Ciclo de Krebs (Ciclo do ácido cítrico) - BIOQUÍMICA LEHNINGER

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Leonan José e Benhur Almeida – T5 
CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO (OU CICLO DE KREBS) – RESUMO LEHNINGER 
PRODUÇÃO DE ACETIL-COA 
O principal produto da glicólise é o piruvato, que 
é oxidado em acetil-CoA e CO2 pelo complexo da 
piruvato-desidrogenase (PDH), um grupo de 3 enzimas 
nas mitocôndrias. 
 O complexo da PDH é o protótipo para dois 
outros importantes complexos enzimáticos: a 
cetoglutarato-desidrogenase, do ciclo do ácido cítrico, e 
a-cetoácido-desidrogenase de cadeia ramificada, das 
vias de oxidação de alguns aminoácidos. 
 
O PIRUVATO É OXIDADO A ACETIL-COA E CO2 
O piruvato passa por uma descarboxilação 
oxidativa, ou seja, ele perde um CO2 e os dois carbonos 
que sobraram viram o grupo acetil da acetil-CoA. 
 
O COMPLEXO DA PIRUVATO-DESIDROGENASE REQUER 
CINCO COENZIMAS 
1. TPP – pirofosfato de tiamina 
2. FAD – dinucleotídeo de flavina-adenina 
3. CoA – coenzima A 
4. NAD – dinucleotídeo de nicotinamida-adenina 
5. Lipoato 
Essas coenzimas são derivadas de vitaminas 
hidrossolúveis que, em sua ausência, o indivíduo terá 
produção ineficiente de energia pelo ciclo de Krebs 
 
O COMPLEXO DA PIRUVATO-DESIDROGENASE 
CONSISTE EM TRÊS ENZIMAS DISTINTAS 
E1 – piruvato desidrogenase 
E2 – di-hidrolipoil-transacetilase 
E3 – di-hidrolipoil-desidrogenase 
Cada uma está presente em várias cópias. E2 tem três 
domínios funcionalmente distintos. 
→ E1 faz piruvato virar um grupo acetil 
→ E2 transfere esse grupo acetil para a coenzima A, 
formando acetil-CoA 
→ E3 coloca elétrons no FAD e no NAD 
Para que E2 funcione, ele precisa da coenzima 
Lipoato. Lipoato possui longos braços lipídicos que 
podem se movimentar entre os sítios ativos das enzimas. 
Lipoato está oxidado e vai se reduzir para que possa 
receber aquele grupo acetil produzido pela E1. O 
objetivo da E2 é transferir o grupo acetil para a coenzima 
A, formando acetil-CoA. No entanto, o lipoato continua 
reduzido, ele precisa ser reoxidado para formar um novo 
acetil e, para isso, precisa da coenzima FAD, que está 
ligado a E3. E3 transfere os elétrons do lipoato para o 
FAD, tornando-o reduzido (FADH2) e reoxidando o 
lipoato. Mas o FADH2 não pode ficar assim precisa voltar 
a ser FAD. Quem faz isso é a E3, tirando o H2 do FAD e 
passando para o NAD+, tornando-o NADH + H. Esses irão 
para a cadeia transportadora de elétrons. 
 
 
DOENÇA BERI-BERI 
Deficiência de B1 (tiamina) causa deficiência de 
TPP, causando inibição da primeira fase de 
descarboxilação do ácido pirúvico (fase em que E1 retira 
CO2 e, com a ajuda do TPP, forme acetil). 
População de risco: alto consumo de arroz branco 
(polido) sem casca, alto consumo de álcool. 
 
REAÇÕES DO CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO 
Acetil-CoA doa seu grupo acetil ao oxaloacetato 
(4C), formando o citrato (6C). O citrato é transformado 
em isocitrato (6C), o qual é desidrogenado com a perda 
de CO2 para produzir o alfa-cetoglutarato (5C). Esse 
último perde outro CO2, originando o succinato (4C), que 
sofre 4 etapas enzimáticas para se transformar 
novamente em oxaloacetato (4C) pronto para reagir com 
acetil novamente. 
 Em cada rodada do ciclo entra um grupo acetil 
(2C) na forma de acetil-CoA, e são removidas duas 
moléculas de CO2; uma molécula de oxaloacetato é 
utilizada para a formação do citrato e uma molécula de 
oxaloacetato é regenerada. Não ocorre nenhuma 
remoção líquida de oxaloacetato; teoricamente, uma 
molécula de oxaloacetato pode participar da oxidação de 
um número infinito de grupos acetil. 
 
