DNA e proteínas

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Letícia Fugita
BBPM I – 2020.1
Problema 2
Miguel, 2 anos de idade, identificado em visita domiciliar pelo Agente Comunitário de Saúde (ACS) com déficit de crescimento, foi encaminhado para consulta com pediatra no Centro de Especialidades Médicas (CEM) de Três Lagoas. Na consulta, a mãe relatou que a família mudou para a cidade há 1 ano e a criança nasceu na fazenda do interior do estado, o qual o pai era caseiro. Durante a lactância, a criança teve cólica e diarreia com fezes fétidas contendo partículas de alimento não digeridas. Durante seu segundo ano, a criança cresceu pouco, desenvolveu tosse crônica e teve repetidas infecções do trato respiratório superior. Na história pregressa familiar, não houve relatos de déficit de crescimento, distúrbios alimentares ou doença pulmonar. Ao exame físico, apresentava grave erupção por fraldas, ronco difuso e leve baqueteamento digital. Após breve discussão sobre algumas causas possíveis da doença, o pediatra solicitou vários testes, incluindo teste de concentração de cloreto no suor que demonstrou níveis acima dos valores de referência, levando à suspeita de uma doença genética relacionada à alteração na estrutura de uma proteína.
QUESTÕES
01. Descreva o processo desde a leitura do DNA até a codificação das proteínas e suas estruturas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias. Porque uma mutação pontual pode afetar a estrutura e função de uma proteína específica.
02. Considerando os aspectos básicos sobre estrutura e organização de proteínas, responda:
a. Caracterize brevemente os tipos de alterações estruturais na CFTR. e destaque a  importância do domínio R.
b. Sabendo que as proteínas são estabilizadas por diferentes ligações químicas, cite alguns fatores que possam desnaturar a proteína CFTR e quais as implicações clinicas dessa alteração?
Pergunta 1
Para compreender o processo de codificação genética das proteínas, é necessário voltar para o início, no processo de replicação do DNA – fase S do ciclo celular. Sabe-se que o DNA é formado por 2 fitas antiparalelas compostas por nucleotídeos formados por um grupamento fosfato, uma desoxirribose e uma base nitrogenada (BN) – A, T, G ou C. Simplificadamente, na replicação – que é semiconservativa – em indivíduos eucariontes (DNA linear), a dupla-hélice é separada pela DNA helicase (quebra as pontes de hidrogênio); em seguida, as DNA polimerases começam a adicionar nucleotídeos à cada fita molde (fita líder e fita descontínua) no sentido 5´→3´, mas não antes de um primer (sintetizado pela enzima primase) ser previamente adicionado em seu devido ponto de origem de replicação. Por fim, a DNA ligase une os fragmentos de Okasaki (produzidos na fita descontínua) concluindo, assim, resumidamente, o processo de replicação do DNA.
Em segundo lugar, tem-se a transcrição do DNA em RNA – uma molécula de fita única formada por grupos fosfatos, riboses e BN (A, U, G ou C). Esse processo é realizado pelas RNA polimerases, sendo essas capazes de iniciar a síntese sem a necessidade de um primer como na replicação, no sentido 5´→3´. Nas células eucarióticas, há três tipos de RNA polimerases: a I (sintetiza o RNAr), a II (o RNAm) e a III (o RNAt), e a transcrição pode ser dividida em 3 fases. Na iniciação, a enzima se liga à região no DNA que possui o gene que será transcrito. Já na fase de alongamento, essa enzima começa a sintetizar o RNA complementar ao molde da fita ativa de DNA. Por fim, na terminação, a fita sintetizada e a enzima são liberados. É importante pontuar que existem regiões de íntrons e exons no pré-RNA e, por esse motivo, acontece o splicing (remoção das regiões não lidas de íntrons).
