Coloração de Gram

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Microbiologia Clínica- Coloração de Gram
Introdução
Em 1884, em um laboratório dinamarquês um cientista
chamado Christian Gram, descobriu que poderia corar as
bactérias com um conjunto de reagentes e, além disso,
essas bactérias adquiriam cores diferentes, o que permitiu
classificá-las em dois grupos distintos:
● Coloração roxa/violeta: bactérias Gram-positivas;
● Coloração rosa: bactérias Gram-negativa.
A causa desse fenômeno está relacionada com as
diferenças estruturais na parede celular desses
organismos. As bactérias Gram-positivas absorvem e
retém o corante primário, enquanto que as bactérias
Gram-negativas absorvem o corante primário em um
primeiro momento porém depois permite a saída do
mesmo, em seguida são absorvem e retém o corante
secundária, por isso ficam rosa/vermelha.
O corante primário é chamado de Violeta de metila. Para
a descoloração usa-se álcool absoluto. E, por fim, o
corante secundário é o safranina (antigamente usava-se a
fucsina). A vantagem da safranina em relação a fucsina
está relacionado com a melhora do contraste de coloração
durante a diferenciação das bactérias.
Importância desse método diagnóstico
1. Preparação dos corantes: essa técnica é uma
etapa muito importante para o diagnóstico clínico. Isso
porque esse método diagnóstico é rápido, fácil e com
grande capacidade de resolução e permite que 80% dos
pacientes tenham seu problema resolvido em caráter de
pronto atendimento a nível local. Tudo isso com baixo
custo de investimento e manutenção. A bacterioscopia
pode ser feita com poucos recursos: sala pequena, balcão
com pia, bico de bunsen, e microscópio com uma objetiva
de imersão. É importante que o técnico seja bem treinado,
responsável e consciente da importância do trabalho. A
diferenciação das cores que as bactérias assumem depois
de coradas é um ponto fundamental no método de Gram.
Para a garantia do processo é necessário preparar os
próprios corantes. Materiais necessários para preparar os
corantes:
- Um béquer de 500mL
- Um béquer de 1000mL
- Uma balança gramatária
- Uma balança eletrônica
- Dois bastões de vidro
- Uma proveta de 200mL e 500mL
- Uma espátula ou colher de café.
Para preparar a solução de violeta de metila: para a
primeira solução é necessário pesar 2g da violeta de
metila e transferir para o béquer de 500mL. Adicionar
100mL de álcool etílico e, em seguida, 100mL de álcool
metílico. Posteriormente misture lentamente com o
auxílio do bastão de vidro. Deixar a solução descansar
por alguns minutos e misturar outras vezes até a completa
dissolução. Para a segunda solução é necessário pesar 4g
de oxalato de amônia e transferir para o béquer de
1000mL. Adicionar 200mL de água destilada e misturar
lentamente e constantemente até a completa dissolução.
Observar se não sobraram resíduos no fundo do béquer.
Juntar as duas soluções e utilizar o restante da água
destilada no béquer que continha a violeta de metila para
recuperar os resíduos da violeta de metila. Deixar
descansar por 24h e filtrar em papel de filtro comum,
acondicionando o corante em um frasco de vidro escuro
(previamente lavado e seco). A boa prática laboratorial
recomenda a identificação de todos os reagentes.
Para preparação do Lugol concentrado: pesar 4,5g de
iodeto de potássio e transferir para um béquer contendo
450mL de água destilada, com o auxílio do bastão de
vidro misturar bem até completa dissolução. Em seguida,
pesar 3g de iodo metálico e adicione à solução de iodeto
de potássio. Misturar bem até a dissolução (coloração
marrom/castanho). Armazenar em um frasco de vidro
escuro previamente identificado. Para a coloração deve-se
utilizar o lugol diluído, para isso adicione, em um frasco
conta gota, 2mL de lugol em 38mL de água destilada.
Para a preparação da safranina: pesar 2,5g de safranina
e dissolver bem o pó em 500mL de água destilada,
misturando bem até a completa dissolução. Guardar em
um frasco de vidro devidamente identificado.
2. Método da colocação: como a violeta de metila já
foi preparada com um fixador químico (álcool metílico),
não há necessidade de fixar o esfregaço na chama. A
fixação química promove maior nitidez na visualização
das estruturas coradas. Inicialmente começa a coloração
cobrindo o esfregaço na lâmina com uma pequena
quantidade de violeta de metila, deixando o corante agir
por 15 segundos. Em seguida adicionar na lâmina a água
destilada para hidratar o corante e deixar agir por mais 45
segundos. Posteriormente, escorrer o corante e lavar a
lâmina com água corrente. Cobrir a lâmina com o Lugol
diluído e deixar agir por 60 segundos, em seguida
escorrer o Lugol e lavar a lâmina com água corrente. Em
seguida inicia-se o processo de descoloração, para isso
adiciona-se o álcool absoluto (99,5º GL) e escorra o
álcool pela lâmina até que não se desprenda mais corante,
em seguida torne a lavar em um fio de água corrente.
Posteriormente, cobrir a lâmina com safranina e deixar
agir por 30 segundos, lave com fio de água corrente.
Secar as lâminas suavemente com auxílio do papel de
filtro limpo ou deixar secar naturalmente. As lâminas
estão prontas para leitura.
