AULA PRATICA 01 Bioinformática

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ROTEIRO DE ATIVIDADES PRÁTICAS 
 
PARA REALIZAR ESTA ATIVIDADE, VOCÊ PRECISA 
Estudar todo conteúdo da disciplina de orientação para realização desta atividade. 
Recomendamos também que você faça a leitura especificada abaixo: 
- Chen et al. 2020. Clinical characteristics and intrauterine vertical transmission potential of COVID-19 infection in 
nine pregnant women: a retrospective review of medical records. The Lancet 
- Prosdocimi F. Introdução à Bioinformática. 2007. Disponível online em 
http://www.iq.usp.br/setubal/bmc/2015/FProsdocimi07_CursoBioinfo.pdf 
 
ATENÇÃO: Você pode realizar esta atividade em casa, sem necessidade de agendar ou ir até o polo EaD. 
 
 
OBJETIVO DO PROCEDIMENTO 
- Compreender como é realizado o desenho de primers para amplificação de um gene alvo 
- Aplicar softwares de alinhamento para comparar sequências biológicas 
- Apontar como abordagens de bioinformática podem ser aplicadas em situações reais 
 
 
MATERIAL NECESSÁRIO PARA REALIZAÇÃO DA ATIVIDADE 
Você utilizará os seguintes softwares gratuitos: 
 
- Primer Blast, disponível online (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/); 
- Needle, disponível online (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). 
 
 
PROCEDIMENTOS 
 
1. Cenário 
 No ano de 2020 a Organização Mundial da Saúde decretou a pandemia pelo SARS CoV2 (novo 
coronavírus), isolado pela primeira vez em Wuhan - China (COVID-19), uma emergência global de saúde 
pública. Para controlar a expansão de uma pandemia de doença infecciosa como essa, é essencial o rápido 
diagnóstico de novos pacientes infectados. O diagnóstico molecular para COVID-19 consiste na realização da 
técnica de RT-PCR em tempo real.. A RT-PCR em tempo real é uma variação da PCR (Reação em Cadeia da 
Polimerase) em tempo real, utilizada para vírus de RNA, na qual o RNA viral extraído é convertido em cDNA 
(transcrição reversa) e em seguida é realizada a PCR em tempo real. 
 Lembre-se que a PCR faz várias cópias de uma determinada região do DNA. Os primers são sequências 
sintéticas curtas de nucleotídeos necessárias como reagente na PCR (Figura 1). Esse par de sequências vão 
se ligar nas extremidades de uma região específica na fita de DNA para oferecer uma extremidade 3’ OH 
livre para adição do primeiro nucleotídeo da cópia que será sintetizada. Os produtos da PCR são vários 
pequenos fragmentos de DNA em um tubo. Se desejarmos identificar a sequência de nucleotídeos desses 
CURSO: BIOMEDICINA 
DISCIPLINA: BIOINFORMÁTICA (SDE4499) 
ATIVIDADE PRÁTICA 1 
TEMA: Construção de primers e alinhamento de sequências 
 
 
fragmentos é necessário utilizar técnicas de sequenciamento. 
 Na prática de hoje você utilizará um programa de computador para desenhar primers que poderão ser 
utilizados em uma reação de PCR para diagnóstico da COVID-19. Depois você irá comparar as sequências de 
nucleotídeos dos fragmentos amplificados pela PCR através de um programa para alinhamento de 
sequências. 
 
Figura 1: Resumo da reação de PCR. PCR Components: reagentes da PCR; DNA Sample: amostra de DNA; Nucleotides: nucleotídeos; 
Mix Buffer: tampão; PCR Tube: tudo de PCR; PCR Process: processos da PCR; Desnaturing: desnaturação (separação) da dupla fita de 
DNA; Anneling: anelamento (ligação) dos primers no DNA; Extension: extenção da cópia de DNA; Strands: fitas de DNA. Fonte: 
https://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/pcr.html 
 
2. Desenvolvimento da atividade prática 
 Abaixo está uma sequência de nucleotídeos que pertence ao gene “S”. Esse gene codifica uma proteína 
do envelope viral que permite que o novo coronavírus se ligue à célula do hospedeiro e a invada. Nessa 
primeira etapa vamos desenhar os primers que amplificarão uma região do gene “S” do novo coronavírus. 
Vamos utilizar a ferramenta online do “Primer Blast” que pertence ao NCBI. 
 
2.1. Acesse o site https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 
2.2. Copie a sequência abaixo, juntamente com o cabeçário (linha que começa com “>”), e cole na caixa 
abaixo da frase “Enter accession, gi, or FASTA sequence”: 
 
>Sequencial parcial do gene S do COVID-19 
ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAAT 
TCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCC 
AATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTT 
TATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTT 
AATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAA 
AGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAA 
GGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATT 
AATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACT 
TTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTT 
CAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAG 
TGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTC 
 
2.3 A região dessa sequência que desejamos amplificar através da PCR está marcada em negrito. Ela vai do 
nucleotídeo 167 ao 895. Nós podemos passar essa informação para a ferramenta de confecção de primers. 
Basta você preencher a posição que você deseja que os primers se liguem no molde de DNA. Por exemplo, o 
primeiro primer deve se ligar no início da sequência, entre a posição 1 e a posição 166, enquanto o segundo 
primer deve se ligar no final da sequência molde, entre a posição 896 e 960 (Figura 2). 
 
