Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

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Teste de 
Sensibilidade aos 
Antimicrobianos 
(TSA) 
Profa: Jannaina Vasco
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Inibição da síntese da Parede celular:
�Beta-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas, 
carbapenêmicos e monobactâmicos);
�Beta-lactâmicos com inibidores de 
betalactamases (amoxicilina-ác.clavulânico, 
ampicilina-sulbactam);
�Glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina).
Mecanismo de ação dos Antimicrobianos
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Inibição da função da Membrana celular:
�Polimixina B e Colistina.
Mecanismo de ação dos Antimicrobianos
Proteína integral 
(porinas)
Proteína periférica 
(interior)
Bicamada 
Fosfolipídica
Glicolipídio Proteína integral 
(glicoproteína)
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Inibição da síntese de Proteínas
�Aminoglicosídeos (neomicina, canamicina, 
amicacina, gentamicina, tobramicina, 
netilmicina, estreptomicina, espectinomicina);
�Tetraciclinas;
�Cloranfenicol;
�Macrolídeos (eritromicina, azitromicina, 
claritromicina, diritromicina, roxitromicina);
�Lincomicinas (clindamicina);
�Rifampicina;
Mecanismo de ação dos Antimicrobianos
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Inibição da síntese de ácidos nucléicos
�Quinolonas (ác. nalidíxico, ác. pipemídico, 
ofloxacina, norfloxacina, ciprofloxacina, 
lomefloxacina, gatifloxacina, 
moxifloxacina, grepafloxacina);
�Metronidazol;
�Novobiocina;
Mecanismo de ação dos Antimicrobianos
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Inibição de vias metabólicas
�Sulfametoxazol-trimetoprim;
�Sulfonamidas;
�Trimetoprima.
Mecanismo de ação dos Antimicrobianos
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Mecanismo de ação dos Antimicrobianos
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Principais classes de Antimicrobianos
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Principais classes de Antimicrobianos
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ANTIBIÓTICOS 
E
TSA
� The Clinical and Laboratory 
Standards Institute (CLSI)
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QUANDO FAZER O TSA?
SENSIBILIDADE VARIÁVEL - PADRONIZAÇÃO
– ENTEROBACTÉRIAS
– ESTAFILOCOCOS
– ESTREPTOCOCOS (pneumococo, enterococo)
– BGN NÃO FERMENTADORES (Pseudomonas 
aeruginosa e Acinetobacter spp)
SENSIBILIDADE CONSTANTE
– S. pyogenes
– C. diphteriae
– T. pallidum
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SELEÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS
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Microbiologista
Infectologistas
Comissão de Infecção Hospitalar 
Comissão de Controle de Antimicrobianos
Farmacêutico hospitalar
Seleção dos antibióticos
ANTIBIOGRAMA OU TSA
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MÉTODOS
� Disco-Difusão
� Sistema automatizado
�Métodos de diluição (PESQUISA)
� Testes Complementares
– E-test 
– Pesquisa de ESBL 
– Pesquisa de Beta-lactamase
– Pesquisa de KPC
– Pesquisa de gene mecA
– Pesquisa de gene ermA
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DISCO-DIFUSÃO(KIRBY-BAUER)
Baseia-se na difusão do antibiótico do disco para o ágar, 
levando a formação de um halo de inibição, que é 
inversamente proporcional a CIM
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MÉTODOS AUTOMATIZADOS
Vitek® WalkAway®
bioMérieux™ Dade Behring ™ 
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TESTES QUANTITATIVOS
DILUIÇÃO EM CALDO
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TESTES QUANTITATIVOS
DILUIÇÃO EM ÁGAR
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Teste de 
Sensibilidade aos 
Antimicrobianos 
(TSA) 
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DISCO-DIFUSÃO(KIRBY-BAUER)
Baseia-se na difusão do antibiótico do disco para o ágar, 
levando a formação de um halo de inibição, que é 
inversamente proporcional a CIM
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DEFINIÇÃO
� Bauer e Colaboradores (1966)
� Os resultados são obtidos a partir 
das medidas dos diâmetros das zonas 
de inibição e seus valores são 
comparados a padrões definidos
� As cepas são classificadas em 
susceptíveis, intermediárias ou 
resistentes.
� Padronização: CLSI.
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Meio: Mueller-Hinton ágar (M.H.A.)