Segue-se, então, a tradução da informação genética contida no RNAm. Nesta etapa acontece a síntese das proteínas. Sabe-se que o código genético é universal e degenerado (um aminoácido pode ser codificado por mais de uma trinca diferente), formado por trincas de bases nitrogenadas, denominadas códons. Nos eucariontes, o ribossomo é o 80S, cujas subunidades são as 60S e 40S, e contém três sítios de ligação: E, P e A. Aqui o processo se inicia quando o RNAm se liga a um ribossomo (subunidade 40S) e o sítio P de tradução é ocupado pela metionina – start códon – e seu anticódon. Durante o processo de alongamento, outro RNAt se liga ao sítio A, formando a ligação peptídica. O ribossomo então se move com gasto energético, e esse segundo RNAt passa a ocupar o sítio P, enquanto o primeiro, agora descarregado, ocupa o sítio E. Esse processo se repete até que algum códon de parada (UAA, UAG ou UGA) se ligue ao sítio A do ribossomo. Esse códon é reconhecido por fatores de liberação que rompem a ligação peptídica quando o códon de parada se encontra no sítio E, onde é, por fim, liberado, concluindo o processo de tradução.
A classificação é feita, portanto, em 4 níveis. A estrutura primária é caracterizada pelas ligações covalentes entre os aminoácidos (ligações peptídicas). Em seguida, formam-se as estruturas secundárias, as quais formam pontes de hidrogênio na cadeia de aminoácidos, resultando nas alfa-hélices ou beta-folhas. Quando ocorre o enovelamento tridimensional dos polipeptídeos, temos a estrutura terciária, formadas por ligações covalentes (como as pontes dissulfeto) ou ligações de hidrogênio. Finalmente, a associação de dois ou mais agrupamentos polipeptídicos formam a estrutura quaternária.
Na ocorrência de uma mutação pontual, que é a modificação em um nucleotídeo da sequência, pode haver alteração da proteína codificada. Isso ocorre porque os códons, organizados em trincas, podem se alterar e formar aminoácidos diferentes do inicial ou não. Essas mutações podem ser silenciosas (quando não alteram o aminoácido), missense (quando alteram o AA) ou nonsense (quando formam um códon terminal). No caso da última, um códon UGU, por exemplo, pode sofrer mutação em sua última base, se transformando em UGA (stop códon), causando problemas na síntese da proteína.
Pergunta 2
a. As mutações do gene CFTR são classificadas de acordo com o grau de comprometimento que essas causam, sendo, então, divididas em seis classes. Na classe I estão as mutações que resultam na ausência da proteína (mutação pontual nonsense), ou em proteínas instáveis. Na segunda classe estão as que resultam em proteínas que não sofrem a devida maturação, não alcançando a estabilidade no retículo endoplasmático e, por isso, degradando-se precocemente. Na terceira classe, as mutações não têm ação sobre a maturação da proteína como na classe anterior, no entanto, causam deficiências de regulações nos canais de cloro, pois modificam os domínios de ligação das AMPs. As mutações da classe IV estão localizadas em aminoácidos que formam os poros condutores, caracterizando proteínas com anormalidades nos canais regulatórios de cloro, como a redução do tempo de abertura ou menor eficiência desses canais. Por fim, as mutações pertencentes à quinta classe marcam a redução da síntese e, consequentemente, da produção das proteínas CFTR funcionais, e as pertencentes à classe VI levam à redução da estabilidade da proteína na membrana plasmática desta, o que resulta no aumento da degradação pelos lisossomos e, também, no aumento da endocitose. 
O domínio R se faz importante na medida em que liga as duas metades da proteína CFTR – cada metade formada por um domínio transmembrana (TMDs) e um domínio de ligação de nucleotídeos (NBDs) –, além de realizar a regulação das atividades no canal: a fosforização do domínio R em conjunto com a ligação da NBD com o ATP é responsável pela abertura do canal da CFTR e sua desfosforização, por conseguinte, inibe a abertura do canal.
b. Simplificadamente, a desnaturação proteica consiste da perda da estrutura tridimensional da cadeia polipeptídica, isso é, das estruturas secundárias e/ou terciárias de uma proteína. Esse processo leva, na quase totalidade das vezes, à perda da função biológica da proteína que sofre a desnaturação. No caso das CFTRs, essas podem ser desnaturadas por fatores como temperatura e compostos químicos, que degradama estrutura da proteína e causam erros no enovelamento destas, alterando, também, suas atividades funcionais. Dessa maneira, possíveis implicações clínicas remetem a deficiências nos canais de íons cloreto e na regulação iônica nas células.