimentos com animais para verificar possíveis efeitos negativos, checando seus genes e as gerações descendentes; • Análise de segurança ambiental quando são analisados o fluxo gênico e os efeitos sobre organismos não alvos, por exemplo, micro-organismos e insetos benéficos. 4.1 A CNTBio Caso
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