CURIOSIDADE: Eugene Kennedy e Albert Lehninger 
mostraram em 1948 que, em eucariotos, o conjunto 
inteiro das reações do ciclo do ácido cítrico acontece na 
mitocôndria. 
 
O CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO TEM OITO ETAPAS 
1- Formação do citrato: condensação de acetil-CoA e 
oxaloacetato para a formação de citrato, catalisada 
pela citrato-sintase. 
A CoA liberada nessa reação é reciclada para participar 
da descarboxilação oxidativa de outra molécula de 
piruvato. 
 
2- Formação de isocitrato via cis-aconitato: a enzima 
aconitase transforma citrato em isocitrato, passando 
por um intermediário chamado cis-aconitato. 
A aconitase contém um centro de ferro-enxofre, que 
atua tanto na ligação do substrato ao sítio ativo quanto 
na adição ou na remoção catalítica de H2O. Ela é uma 
“moonlighting” = enzima com mais de uma função. 
 
3- Oxidação do isocitrato e alfa-cetoglutarato e CO2: 
isocitrato vira alfa-cetoglutarato por meio da enzima 
isocitrato-desidrogenase. 
Essa enzima possui manganês no sitio ativo, que interage 
com um intermediário da reação. Esse intermediário fica 
o tempo todo no sítio ativo, saindo apenas quando 
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convertido em alfa-cetoglutarato. O magnésio também 
ajuda a estabilizar o enol. 
 
4- Oxidação do alfa-cetoglutarato a succinil-CoA e 
CO2: alfa-cetoglutarato é convertido em succinil-CoA 
e CO2 pela ação do complexo da alfa-cetoglutarato-
desidrogenase. Esse complexo é análogo ao 
complexo da PDH (em estrutura e função), pois 
também possui três enzimas homólogas à E1, E2 e 
E3, também contém TPP e lipoato ligado à enzima, 
FAD, NAD e coenzima A. 
E1 do PDH – liga-se ao piruvato 
E1 do ALFA – liga-se ao alfa-cetoglutarato 
E2 de ambos – contém lipoil ligado covalentemente 
E3 de ambos – idênticos. Ambas as reações utilizam os 
cinco cofatores. 
 
5- Conversão de succinil-CoA a succinato: análogo à 
acetil-Coa, a succinil-CoA tem uma ligação tio éster, 
a qual possui grande e negativa energia livre padrão. 
O rompimento dessa ligação favorecerá a formação 
do succinil, catalisada pela succinil-CoA-sintetase. 
 
6- Oxidação do succinato a fumarato: O succinato 
formado a partir da succinil-CoA é oxidado a 
fumarato pela flavoproteína succinato-
desidrogenase. 
A enzima contém três grupos ferro-enxofre diferentes e 
uma molécula de FAD. Os elétrons do succinato passam 
pelo FAD e pelos centros de ferro-enxofre antes de 
entrarem na cadeia transportadora de elétrons e todo 
esse transito gera 1,5 molécula de ATP por par de 
elétrons. 
OBS: Malonato é inibidor competitivo do succinato e 
bloqueia o ciclo de Krebs. 
 
7- Hidratação do fumarato a malato: a hidratação 
reversível do fumarato a malato é catalisada pela 
fumarase. 
Ela é altamente estéreo especifica, pois ela catalisa a 
hidratação da ligação dupla trans do fumarato, mas não 
a dupla cis do maleto (isômero cis do fumarato). 
 
8- Oxidação do malato a oxaloacetato: a enzima L-
malato-desidrogenase ligada ao NAD catalisa a 
transformação de L-malato em oxaloacetato. 
Em condições padrão, a tendência é continuar malato 
(reação deslocada para a esquerda). Porém, nas células, 
a concentração de oxaloacetato é sempre baixa pela 
presença da citrato-sintase (enzima altamente 
exergônica do passo 1). Isso desloca a reação para a 
direita, ou seja, no sentido da formação do oxaloacetato. 
Logo, o ciclo pode se reiniciar. 
 
