Metástase e Imunoistoquímica

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Neoplasias
Metástase
· Definida pela propagação de um tumor para as áreas que são fisicamente descontínuas com o tumor primário e essa característica está presente apenas em tumores malignos (benignos não tem)
· Todos os tumores malignos podem formar metástase, entretanto, alguns o fazem muito raramente (ex: glioma e carcionama basocelulares da pele). Por isso, podemos dizer que as propriedades de invasão e metástase são distintas 
· Fatores que podem aumentar a maior propabilidade de um tumor primário formar metástase: 
· Falta de diferenciação 
· Invasão local agressiva 
· Cresciemtno rápido 
· Tamanho grande
OBS: LEMBRAR QUE NÃO É REGRA (ex: lesões pequenas que crescem devagar e bem diferenciadas podem metastaziar, enquanto lesões grande, de crescimento rápido e pouco diferenciadas podem não metastaziar). Isso vai depender de fatores relacionados ao invasor e do hospedeiro 
· Canceres de sangue (leucemias e linfomas-chamados de tumores líquidos) são sempre consideradas malignas porque tem capacidade de entrar na corrente sanguínea e se deslocar para outros lugares 
· Vias de disseminação:
a) Implante direto das cavidades ou superfícies corpóreas 
Ocorre em locais onde tem um “campo aberto” natural, ou seja, sem barreiras físicas que impeçam a neoplasia maligna de penetrar 
Ex: cavidade pleural, cavidade peritoneal (mais comum nesse local), cavidade subaracnoide, cavidade pericardia, espaço articular 
Carcateristicas de carcinomas que se originam nos ovários que vai se disseminar a cavidade peritoneal 
Algumas células tumorais podem permanecer confinadas à superfície da viscera abdomina sem penetrar no parênquima 
b) Linfática 
Via mais comum para dissemminacao dos carcinomas 
Os sarcomas (tumores malignos do tecido mesenquimal) tambem podem utilizar essa rota 
c) Hematogenica 
d) Iatrogênica através de instrumentos cirúrgicos, por isso alguns lugares não se realizam biopsias de massas (ex: massas testiculares). É raro 
Imuno-histoquímica 
· (IHQ) é o método de identificação de antígenos nos tecidos, utilizando o princípio da ligação específica de anticorpos e antígenos. 
· Por isso imuno (ver a parte da imunidade-anticorpos) e histologia (analisa os tecidos microscopicamente). Por isso, para facilitar a observação, diferentes tipos de colorações podem ser utilizadas para identificar diferentes partes de um tecido.
· Utiliza anticorpos como reagentes específicos para detecção de antígenos em células ou tecidos que podem ser normais ou patológicos 
· Além disso, a imuno-histoquímica é também utilizada para identificar elementos estranhos, como vírus, fungos, bactérias etc., que possuem antígenos próprios
· Os anticorpos empregados podem ser policlonais ou monoclonais, estes produzidos em cultura de linfócitos e plasmócitos (hibridomas); algumas vezes, usa-se antissoro, ou seja, soro que contém vários anticorpos, sem purificação
OBS: Anticorpos policlonais: são anticorpos que são derivados de diferentes células B. Eles são uma mistura de moléculas de imunoglobulinas secretadas contra um antígeno específico, cada uma reconhecendo um epítopo diferente, ou seja, pode reagir com vários epítopos (menor porcao do antígeno que pode desencadear uma resposta imune) do antígeno (por exemplo, várias partes de uma proteína)
Os anticorpos utilizados para a detecção específica podem ser de dois tipos: policlonais ou monoclonais. Estes últimos normalmente são considerados mais específicos. Os anticorpos policlonais resultam de injeções de um antígeno peptídico em animais e, por conseguinte, a um estímulo de resposta imune secundária, os anticorpos são isolados a partir do soro. Deste modo, os anticorpos policlonais são uma mistura heterogênea de anticorpos capazes de reconhecer epítopos distintos.
