aula-pratica-10--elisa

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MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA 
DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE 
ANTICORPOS DE CAMUNDONGO ANTI-
GAMAGLOBULINA BOVINA (GGB)
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
ELISA
FASE SÓLIDA POLIESTIRENO
POLIVINILCLORETO
NYLON
IMUNOPEROXIDASE
SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES
WESTERN BLOTTING
SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU 
NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE 
ELETROFORESE
UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA 
REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA
DIRETO (ANTÍGENO)
DIRETO COM Ac CAPTURA (ANTÍGENO)
INDIRETO (ANTICORPOS)
INDIRETO COM Ac DE CAPTURA 
(ANTÍGENO E ANTICORPOS)
BLOQUEIO EM FASE LÍQUIDA
(ANTICORPOS)
COMPETITIVOS (ANTICORPOS)
ELISPOT (CÉLULAS SECRETORAS DE Ac)
Enzimas utilizadas nos EIE
PEROXIDASE
 FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO
 ALTA TAXA DE “TURNOVER”
 FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS
 ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO
 VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS
FOSFATASE ALCALINA
 PERMITE O USO DE FLUOROGÊNICOS
 MELHOR SINAL NO WESTERN BLOTTING (?)
 BETA-D-GALACTOSIDASE
 ALTA SENSIBILIDADE (?)
L L
NEGATIVOPOSITIVO
? Antígeno Fonte de proteínas 
estranhas ao sistema
Cromógeno sem corCromógeno com cor
Conjugado anti L Lavagens
ELISA DIRETO
1 2
3 3
3
1
4
POSITIVO
5
L L
1 2
LL
NEGATIVO
5
ELISA INDIRETO
Antígeno (conhecido) Fonte de proteínas 
estranhas ao sistema
Anticorpo anti
Conjugado anti
Cromógeno sem corCromógeno com cor
L Lavagens
?
?
ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA
Fonte de proteínas 
estranhas ao sistema
Cromógeno sem corCromógeno com cor
L Lavagens
Antígeno
Anticorpo anti
L L L
L
POSITIVO NEGATIVO
1
5
432
Conjugado anti
5
Material:-
1-) Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina (GGB).
2-) Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno 
citado + adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund; 
AIF – Adjuvante Incompleto de Freund) ou sem adjuvante.
3-) Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de camundongo com 
peroxidase (enzima)
4-) Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3% 
(substrato)
5-) Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)
6-) Microplacas para Elisa
7-) Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M
8-) Tampão PBS pH 7,4
9-) Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado 
Procedimento:-
1- Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição 
ideal de uso (1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato 
(1:12500). Incubar a reação over-night, em geladeira. Ao final, lavar 
as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS. (Realizado 
previamente)
2- Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 
10% em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar 
a microplaca como no item anterior. (Realizado previamente)
3- Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em 
tampão PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao 
final, lavar novamente, conforme já descrito. (Realizado previamente)
Procedimento:-
4- Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) 
preparada em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 
37ºC. Ao final, lavar novamente.
5- Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob 
proteção da luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.
6- Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos 
controles para obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.
Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação 
 Marcada com enzimático de cor 
 enzima 
 
 
 
 
 
 
 
 Lavagem Lavagem Lavagem 
Esquema da Reação de ELISA (Método Indireto)
 
Antígeno 
Anticorpo 
Substrato Enzimático 
Antiglobulina marcada com 
enzima 
S/ ADJ
SORO
Camun
dongo
Normal
1/50 1/100 1/200 1/400 1:800 1/1600 1/3200 1/12800 1/512001/6400 1/25600
81 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12
A
B
D
E
F
C
G
H
ACF
AIF
Sem 
Adjuvante
Soro Normal 
Camundongo
1/100240
H2O2 H2O+ ½ O2
PEROXIDASE OPD
OPD Oxidado - COR
e-