3. Princípio da coloração: Quando utiliza-se o
violeta de metila todas as estruturas ficam coradas (Gram
positiva e Gram negativa). Em seguida, ao utilizar o
Lugol, a violeta de metila reage com esse reagente
formando um complexo chamado iodo-pararosanilina que
fixa o corante primário nas estruturas coradas. As
bactérias que têm a parede celular composta por Mureína,
durante a descoloração com o álcool-acetona ou álcool
absoluto, retém o corante. Já as bactérias com paredes
celular composta por ácidos graxos perdem o complexo
iodo-pararosanilina. O álcool absoluto extrai os lipídios,
aumentando a porosidade/permeabilidade da parede
celular das bactérias Gram-negativas. O complexo cristal
violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias
Gram-negativas são descoradas. A parede celular das
bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição,
torna-se desidratada durante o tratamento com
álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é
reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído. Ao
utilizar o corante secundário safranina, as bactérias que
perderam o corante (gram-negativo) coram-se em
vermelho/rósea. E as bactérias gram positivas
permanecem com a coloração violeta.
4. Controle de qualidade da coloração: para que
consiga alcançar o sucesso da coloração é necessário
manter o controle de qualidade da coloração. Para isso é
necessário ter em estoque bactérias de controle
Gram-positivas e Gram-negativas, com isso tem-se que
ter duas cepas bacterianas: Gram-positiva Streptococcus
pyogenes (ATCC 19615) e Gram-negativa Escherichia
coli (ATCC 25922). Inicialmente deve-se preparar uma
suspensão bacteriana: em um tubo de ensaio com
aproximadamente 2mL de solução salina, colocar uma
alçada do Streptococcus pyogenes e uma alçada da
Escherichia coli. Em seguida, preparar a lâmina com 1
gota da suspensão bacteriana adicionada centralmente. É
interessante separar 30 lâminas que deverão ser utilizadas
durante 1 mês. Essas lâminas devem ser estocadas em um
porta lâminas à temperatura ambiente. O controle de
qualidade deverá sempre ser realizado ao término da
preparação dos corantes, mesmo que seja uma simples
diluição, como no caso do Lugol. Isso tem que haver
todas as vezes que o procedimento de coloração for
realizado. Com essas lâminas, executa o método de
coloração de Gram. Examinar o microscópio utilizando a
objetiva de imersão.
Método de coloração de Gram para diagnóstico
de algumas IST
● Neisseria gonorrhoeae (diplococos
Gram-negativos)
● Leveduras
● Trichomonas vaginalis
● Haemophilus ducreyi (bacilos Gram-negativos)
Recomendações de Biosseguranças
● Uso de Equipamentos de Proteção Individual
(jaleco longo de mangas compridas, luvas
descartáveis, óculos de proteção);
● Pipetadores manuais ou automáticos;
● Protetor facial, quando necessário;
● Redobrar atenção e cuidado quando manipular
materiais biológicos (sangue, soro ou secreções)
pois esses materiais são potencialmenteinfectantes e muitas vezes estão contaminados
com agentes etiológicos diferentes do que se está
pesquisando;
● Nunca pipetar com a boca e jamais cheirar placas
de culturas;
● Evite a formação e propagação de aerossóis → A
pipetagem, centrifugação e agitação de amostras,
flambagem de alças e aberturas de frascos e
ampolas e a manipulação de seringas com material
contaminado são as principais práticas que levam
a formação e propagação de aerossóis. Esses
vapores contém micropartículas que podem ficar
em suspensão no ambiente ou propagar-se em
distância contaminando um grande número de
profissionais;
● Jamais tocar em agulhas contaminadas →
principal causa de contaminação de profissionais
de saúde pelo HIV e Hepatite B em laboratórios;
● Reduza ao máximo o manuseio de resíduos;
● Descarte todo o resíduo, em especial os
perfurocortantes, diretamente em recipientes de
paredes rígidas com tampo, contendo hipoclorito
de sódio 2%/24h. Em seguida fazer a
autoclavação dos materiais seguindo as instruções
do fabricante da autoclave. OBS: realizar
manutenção periódica da autoclave. Terminado o
processo, descarte no lixo hospitalar;
● Verificar sempre as instruções dos equipamentos
de segurança coletiva (extintor, chuveiros de
segurança, lava óleos, pia para lavagem de mãos,
caixas de areia e cabines de segurança biológicas);
● Identificar e sinalizar os principais riscos presente
no laboratório;
● Todos os equipamentos e materiais do laboratório
devem estar devidamente etiquetados. Muito
cuidado na manipulação e estocagem de
substâncias químicas. Leia com atenção as
informações contidas no rótulo de cada material
ou reagente;
● Para a descontaminação pessoal, equipamentos e
superfícies fixas utilizam desinfetantes eficientes e
adequados. Usar sempre produtos registrados no
Ministério da Saúde;
● Seja sempre consciente da importância de suas
ações na preservação da biossegurança no local de
trabalho;
● Lavar as mãos antes e depois de qualquer
procedimento laboratorial;
● Nunca comer, beber ou preparar refeições dentro
do laboratório;
● Quando estiver usando luvas, não manuseie
objetos de uso comum (telefone, maçanetas de
portas e janelas, jornais, revistas etc);
● Não guardar alimentos e bebidas em geladeiras
e/ou freezer para armazenagem de material
biológicos.