 
 
RESUMO: Reações do ciclo do ácido cítrico 
→ O ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs, ciclo do ácido 
tricarboxílico [TCA]) é uma via catabólica central e 
praticamente universal por meio da qual os 
compostos derivados da degradação de 
carboidratos, gorduras e proteínas são oxidados a 
CO2, com a maior parte da energia da oxidação 
temporariamente armazenada nos transportadores 
de elétrons FADH2 e NADH. Durante o metabolismo 
aeróbio, esses elétrons são transferidos ao O2, e a 
energia do fluxo de elétrons é capturada na forma de 
ATP. 
→ A acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico (na 
mitocôndria de eucariotos, no citosol em bactérias) 
quando a citrato-sintase catalisa sua condensação 
com o oxaloacetato para a formação de citrato. 
→ Em sete reações sequenciais, incluindo duas 
descarboxilações, o ciclo do ácido cítrico converte 
citrato a oxaloacetato e libera dois CO2. A via é 
cíclica, de modo que os intermediários não são 
exauridos; para cada oxaloacetato consumido na via, 
um é produzido. 
→ Para cada acetil-CoA oxidada pelo ciclo do ácido 
cítrico, o ganho de energia consiste em três 
moléculas de NADH, umade FADH2 e um 
nucleosídeo trifosfatado (ATP ou GTP). 
→ Além da acetil-CoA, qualquer composto que origine 
um intermediário do ciclo do ácido cítrico com 
quatro ou cinco carbonos – por exemplo, os 
produtos da degradação de muitos aminoácidos – 
podem ser oxidados pelo ciclo. 
→ O ciclo do ácido cítrico é anfibólico, servindo ao 
catabolismo e ao anabolismo; os intermediários do 
ciclo podem ser desviados e utilizados como material 
de partida para diversos produtos da biossíntese. 
→ Quando os intermediários são desviados do ciclo do 
ácido cítrico para outras vias, eles são repostos por 
algumas reações anapleróticas, que produzem 
intermediários de quatro carbonos por meio da 
carboxilação de compostos de três carbonos; essas 
reações são catalisadas por piruvato-carboxilase, 
PEP-carboxicinase, PEP- -carboxilase e enzima 
málica. Enzimas que catalisam carboxilações 
comumente utilizam a biotina para ativar o CO2 e 
transportá-lo a aceptores, como piruvato ou 
fosfoenolpiruvato. 
 
REGULAÇÃO DO CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO 
RESUMO: A regulação de enzimas--chave em vias 
metabólicas, por meio de efetores alostéricos e 
modificação covalente, garante a produção dos 
intermediários nas taxas necessárias para manter a 
célula em um estado de equilíbrio estável enquanto evita 
o desperdício de uma superprodução. O fluxo de átomos 
de carbono que entram no ciclo do ácido cítrico a partir 
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do piruvato, e também durante o curso do ciclo, está sob 
constante regulação em dois níveis: a conversão de 
piruvato a acetil-CoA, o material de partida do ciclo (a 
reação da piruvato-desidrogenase), e a entrada da acetil-
CoA no ciclo (a reação da citrato-sintase). A acetil-CoA 
também é produzida por outras vias que não a reação do 
complexo da PDH – a maioria das células produz acetil-
CoA pela oxidação de ácidos graxos e certos aminoácidos 
– e a disponibilidade de intermediários a partir dessas 
vias é importante para a regulação da oxidação do 
piruvato e do ciclo do ácido cítrico. O ciclo também é 
regulado nas reações da isocitrato desidrogenase e da 
alfa-cetoglutarato-desidrogenase. 
 
