Tipos de PCR_eletroforese

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TECNOLOGIA GENÉTICA: DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR E BIOINFORMÁTICA
ELETROFORESE E TIPOS DE PCR
PROF. V INICIUS C . SANTANA
PCR “CONVENCIONAL”
ELETROFORESE
Técnica baseada na separação de partículas
ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um meio
semissólido apropriado, pelo qual uma corrente elétrica é aplicada.
Consiste na migração de moléculas ionizadas, em solução, de acordo com suas cargas
elétricas e pesos moleculares em campo elétrico.
Moléculas com carga (-) migram para o pólo (+) (ânodo) 
Moléculas com carga (+) migram para o pólo (-) (cátodo)
ELETROFORESE
Eletroforese em gel de agarose: 
Agarose é um polissacarídeo composto por ágar e pectina
Durante preparo do gel, adiciona-se brometo de etídio (afinidade pelo DNA
e RNA) e se faz a revelação com luz UV
Pontos importantes
A concentração do gel de agarose
A corrente elétrica aplicada
Tampão deve ser preparado na concentração correta
ELETROFORESE
Separa as moléculas (ácidos nucléicos) de acordo com o seu peso molecular
DNA e RNA possuem carga elétrica negativa → migram para o pólo positivo
(quanto menores, mais migram);
ELETROFORESE
Elementos básicos para a realização 
da técnica 
ELETROFORESE
Propriedade de separação do 
Gel de agarose - tamanho
ELETROFORESE
1000pb
500pb
1500pb
3000pb
6000pb
1kb plus
ladder
Amostra 1 Amostra 2
ELETROFORESE
100pb
Tipos
Eletroforese em gel de poliacrilamida: 
Poliacrilamida - uma mistura de dois polímeros, acrilamida e 
bisacrilamida. 
tem a capacidade de separar fragmentos muito pequenos de
DNA e também separa proteínas
o gel de agarose é mais utilizado, pois a poliacrilamida é muito
tóxica e difícil de ser preparada
a corrida é feita em cubas verticais
ELETROFORESE
ELETROFORESE
ELETROFORESE
Variações da PCR:
NESTED PCR
NESTED PCR
NESTED PCR
Na nested PCR, ao invés de se
usar uma amostra primária para
fazer a PCR, utiliza-se o produto
de uma PCR anterior com um par
de primers internos ao par
utilizado na primeira reação. Ou
seja, é a PCR do produto da PCR.
Maior sensibilidade e 
especificidade!
NESTED PCR
Variações da PCR:
MULTIPLEX PCR
PCR MULTIPLEX
A PCR multiplex permite a amplificação
simultânea de diferentes alvos em um
único tubo de PCR. Não apenas economiza
tempo, reagentes e amostras, mas também
possibilita a comparação simultânea de
múltiplos amplicons.
✓ Primers devem ser muito 
bem desenhados
✓ Os amplicons devem ter 
tamanhos diferentes
✓ Tampão específico para 
viabilizar todas as reações
Variações da PCR:
RT-PCR E PCR EM TEMPO REAL
EXTRAÇÃO DE RNA POR TRIZOL
Trizol
EXTRAÇÃO DE RNA POR KIT COMERCIAL
QUANTIFICAÇÃO DO RNA - NANODROP
Relação 260/280 → ideal ser próxima de 2. Relações menores do que 2 podem indicar 
contaminação com proteínas
Relação 260/230 → ideal estar entre 2 e 2,3. Relações menores do que 2 podem indicar 
contaminação com carboidratos e fenol
AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DO RNA
Gel de agarose + brometo de 
etídeo
Bioanalyzer
RT-PCR (PCR COM TRANSCRIÇÃO REVERSA)
RT-PCR SEGUIDA DE PCR EM TEMPO REAL 
(REAL-TIME qPCR)
OligoDT
REAL-TIME qPCR COM SYBR GREEN
RT-PCR (PCR COM TRANSCRIÇÃO REVERSA)
Ct = cycle threshold
Ciclo a partir do qual a taxa de amplificação se torna
exponencial e/ou detectável pelo equipamento –
utilizado para quantificação e avaliação da 
expressão gênica relativa
Quanto mais DNA molde menor será o Ct
REAL-TIME qPCR COM TAQMAN
https://www.youtube.com/watch?v=fkUDu042xic
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REAL-TIME qPCR
QUESTÕES
1. Você é um perito e precisa confirmar qual é o assassino dentre 5 suspeitos. Você 
encontrou um fio de cabelo no local do crime, possivelmente do autor. Qual (ais) 
procedimento(s) (aprendidos até o momento) você faria para identificar o assassino sem 
deixar dúvidas? 
2. Você trabalha em um laboratório e acaba de receber uma amostra de sangue de um 
paciente que suspeita ter sido infectado pelo HIV. Qual (ais) procedimentos você faria 
para:
A) Apenas confirmar se há células infectadas circulantes.
B) Avaliar a carga viral do indivíduo.
QUESTÕES
3. Você é um pesquisador e está interessado em entender se sua molécula de estudo tem 
efeito sobre a expressão gênica no tecido do coração de camundongos. Qual (ais) 
procedimento(s) você faria para responder à sua pergunta? Se você precisasse confirmar 
seu achado com um método, poderia fazer algum outro método aprendido até o 
momento?
QUESTÕES
4. Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. Você acabou 
de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma cena de crime, juntamente 
com amostras de DNA de três possíveis suspeitos. Seu trabalho é examinar um marcador (pode 
ser um gene ou outra sequência qualquer de DNA) em particular e verificar se algum dos três 
suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador.
O marcador em questão possui dois alelos. Um deles contém uma única repetição (Microssatélite
- região marrom abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da repetição. Em uma reação de
PCR com primers que amplificam uma região que contém a (as) repetição (ões), o primeiro alelo
produz um fragmento de DNA de 200pb, enquanto o segundo produz um fragmento de DNA
de 300pb
Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os resultados por 
eletroforese em gel, como representado abaixo:
O DNA de qual suspeito coincide com o DNA da cena do 
crime para esse marcador?
CURIOSIDADE: Por meio do exame de múltiplos marcadores, cada um dos 
quais vem em muitas formas de alelos, os cientistas forenses podem 
montar uma "impressão digital" singular a partir de uma amostra de DNA. 
Em uma análise típica de microssatélites, usando 13 marcadores, as chances 
de um falso positivo (duas pessoas tendo a mesma "impressão digital" de 
DNA) são menores que 1 em 10 bilhões!