• Boa reprodutividade
• Baixa quantidade de inibidores
• Crescimento satisfátório
• Adição de Sangue
- pH - 7,2 - 7,4
- concentração de íons
- Espessura ~ 4 mm _ 60-70 ml – pl. 14 cm
25-30 ml - pl 9 cm
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Discos
• Estoque freezer não tipo “frost free”
• Uso em geladeira
• Frascos discos retirados geladeira 1 a 2 
horas antes da sua utilização
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PREPARAÇÃO DO INÓCULO
Método de Crescimento (Fase Log)
• 3 à 5 colônias isoladas
• TSB 
• 35ºC de 2 à 6 horas 
• Padronização do inóculo
(0,5 MacFarland)
Método da Suspensão da Colônia Direta
• Várias colônias
• Solução salina
• Padronização do inóculo
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Controle da Turbidez/ padrão MacFarland
• MacFarland 0,5 : 1,5 x 108 CFU/mL
0,5ml BaCl2 0,048mol/l
99,5ml H2SO4 0,18mol/l
– 625nm (0,08 a 0,10)
• Armazenar escuro
• TA
• Verificar mensal
• Agitar vigorosamente antes uso
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Inoculação
� Inoculação até 15 min após ajuste 
� Superfície do ágar não deve estar úmida
� Inoculação homogênea
� Deixar a placa semeada por 5 a 15 min a TA antes 
da aplicação dos discos 
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Aplicação dos discos
� Bateria pré determinada
� Aplicar no máximo
� 12 discos na placa de 150mm
� 5 discos na placa de 90mm
� Aplicar e pressionar o disco
� Inverter a placa e incubar em 
até 15 minutos após a aplicação 
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Incubação
�Tempo: 16 a 18 horas
Staphylococcus spp
24hs Enterococcus spp
� Temperatura 35oC
� Atmosfera atm ambiente
exceção Haemoplilus spp., 
N. gonorrhoeae e 
estreptococos
CO2
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Leitura
� Halos uniformemente circulares
� Crescimento tapete confluente
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Leitura
• Halos medidos em milimetros
– Paquímetro ou régua
– Parte de trás da placa invertida
• Muller-Hinton
– superfície escura 
– luz refletida sob a placa
• Müller-Hinton com sangue
– abrir a placa
– ler o mais próximo possível do crescimento
– luz refletida
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Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Leitura e Interpretação
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Guia para realização de TSA
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- Sensível: A infecção pode ser tratada com a dosagem
recomendada do antimicrobiano.
- Resistente: Isolados que não são inibidos pelas concentrações
usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando
um específico mecanismo de resistência é expressado.
- Intermediário: Ela permite a utilização do antimicrobiano em
infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente
concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas.
Interpretação:
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Resistências intrínsecas:
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Fontes de erros:
Meio
� Formulação do meio e pH
� Espessura do meio
� Prazo de validade ultrapassado
� Excesso de Timina e Timidina (halos indistintos - sulfas)
� Variação na concentração de Ca+2, Mg+2
Discos
� Armazenamento inadequado dos discos
� Concentração inadequada da droga no disco
Inóculo
� Inóculo fora do padrão
� Inóculo com mais de um microrganismo
� Não Eliminação do excesso de caldo do “swab”
� Demora entre a padronização do inócuo e inoculação (15 min)
� Demora na adição dos discos
� Demora na incubação da placa
Critérios inadequados para medir halos de inibição de algumas drogas
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MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
� Degradação da droga
�Alteração do sítio de 
ação
� Diminuição da 
concentração intra-celular 
do antimicrobiano: 
Porina e Bombas de 
Efluxo
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Fenótipos raros de Resistências:
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MÉTODOS
� Testes Complementares
– E-test 
– Pesquisa de ESBL 
– Pesquisa de Beta-lactamase
– Pesquisa de KPC
– Pesquisa de gene mecA
– Pesquisa de gene ermA, 
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E-Test®
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E-Test®
• O Etest® é uma fita plástica disponível comercialmente, impregnada por 
concentrações crescentes de antimicrobiano na face ventral e marcada, na 
face dorsal, com a escala das concentrações testadas a fim de facilitar a 
leitura do resultado.
Este teste baseia-se na difusão do gradiente antimicrobiano no ágar para a 
determinação da sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano 
testado. 
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• O Etest® (AB Biodisk, Solna, Suécia) é uma fita 
plástica disponível comercialmente, impregnada 
por concentrações crescentes de antimicrobiano 
na face ventral e marcada, na face dorsal, com 
a escala das concentrações testadas a fim de 
facilitar a leitura do resultado (Figura 4).
Este teste baseia-se na difusão do gradienteantimicrobiano no ágar para a determinação da 
sensibilidade da amostra bacteriana ao 
antimicrobiano testado. 
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ESBL
Teste de aproximação em 
discos de uma amostra 
de K. pneumoniae para 
confirmação do fenótipo de 
ESBL. O aumento do diâmetro 
do halo de inibição ou o 
aparecimento da zona 
fantasma, distorção do halo ao 
redor do disco β-lactâmico, 
indica a presença de uma 
amostra produtora de ESBL. 
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KPC
Amostra de K. 
pneumoniae resistente aos 
carbapenens pela produção de 
carbapenemase do tipo KPC, pelo 
método de disco difusão.Figura 
20 - K. pneumoniae produtora 
de carbapenemas
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KPC – Teste de Hodge
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gene MecA
Para predizer a resistência à oxacilina mediada pelo gene mecA deve-se testar 
a cefoxitina e reportar o resultado para oxacilina. Amostras 
de Staphylococcus spp., resistentes à oxacilina, são resistentes a todos os β-
lactâmicos independentemente dos resultados in vitro.
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gene ermA – D test
Resistência aos 
Macrolídeos: a resistência à 
eritromicina e clindamicina é 
detectada no TSA. A forma 
induzível pode apresentar 
resistência à eritromicina e 
falsa sensibilidade à 
clindamicina. 
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gene ermA – D test
Resistência aos Macrolídeos:Esses isolados devem ser relatados como 
resistentes à clindamicina, podendo-se incluir, por exemplo, o seguinte 
comentário: “Presume-se que este isolado apresenta resistência induzível à 
clindamicina, podendo haver falha terapêutica caso este antimicrobiano seja 
empregado”.
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_
praticas/modulo5/htm 
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MBLs
Bactérias produtoras de metalo-b-
lactamases (MBLs) são em grande 
parte resistentes aos betalactâmicos 
de largo espectro, incluindo oximino-
aminotiazol cefalosporinas e também 
aos carbapenens.