A PRODUÇÃO DE ACETIL-COA PELO COMPLEXO 
PIRUVATO-DESIDROGENASE É REGULADA POR 
MECANISMOS ALOSTÉRICOS E COVALENTES. 
O complexo PDH é fortemente inibido pelos 
produtos da reação que ele mesmo catalisa. O ciclo é 
barrado (por inibição alostérica) quando ácidos graxos 
de cadeia longa estão presentes. AMP, CoA e NAD+ são 
substâncias que são modificadas pelo ciclo, que se 
acumulam quando pouco acetato (produto do piruvato) 
flui para dentro do ciclo. Isso causa a ativação alostérica 
do complexo PDH. Essa enzima de ativação alostérica é 
desativada quando o combustível está disponível em 
grande quantidade (na forma de ácidos graxos e acetil-
CoA), e quando a célula possui altas concentrações de 
ATP e de NADH. Além disso, ela pode ser ativada 
novamente quando a demanda de energia está alta e a 
célula está precisando de um maior fluxo de acetil-CoA 
para o ciclo. 
 Esse mecanismo é complementado por um 
segundo nível de regulação, que causa modificação 
covalente nas proteínas, podendo ativa-las ou inativa-
las. O sitio em que isso ocorre é um sítio de serina de uma 
das subunidades da E1. O complexo de PDH é inibido 
pela fosforilação reversível desse sítio. Quem fosforila, 
ou seja, inibe PDH, é a piruvato-desidrogenase-cinase, 
alostericamente ativada pela alta concentração de ATP. 
 O complexo PDH é ativado pela fosfoproteína-
fosfatase, que, por meio da hidrólise, remove o fosfato. 
Isso ocorre em situações de baixo suprimento de 
energia, ou seja, baixa concentração de ATP. 
 
 
O CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO É REGULADO NAS TRÊS 
ETAPAS EXERGÔNICAS 
Três fatores controlam a velocidade do fluxo no 
ciclo: 1. Disponibilidade de substrato, 2. Inibição pelos 
produtos acumulados e 3. Inibição alostérica por 
retroalimentação das enzimas que catalisam as etapas 
iniciais do ciclo. 
 A velocidade da glicólise é vinculada à velocidade 
do ciclo do ácido cítrico não apenas por meio da inibição 
pelos altos níveis de ATP e NADH, mas também é 
regulada pela concentração de citrato. O citrato é o 
primeiro produto do ciclo de Krebs e é um forte inibidor 
alostérico da glicólise. 
 
A CANALIZAÇÃO DO SUBSTRATO EM COMPLEXOS 
MULTIENZIMÁTICOS PODE OCORRER DURANTE O 
CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO 
Normalmente, pensa-se que as enzimas do ciclo 
estão solúveis na matriz mitocondrial (exceção: 
succinato-desidrogenase é ligada à membrana). Porém, 
existem provas de que elas são complexos 
multienzimáticos. Esses complexos asseguram a 
passagem eficiente do produto de uma etapa para a 
etapa seguinte. Os complexos que fazem isso são 
chamados de metabolons. 
 
ALGUMAS MUTAÇÕES EM ENZIMAS DO CICLO DO 
ÁCIDO CÍTRICO LEVAM AO DESENVOLVIMENTO DE 
CÂNCER 
Quando os mecanismos de regulação são 
desequilibrados, o resultado pode ser grave. As 
mutações são raras, mas devastadoras. 
 EX: Defeitos no gene da fumarase levam a 
tumores no músculo liso (leiomas) e nos rins; mutações 
na succinato-desidrogenase levam a tumores da 
glândula suprarrenal (feocromocitomas). 
 O acúmulo de fumarato e succinato mutados 
induz a expressão do fato de transcrição induzível por 
hipóxia, HIF-1α. 
O mecanismo que leva à formação do tumor 
pode ser a geração de um estado de pseudo-hipoxia = 
pseudo-hipóxia refere-se ao aumento da razão citosólica 
de NAD livre em comparação com NADH, causada por 
hiperglicemia. 
Nas células com essas mutações, ocorre maior 
expressão dos genes normalmente regulados por HIF-1α. 
Esses efeitos das mutações nos genes da fumarase e da 
succinato-desidrogenase os definem como genes 
supressores de tumor. 
Outra conexão marcante entre os intermediários 
do ciclo do ácido cítrico e câncer é a descoberta que uma 
isocitrato-desidrogenase mutante adquire uma nova 
função. A isocitrato-desidrogenase do tipo selvagem 
catalisa a conversão de isocitrato a α-cetoglutarato, 
porém mutações que alteram o sítio de ligação do 
isocitrato levam a perda da função da atividade 
enzimática normal e ao ganho de uma nova atividade: 
conversão de a-cetoglutarato a 2-hidroxiglutarato. O 
acúmulo deste produto inibe a histona-desmetilase, 
alterando a regulação gênica e levando a tumores das 
células gliares no cérebro.