Para que esse antígeno seja visualizado seletivamente, deve ser marcado para ser reconhecido. São usadas duas técnicas para isso:
a) Imunofluorescência 
· Utiliza subs. Fluorescentes 
OBS: Os anticorpos também podem ser classificados como reagentes primários ou secundários. Os primários são sintetizados contra um antígeno determinado e são tipicamente não-conjugados (não-marcados). Já os anticorpos secundários são sintetizados contra anticorpos primários, responsáveis por reconhecerem imunoglobulinas de uma dada espécie e são conjugados à biotina ou a uma enzima fosfatase alcalina ou uma peroxidase.
· Pode ser de forma: 
A.1) Direta
· O anticorpo primário é ligado ao um composto fluorescente, o mais usado é o isotiocianato de fluoresceína 
· Esse composto emite luz verde brilhante quando estimulado com luz ultravioleta 
A.2) Indireta
· Anticorpo primário liga-se ao antígeno de interesse. A substância fluorescente é conjugada a um anticorpo secundário, que, por sua vez, reconhece a porção Fc do anticorpo primário e com ele forma reação específica 
· A imunofluorescência indireta é mais específica, uma vez que o sinal só aparece após duas ligações antígeno-anticorpo.
b) Imunoenzimáticas 
· Com estas técnicas, o sinal resulta da formação de um composto colorido no sítio da reação, o qual é gerado por ação de uma enzima sobre um substrato apropriado
· A enzima mais utilizada é a peroxidase (é um grupo de enzima oxiredutoras), cujo substrato é H2O2
· A presença de uma substância doadora de elétrons, a reação gera um produto cromógeno que se precipita no local. São algumas substancias cromógenas utilizadas: etra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina (DAB), aminoetilcarbazol, cloronaftol
· O DAB é um dos substratos mais utilizados e confere coloração marrom-escura ao sítio da reação.
· Pode ser do tipo direto e indireto. Sendo o primeiro, a enzima é aclopada diretamente ao anticorpo primário. Já o segundo a enzima é acoplada ao anticorpo secundário 
· A técnica indireta é mais eficaz também 
Peroxidase + H2O2 → Peroxidase-H2O2 + DAB → DAB polimerizado + H2O + Peroxidase
 
· Cuidados na realização da reação imuno-histoquímica: 
· Como regra geral, os tecidos devem ser fixados rapidamente após sua remoção. A fixação pode, às vezes, destruir ou mascarar determinantes antigênicos e, assim, gerar resultados falso-negativos
OBS: Fixação é um processo químico pelo qual tecidos biológicos são preservados da decomposição ou alteração indesejada para fim de exame. Fixação elimina com qualquer reação bioquímica em andamento, e pode também aumentar a resistência mecânica ou a estabilidade dos tecidos tratados
· Outras vezes, a fixação inadequada pode alterar a morfologia ou interferir nos passos da própria reação imuno-histoquímica.
· Os epítopos de antígenos presentes em células ou tecidos podem ser alterados pelos fixadores líquidos. Por isso, deve-se empregar fixador adequado
· O formol tamponado e o fixador de Bouin são adequados para a preservação da maioria dos antígenos de interesse prático. 
· O congelamento da amostra é a maneira mais adequada de preservar antígenos
· Métodos de recuperação antigênica para cortes histológicos de amostras obtidas há muito tempo, nem sempre fixadas de maneira ideal:
· Algumas vezes, a antigenicidade pode ser melhorada por meio de pré-tratamento dos cortes com enzimas proteolíticas.
· Outras vezes, para detectar melhor certos antígenos, usam-se métodos de recuperação antigênica, como aquecimento dos tecidos em forno de micro-ondas ou em panela de pressão 
Aplicações: 
· A IHQ é indicada para as mais distintas pesquisas em um laboratório de patologia clínica, dentre elas:
· Diferenciação entre proliferação celular benigna e maligna;
· Identificação do tecido de origem de uma neoplasia morfologicamente indiferenciada;
· Apontar o órgão de origem de uma neoplasia diferenciada;
· Subtipagens de neoplasias (como no caso de linfoma);
· Pesquisa de fatores prognóstico, terapêutico e índices proliferativos de determinada neoplasia;
· Elucidação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células;
· Detecção de células neoplásicas metastáticas