 
 
Figura 2: Como determinar a posição de ligação dos primers no molde de DNA 
 
2.4 Em “Primers Parameters” (parâmetro dos primers) ajuste o tamanho do fragmento de DNA que nós 
desejamos que esses primers sintetizem. No nosso caso é entre 600 e 800 nucleotídeos. Então, preencha a 
lacuna em frente a “PCR product size” (tamanho do produto da PCR) com “Min” de 700 e “Max” de 800. Os 
demais parâmetros não precisam ser alterados e podemos usar os valores padrões que a ferramenta sugere. 
“# of primers to return” se refere ao número de pares de primers que a ferramenta irá construir. E “Primer 
melting temperatures (Tm)” é a temperatura na qual os primers irão se ligar na fita molde de DNA. 
 
2.5 Em “Primer Pair Specificity Checking Parameters” (parâmetros de verificação da especificidade do par de 
primers) a ferramenta testa se o par de primers está se ligando exatamente na parte do DNA que queremos, 
e não em qualquer outra região. Nesse caso vamos alterar dois parâmetros. O primeiro será “Database” 
onde você irá selecionar “nr”, que indica para ferramenta usar como bando de dados todas as sequências 
que o NCBI possui armazenadas. Em “Organism” (organismo) preencha a lacuna com a palavra 
Betacoronavirus, nome do gênero ao qual o novo coronavírus pertence. 
 
2.6 No final da página clique no botão “Get primers” (obter primers). 
 
2.7 Agora a ferramenta te dirá se existe no banco de dados sequencias do novo coronavírus com aquela sua 
sequência alvo. Escolha qualquer uma das opções de genomas de SARS CoV2, clique em “Submit” e aguarde 
a página com os resultados ser carregada. 
 
2.8 Como resultado, a ferramenta mostra um desenho que representa as posições dos pares de primers em 
relação a sequência que você forneceu. Abaixo, é possível ver as sequências de nucleotídeos dos 10 pares de 
primers que a ferramenta sugeriu. Fica a critério do usuário (você) escolher o melhor par baseado nas 
informações dadas. 
 
 Imagine agora que o par de primers que você escolheu foi usado na reação de PCR para testar a presença 
do COVID-19 em amostras respiratórias de pacientes suspeitos em diferentes países. Quando a reação foi 
positiva, o fragmento amplificado foi enviado para o setor do laboratório que realiza o sequenciamento de 
DNA. Agora você irá comparar o resultado de sequenciamento da região do DNA do COVID-19encontrado 
em dois pacientes diferentes, um de Wuhan, China, onde os primeiros casos apareceram, e outro na 
Austrália. 
 
2.9 Abra a página online https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ 
 
2.10 A ferramenta de alinhamento global Needle é utilizada para o alinhamento de duas sequências. No 
nosso caso vamos alinhar duas sequências de DNA, por isso na opção “Enter a pair of” selecione DNA. 
 
2.11 Na primeira caixa copie e cole a sequência abaixo, que foi obtida de um paciente contaminado em 
Wuhan: 
 
>MN908947, parte do gene S do paciente de Wuhan 
ACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATT 
TAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTC 
CCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCA 
CAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCT 
 
TATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAA 
GCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCAC 
TAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTA 
TGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCT 
 
2.12 Na segunda caixa copie e cole a sequência abaixo, que foi obtida de um paciente contaminado na 
Austrália: 
 
>MT007544, parte do gene S do paciente da Austrália 
ACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATT 
TAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTC 
CCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCA 
CAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCT 
TATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAA 
GCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCAC 
TAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGGTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTA 
TGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCT 
 
2.13 Clique em “Submit” e aguarde o resultado. 
2.14 Observe que na página de resultados existem as seguintes informações: identidade entre as duas 
sequências (“identity”), similaridade entre elas (“similarity”) e deleções/inserções entre as duas sequências 
(“gaps”). Verifique a porcentagem de identidade entre elas. 
 
2.15 Visto que a identidade é 99%, existe uma diferença entre as sequências obtidas dos dois pacientes, 
tente encontrá-la observando o alinhamento mostrado. 
 
2.16 Entre as posições 551 e 600, exatamente na posição 574, o nucleotídeo T (timina) presente na 
sequência do paciente de Wuhan foi substituído pelo nucleotídeo G (guanina) na sequência do paciente da 
Austrália. 
 
3. Reflexão 
 Durante essa prática você aplicou o conhecimento sobre como são desenhados primers para amplificação 
de uma região alvo no DNA de um organismo. A amplificação dessa região específica do novo coronavírus 
teve como objetivo detectar sua presença na amostra de pacientes suspeitos de estarem infectados. Após a 
identificação dos resultados de paciente positivos (infectados), você teve acesso ao sequenciamento do DNA 
dos fragmentos amplificados pela PCR. Com essas sequências em mãos você realizou um alinhamento global 
das sequências de dois pacientes de países distintos. A diferença encontrada entre as duas sequências é 
chamada de mutação, nesse caso, a troca de uma timina por uma guanina. As sequências que você analisou 
são reais, e isso mostra que à medida que o vírus vai se espalhando entre pacientes pelo mundo, ele pode 
sofrer mudanças, que refletem a sua evolução ao longo do tempo. 
 
 Na próxima aula daremos continuidade a análise do genoma do novo coronavírus mutado, isolado do 
paciente australiano 
 
AVALIANDO OS RESULTADOS 
 
Você poderia usar esse par de primers para detectar a presença do vírus do sarampo nos pacientes?